JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Эта рукопись описывает стандартные протоколы для измерения Тау hyperphosphorylation, измерения Тау привязки микротрубочек и локализация внутриклеточных Тау, после медикаментозного лечения. Эти протоколы могут использоваться многократно для скрининга наркотиков или других соединений, которые нацелены Тау hyperphosphorylation или микротрубочек привязки.

Аннотация

Микротрубочки связанные белка Тау — нейронов белок, локализуется преимущественно в аксонов. Как правило Тау имеет важное значение для нормального функционирования нейронов, потому что он участвует в Ассамблее микротрубочек и стабилизации. Кроме того, нейроны Тау выражается в груди человека и предстательной железы, желудка, толстой кишки, поджелудочной железы, где он показывает почти аналогичные структуры и оказывает аналогичные функции как нейрональных Тау. Количество Тау и его фосфорилирование может изменить свою функцию как стабилизатор микротрубочек и привести к развитию парных винтовой нитей в различных нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера. Определение состояния фосфорилирование Тау и его характеристики микротрубочек привязки имеет важное значение. Кроме того изучение внутриклеточной локализации Тау имеет важное значение в различных заболеваний. Эта рукопись детали стандартные протоколы для измерения Тау фосфорилирования и Тау связывание микротрубочек в клетках рака прямой кишки с или без куркумин и LiCl лечения. Эти процедуры может использоваться для остановки распространения раковых клеток и развитию. Внутриклеточной локализации Тау проверяется с помощью иммуногистохимии и конфокальная микроскопия при использовании низкого количества антител. Эти анализы могут использоваться многократно для проверки соединений, которые влияют на hyperphosphorylation Тау или привязки микротрубочек. Роман терапии используется для различных tauopathies или потенциально связанные противоопухолевых агентов можно охарактеризовать с помощью этих протоколов.

Введение

Тау первоначально была определена как тепло stable микротрубочек связанный белок, который был совместной очищенную с тубулин1. Тау исключительно выражается в высших эукариот2,3,4. Основная функция Тау является контроль микротрубочек Ассамблея1,5,6. Он также способствует полимеризации микротрубочек7, аксональное транспорта8, изменения в аксональное диаметр9, формирование Неврома полярности, и нейродегенеративные10. Тау также действует как белка лески для управления некоторые сигнальные пути. Исследования мозга крысы предположить что Тау нейрон конкретной и что он локализуется преимущественно в аксоны11. Потому что Тау имеет важное значение для полимеризации микротрубочек и развития нервной системы, Тау был предположить, чтобы играть важную роль в аксональное развития центральной нервной системы; Эта гипотеза была позднее подтверждена экспериментах in vitro и in vivo . В дополнение к нейронов Тау выражается в различных не нейрональных клеток, включая печень, почки и мышечные клетки12,13. Тау выражается также в груди человека, простаты, толстой кишки, желудка и рака поджелудочной железы клетки линии и тканей14,15,16,17,18, 19. Тау встречается также в миозит включение тело как витой tubulofilaments включения органов20.

Тау могут нести несколько столб-поступательные изменения. Из всех столб-поступательные изменения фосфорилирование является наиболее распространенным. Увеличение Тау фосфорилирование уменьшается его сродство для микротрубочек, наконец дестабилизации цитоскелета. Восемьдесят пять фосфорилирование сайты были описаны в белка Тау, изолированных от тканей мозга человека болезни Альцгеймера. Из этих сайтов 53% составляют Серин, треонин 41% и только 6% тирозин остатков21,22,23. Тау фосфорилирование влияет на его локализации, функции, привязки, растворимость и его восприимчивости к другой столб-поступательные изменения. Также Тау фосфорилирование более чем нормальной степени (или полностью насыщенных с фосфатными группами) известен как hyperphosphorylation, которая реплицирует структурные и функциональные характеристики болезни Альцгеймера24. Тау поддерживает надлежащее функционирование аксональное микротрубочек и обеспечивает нормальное функционирование нейронов в физиологических условиях. Однако hyperphosphorylated Тау не поддерживать привязку хорошо организованной микротрубочек, гибели нейронов вследствие микротрубочек разборки. Нормальные уровни Тау фосфорилирование необходимы для надлежащего функционирования Тау, но Тау не может нормально функционировать, если его характерные фосфорилирование уровень изменяется, и если это hyperphosphorylated25. В болезни Альцгеймера и некоторые другие связанные с возрастом нейродегенеративных расстройств Тау становится hyperphosphorylated и образует парные спиральные нити и нейрофибриллярных клубков26,27. Таким образом важное значение имеют методы определения Тау фосфорилирования и микротрубочек привязки.

Колоректальный рак, старение связанных, является третьим наиболее часто диагноз рака и третий выдающийся причиной смерти для мужчин и женщин28. Колоректальный рак является одной из главной причиной смерти рака в западном мире29. Потому что колоректального рака и болезни Альцгеймера, связанные со старением, и оба происходят главным образом в развитых странах, где люди наслаждаются аналогичные пищевые привычки, двух заболеваний могут быть каким-то образом связаны. Кроме того Тау позитивных и негативных Тау раковые клетки реагируют по-разному химиотерапевтических агентов, например, паклитаксел16.

Куркумин является одним из основных производных Куркума longa, индийские специи куркумы30. На протяжении веков Южной Азии населения потребляли куркумы в их диетпитаниях на ежедневной основе. Куркумин используется для лечения различных заболеваний, включая колоректальный рак, болезнь Альцгеймера, диабет, кистозный фиброз, воспалительные заболевания кишечника, артрит, гиперлипидемия, атеросклероз и ишемическая болезнь сердца31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. лития может также убить колоректальные раковые клетки или предотвращения их распространения39. Лития может также использоваться для лечения болезни Альцгеймера40 , как он уменьшает Тау агрегации и предотвращает его hyperphosphorylation, как отмечено в трансгенные мыши модель41,,4243, 44.

Эта рукопись направлена на: 1) измеряют всего Тау и уровни выражения фосфо Тау в очищенной ячейки; 2) описывают фосфатазы пробирного для измерения общей Тау фосфорилирования; 3) изучить микротрубочек привязки Тау; и 4) локализовать Тау, confocal микроскопии в клеточных линиях колоректального рака лечение куркумин или LiCl. Результаты показывают, что клеток лечение с куркумин, который якобы хорошего химиотерапевтического агента для рака толстой кишки, и лечение с LiCl может уменьшить выражение как общая Тау и фосфорилированных Тау в colorectal рак клеточных линий. Эти процедуры могут также вызвать ядерный транслокации Тау. Однако неожиданно, куркумин не улучшить связывание Тау микротрубочек.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка реагентов

  1. Добавить 10 мкл (1 мм) phenylmethylsulfonyl фторида раствор, 10 мкл (1 x из 100 x запасов) ингибитор протеазы коктейль решения и 10 мкл (1 x из 100 x запасов) фосфатазы ингибитор коктейль решение по 1 мл 1 x radioimmunoprecipitation проба (RIPA) буфера подготовить полный буфера lysis RIPA.
  2. Подготовка 10 x буфер буфера (PEM) общего тубулина.
    1. Добавить 800 мм (6.0474 g) пиперазина N-N ' - бис - 2-ethanesulfonic кислота, 10 мм (95,1 мг) этиленгликоль bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N ', N '-tetraacetic кислота, MgCl 10 мм (51 мг) 2 и 1,25 М (3 мл 10 м) NaOH в 50-мл трубку , смешать с 15 мл дистиллированной воды и распустить с помощью вихря. Проверьте рН (должно быть 6.9). Если рН > 6.9, сбросить буфер и переделать много свежих.
      Примечание: NaOH должна быть ниже 1,25 М для обеспечения что рН не выброс 6,9. Не рекомендуется использовать HCl для регулировки рН > 6.9.
    2. Добавление NaOH каплям до рН 6,9. Добавьте дистиллированной воды, чтобы сделать до 25 мл 10 X PEM буфера. Наконец фильтр, с помощью шприца и 0,2 мкм фильтром шприц. Разделите этот буфер на аликвоты в 1,5 мл пробирок и хранить при 4 ° C.
  3. Подготовка 5 x буфер образца с восстанавливающего агента и краситель.
    1. Смесь 300 мкл (60 мм) 1 М трис-HCl (рН 6,8), 2,5 мл (25%), 50% глицерина, 1 мл (2%), лаурилсульфат натрия 10% (СДП) и 1,2 мл дистиллированной воды составляют 5 мл 5 x буфер образца SDS. Хранить в − 20 ° с.
      Примечание: Потому что глицерин вязкой, измерения 1,25 мл глицерина сложно. 1 мл 100% глицерина весит 1.26 g. Таким образом, весят 1.575 g 100% глицерина (что составляет 1,25 мл 100% или 2,5 мл 50% глицерина) в 15 мл трубки; хорошо перемешать с другими компонентами.

2. Клетки культуры, лечение с куркумин или LiCl лечение и обследование выражения протеина

  1. Добавить ~ 1 х 10 6 HCT 116 клеток в 100 мм культуры ткани блюд, содержащих минимум основных СМИ (MEM) с 10% плода говядину сыворотка (ФБС) и 1% пенициллин стрептомицином. После одного дня культивирования клеток достигнет 60-70% впадения.
    Примечание: Количество пластин необходимо зависит количество процедур, описанных ниже.
  2. Когда клетки достичь слияния ~ 65% (аппроксимировать с помощью микроскопии), удалите MEM дополнено средней и добавить сыворотки свободный MEM с 5 мкм, 10 мкм, 30 мкм куркумин или 25 мм, 50 мм и 100 мм LiCl. Инкубировать при 37 ° C в течение 24 часов в атмосфере увлажненные, содержащих 5% CO 2.
  3. 24 ч после лечения, вымыть клетки с 1 мл ледяной фосфат амортизированное saline (PBS) и скрип клетки, клетки скребком. Передача царапины клетки в 1,5 мл центрифуга трубы и центрифуги для 4 мин, при 1800 x g при 4 ° C для получения клеток гранулы.
  4. Лизируйте клетки, приостановив гранулы в 100 мкл полный буфер RIPA на 4 ° C в течение 20 минут во время регулярно выстукивать трубы. Sonicate образцы кратко.
  5. Центрифуга гомогенатах клеток в настольная центрифуга на 22,570 x g 20 мин на 4 ° C. передать другие обозначенные трубки с помощью пипетки supernatants.
  6. Измерения концентрации белка в supernatants Брэдфорд пробирного 45 с использованием коммерческих assay протеина наборы.
  7. Подготовка образцов равных белка концентрации (10 мкг белка/13 мкл пример) lysates клетки с 4 X SDS гель загрузки буфера. Подготовлено 4 x SDS гель загрузки буфера свежие, содержащие 400 мм Дитиотреитол (ДТТ).
    Примечание: На данном этапе образцы могут храниться в − 20 ° C в случае необходимости.
  8. Инкубировать образцы на блоке тепла при 100 ° C за 5 мин Mix образцы с помощью вихря и ждать, чтобы охладить их на ~ 10-15 мин
  9. Сборка системы электрофореза.
    1. Нагрузки 10 мкг белка (13 мкл пример) также на 10% геле полиакриламида SDS для электрофореза (SDS-PAGE). Загрузить молекулярный вес лестница на гель до одной полосы.
      Примечание: Как электрофорез начинает, белок лестница будет разрешить в белок полос очевидно молекулярным весом. Использовать эти диапазоны для оценки молекулярным весом полос неизвестный белок.
    2. После загрузки образцов, подключите положительные и отрицательные электроды электрофореза системы к источнику питания для поддержания постоянного напряжения. Первоначально начинаются 70 V для 20 минут переместить образцы протеина от штабелируя гель в разрешая гель. Затем увеличить напряжение 125 V для примерно 70-120 мин до конца геля образцов и белка лестница.
    3. После окончания электрофореза, передачи гель винилидена мембраны фторид (PVDF), с помощью системы мокрой electroblotting. Передачи для ~ 100 мин 100 V. блок мембрану в блокирующем буфере 4% бычьим сывороточным альбумином (БСА) 90 мин при комнатной температуре около 25 ° с.
  10. Марк помаркой, резки его на стороне с молекулярным весом лестница. Используйте прозрачный пластиковый лист и резким резак для резки блот. Подготовить решения первичного антитела (анти Тау 1:5, 000; анти фосфо Тау 1:4, 000) и инкубировать пятно в этом растворе на 4 ° C на ночь и.
  11. После ночи инкубации, стирать пятно для 7 мин четыре раза в растворе фосфат амортизированное saline-Tween-20 (PBST).
  12. Подготовить соответствующие решения средних антитела (коза анти кролика или анти мыши IgG 1:5, 000), и инкубировать пятно в этом решении 90 мин при комнатной температуре около 25 ° C. мыть в PBST четыре раза, 7 мин и.
  13. Разработка пятно с помощью хемилюминесценции kit по заявлению производителя ' s рекомендации. Обложка пятно с помощью прозрачной полиэтиленовой пленкой. Получение изображений, хемилюминесценция Система для хемилюминесценции с соответствующим программным обеспечением.

3. Фосфатаза Assay

  1. лечения lysates клетки (с шагом 2.5) с щелочной фосфатазы в буфере щелочной фосфатазы.
    1. Для обеих управления и обработанные образцы, подготовить 20 мкл образцы содержащие 20 мкг общего белка. Добавьте тома lysates клетки, содержащий 20 мкг общего белка, а затем 2 мкл буфера щелочной фосфатазы и 10 мкл щелочной фосфатазы. Долейте дестилированную воду составляют 20 мкл.
  2. Проинкубируйте образцы при 37 ° C, за 1 ч. остановить реакции путем добавления Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) в конечной концентрации 50 мм, или путем добавления Ортованадат натрия (Na 3 VO 4) в конечной концентрации 10 мм. Реакция также может быть прекращено путем нагрева при 75 ° C за 5 мин
  3. До окончания инкубации проб с фосфатазы, подготовить образцы такой же концентрации без добавления фосфатазы для сравнения с образцами лечение фосфатазы.
  4. Добавить свежеприготовленные 4 X SDS гель загрузки буфер, содержащий 400 мм DTT.
  5. Проинкубируйте образцы на блоке тепла при 100 ° C за 5 минут смеси образцы с помощью вихря. Прохладный при комнатной температуре на ~ 10-15 мин
  6. Собрать систему электрофореза запустив 10% гель полиакриламида SDS-PAGE.
    1. Нагрузки 10 мкг белка (13 мкл пример) на колодец на 10% polyacrylamide гель. Загрузить по лестнице молекулярным весом.
    2. После загрузки образца, подключите положительные и отрицательные электроды электрофореза системы к источнику питания для поддержания постоянного напряжения. Первоначально начинаются 70 V для 20 минут переместить образцы протеина от штабелируя гель в разрешая гель. Затем увеличить напряжение 125 V и Побегите гель для примерно 70-120 мин до конца геля образцов и белка лестница.
    3. После окончания электрофореза, передачи геля на PVDF мембрану с помощью системы мокрой electroblotting. Передачи для ~ 100 мин 100 V.
    4. Марк помаркой, сделав небольшой разрез на стороне лестницы молекулярного веса. Использовать прозрачный пластиковый лист и резким резак для резки блот.
  7. Блокировать мембрану в 4% BSA блокирующем буфере 90 мин при комнатной температуре.
  8. Инкубировать пятно в раствор (анти Тау 1:5, 000) начальной антител при температуре 4 ° C на ночь. Промойте пятно в PBST четыре раза, за 7 мин.
  9. Подготовить соответствующие решения средних антитела (мыши IgG коза анти 1:5, 000) и инкубировать помарку для 90 минут при комнатной температуре. Стирать в PBST четыре раза, за 7 мин.
  10. Разработка пятно с помощью хемилюминесценции kit по заявлению производителя ' s рекомендации. Обложка пятно в прозрачной полиэтиленовой пленкой. Получение изображений, хемилюминесценция Система для хемилюминесценции с соответствующим программным обеспечением.

4. Микротрубочки привязки Assay

  1. для привязки assay микротрубочек, повторите пункты 2.1-2.6.
  2. Подготовка 1 X (2 мл) PEM буфер из 10 X PEM буфера хранятся при температуре 4 ° C, добавив 20 мкм паклитаксел (40 мкл) и 1 мм (20 мкл) GTP. (MT) подвести микротрубочек из − морозильник 80 ° C и E. coli Тау рабочий запас от − морозильник 20 ° С.
  3. Подготовка образцов в соответствии с табл.1.
  4. Инкубации при 37 ° C для ультрацентрифуга 30 мин при 25 ° C для 60 мин на 100,000 x г.
  5. Передачи 120 мкл supernatants содержащие несвязанные Тау, чтобы очистить и помечены трубы.
  6. Добавить 120 мкл (же объем как супернатант) 5 X образец буфер гранулы, содержащие связанные Тау и тщательно перемешать. Передача решения для очистки помечены трубы и тщательно перемешать.
  7. Измерения концентрации белка (см. шаг 2.6).
    Примечание: При подготовке проб, используйте объем раствора (шаг 4.6) для подготовки супернатант и пеллет образцы.
  8. Подготовить образцы концентрацию эквивалента белка и добавить свежеприготовленные 4 x SDS гель загрузки буфер, содержащий DTT (400 мм).
    Примечание: Образцы можно хранить при − 20 ° C на этом этапе.
  9. Повторите шаги 3,5-3.10.
< td colspan =» 2">
образец имени микротрубочки необходимо главных белка необходимо PEM-GTP-PTX
1 2 мкл HCT 116-контроль (6,21 мкг/мкл) 9.66 мкл (60 мкг) 108.34 мкл
2 HCT 116-куркумин 10 мкм (4.81 мкг/мкл) 2 мкл 16.63 мкл (80 мкг) 101.37 мкл
3 HCT 116-куркумин 20 мкм (3.28 мкг/мкл) 2 мкл 30.49 мкл (100 мкг) 87.51 мкл
4 HCT 116-LiCl 25 мм (5.43 мкг/мкл) 2 мкл 18.42 мкл (100 мкг) 99.58 мкл
5 E. coli Тау 2 мкл 1 мкл Тау-352 117 мкл
6 MT только 2 мкл X 118 мкл
120 мкл

Таблица 1: Пробоподготовка для привязки микротрубочек assay.

5. Локализация и выражение Тау после лечения клетки с куркумин

  1. чистый coverslip с помощью 70% этанола и высушить его с помощью лабораторных тканей. Вставьте одну coverslip в каждой скважине плиты обозначенные 6-ну культуры ткани. Место пластину на биологической безопасности кабинета и переключиться на УФ-излучения для по крайней мере 3-х.
  2. Субкультура клетки и семян их в соответствующие скважины пластину 6-Ну 2,5 x 10 5 клеток/колодец в рекомендуемых культуры среднего.
  3. После ~ 24 h, изучить клетки с помощью инвертированного микроскопа с помощью 10 X и 40 X целей для проверки сотовой морфологических изменений. Запись фотографий, в случае необходимости.
  4. Промывать ячейки, дважды с помощью PBS. Исправить ячейки 3,7% формальдегида в инкубаторе 37 ° C в темноте.
    Примечание: Фиксация, формальдегида при комнатной температуре работает хорошо, слишком. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты при обращении с формальдегидом.
  5. Мыть ячейки в PBS. Исправить клетки в ледяной метанола в − 20 ° C на 15 мин разрушения клеток путем инкубации их в BSA 3% и 0,1% тритон X-100 в PBS на льду на 10 мин вымыть клетки с PBS.
  6. Инкубации клеток в блокирующем буфере (BSA 3% и 0,1% Tween-20 в растворе PBS) за 1 ч при комнатной температуре.
    Примечание: Инкубационный втечение 2 ч при температуре 4 ° C работает хорошо, слишком.
  7. Подготовить раствор начальной антител (анти Тау на 1: 200) BSA 3% и 0,1% Tween-20 в PBS (например, 2 мкл антител Тау-13 в 0,4 мл буфера).
  8. Вырезать кусочки PVDF мембраны так, чтобы куски подходят правильно в каждой скважине 6-ну плиты; замочить их в воде в течение 5 минут место разреза PVDF в каждой скважине.
  9. Добавить 60 мкл раствора первичного антитела в разрез PVDF штук в каждой скважине. Место coverslips, таким образом, что клетки могут коснуться раствор начальной антител. Инкубируйте на 4 ° C в темных, влажных камеру на ночь. Стирать в PBS в четыре раза.
  10. Подготовить раствор средней антител (конъюгированных флуоресцеин 594 анти мыши IgG в 1: 400) BSA 3% и 0,1% Tween-20 в PBS.
  11. Вырезать кусочки PVDF мембрану, так что куски должным образом вписываются в каждой скважине пластину 6-Ну и замочить их в воде на 5 мин место разреза PVDF в каждой скважине.
  12. Добавить 80 мкл раствора средней антитела для каждой из частей PVDF в пластину 6-Ну. Место coverslip, таким образом, что клетки могут коснуться раствор средней антител. Инкубировать в темных, влажных камере при комнатной температуре на 2 ч. мыть с PBS в четыре раза.
  13. Установить образцы в средстве крепления с 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) и исправление coverslips на стеклянных вставках.
    1. Добавить одно падение монтажа среды с DAPI на стеклянных вставках. Удалить coverslips из каждой скважины и разместить их на стеклянных вставках, содержащий средство монтажа с DAPI. Обеспечить на поверхности каждого coverslip, содержащие окрашенных клеток затрагивает МунТинг среднего на соответствующий стеклянное скольжение.
    2. Применить Лак для ногтей все вокруг каждого coverslip уплотнение и исправить их герметичной на стеклянных вставках. При необходимости, сделать этот шаг дважды.
  14. Инкубировать на 1,5 ч при комнатной температуре в темной камере.
  15. Изучить слайды с помощью конфокального микроскопа с помощью погружения нефти на coverslip в темной комнате.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Выражение всего Тау и фосфо Тау был рассмотрен после лечения клетки с различной концентрации куркумин или LiCl (рис. 1). Лечение клеток с трех различных концентрации куркумин снизились уровни выражения Тау; фосфо Тау выражение увеличилось после лечения с ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Эта рукопись учредил различные процедурные условия для обнаружения всего Тау и фосфорилированных Тау в клетках колоректального рака, обработанных с куркумин и LiCl. Чтобы оценить общее состояние фосфорилирование Тау в образцы протеина, фосфатазы пробирного был описан. Этот assay потенциа...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Это исследование было выполнено как частью проекта под названием «Развитие и индустриализации высокое значение косметического сырья из морских водорослей», финансируемого министерством океанов и рыболовства, Корея и была поддержана интрамуральных Грант (2Z04930) от института Каннын в KIST натуральных продуктов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
HCT 116 cellATCCCCL-247
MEM (EBSS)HycloneSH30024.01
Fetal Bovine Serum (FBS)ThermoFisher (Gibco)16000044Store at -20 °C
penicillin-streptomycinHycloneSV30010
Trypsin-EDTA solutionWelGeneLS 015-01
100 mm dishCorning430161
6 well plateCorningCoster 3516
Anti-Tau 13 antibodyabcamab19030
Dithiothreitol (DTT)Roche10 708 984 001Storage Temperature 2–8 °C
Microlitre CentrifugesHettich ZentrifugenMIKRO 200 R
PaclitaxelSigma-AldrichT1912Storage Temperature 2–8 °C
CurcuminSigma-Aldrich (Fluka)78246Storage Temperature 2–8 °C
Microtubules (MT)CytoskeletonMT001Store at 4 °C (desiccated)
Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200Store at 4 °C in the dark
Sodium hydroxideSigma72068
Magnesium ChlorideSigma-AldrichM2670
GTPSigma-AldrichG8877Store at -20 °C
DPBSWelGeneLB 001-02
Sonic DismembratorFisher ScientificModel 500
UltracentrifugeBeckman CoulterOptima L-100 XP
PIPESSigmaP1851
Bovine serum Albumin (BSA)SigmaA7906
Molecular ImagerBio-RadChemiDoc XRS+Store at 4 °C
Protein assay dye reagentBio-Rad500-0006
α-tubulin (11H10) Rabbit mAbCell signalling2125
GAPDH (14C10) Rabbit mAbCell signalling2118
Anti-Tau (phospho S396) antibodyabcamab109390
EGTASigmaE3889Store at room temperature
FastAP Thermosensitive Alkaline PhosphataseThermo ScientificEF0651Store at -20 °C
PMSFSigmaP7626Store at room temperature
Phosphatase Inhibitor CocktailCell Signalling5870Store at 4 °C
Protease Inhibitor CocktailCell Signalling5871Store at 4 °C
RIPA BufferSigmaR 0278Storage Temperature 2–8 °C
Tau-352 humanSigmaT 9950Store at -20 °C
Triton X-100 Sigma-AldrichX - 100Store at around 25 °C
PVDF membraneBio-Rad162-0177
Goat anti-mouse IgG Secondary AntibodyThermoFisherA-11005Store at 4 °C in the dark
Confocal MicroscopyLeica MicrosystemLeica TCS SP5
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Affymetrix75819
Protein AssayBio-Rad500-0006Store at 4 °C

Ссылки

  1. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1858-1862 (1975).
  2. Cambiazo, V., Gonzalez, M., Maccioni, R. B. DMAP-85: a tau-like protein from Drosophila melanogaster larvae. J Neurochem. 64, 1288-1297 (1995).
  3. Goedert, M., et al. PTL-1, a microtubule-associated protein with tau-like repeats from the nematode Caenorhabditis elegans. J Cell Sci. 109 (Pt 11), 2661-2672 (1996).
  4. Goedert, M., Spillantini, M. G., Jakes, R., Rutherford, D., Crowther, R. A. Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease. Neuron. 3, 519-526 (1989).
  5. Cleveland, D. W., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. Purification of tau, a microtubule-associated protein that induces assembly of microtubules from purified tubulin. J Mol Biol. 116, 207-225 (1977).
  6. Fellous, A., Francon, J., Lennon, A. M., Nunez, J. Microtubule assembly in vitro. Purification of assembly-promoting factors. Eur J Biochem. 78, 167-174 (1977).
  7. Witman, G. B., Cleveland, D. W., Weingarten, M. D., Kirschner, M. W. Tubulin requires tau for growth onto microtubule initiating sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 73, 4070-4074 (1976).
  8. Dixit, R., Ross, J. L., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. Differential regulation of dynein and kinesin motor proteins by tau. Science. 319, 1086-1089 (2008).
  9. Harada, A., et al. Altered microtubule organization in small-calibre axons of mice lacking tau protein. Nature. 369, 488-491 (1994).
  10. Caceres, A., Kosik, K. S. Inhibition of neurite polarity by tau antisense oligonucleotides in primary cerebellar neurons. Nature. 343, 461-463 (1990).
  11. Binder, L. I., Frankfurter, A., Rebhun, L. I. The distribution of tau in the mammalian central nervous system. J Cell Biol. 101, 1371-1378 (1985).
  12. Gu, Y. J., Oyama, F., Ihara, Y. tau is widely expressed in rat tissues. J Neurochem. 67, 1235-1244 (1996).
  13. Kenner, L., et al. Expression of three- and four-repeat tau isoforms in mouse liver. Hepatology. 20, 1086-1089 (1994).
  14. Souter, S., Lee, G. Microtubule-associated protein tau in human prostate cancer cells: isoforms, phosphorylation, and interactions. J Cell Biochem. 108, 555-564 (2009).
  15. Sangrajrang, S., et al. Estramustine resistance correlates with tau over-expression in human prostatic carcinoma cells. Int J Cancer. 77, 626-631 (1998).
  16. Rouzier, R., et al. Microtubule-associated protein tau: a marker of paclitaxel sensitivity in breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8315-8320 (2005).
  17. Mimori, K., et al. Reduced tau expression in gastric cancer can identify candidates for successful paclitaxel treatment. Brit J Cancer. 94, 1894-1897 (2006).
  18. Jimeno, A., et al. Development of two novel benzoylphenylurea sulfur analogues and evidence that the microtubule-associated protein tau is predictive of their activity in pancreatic cancer. Mol Cancer Ther. 6, 1509-1516 (2007).
  19. Huda, M. N., Kim, D. H., Erdene-Ochir, E., Kim, Y. S., Pan, C. H. Expression, phosphorylation, localization, and microtubule binding of tau in colorectal cell lines. Appl Biol Chem. 59, 807-812 (2016).
  20. Askanas, V., Engel, W. K., Bilak, M., Alvarez, R. B., Selkoe, D. J. Twisted tubulofilaments of inclusion body myositis muscle resemble paired helical filaments of Alzheimer brain and contain hyperphosphorylated tau. The American journal of pathology. 144, 177-187 (1994).
  21. Buee, L., Bussiere, T., Buee-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res Brain Res Rev. 33, 95-130 (2000).
  22. Hanger, D. P., Anderton, B. H., Noble, W. Tau phosphorylation: the therapeutic challenge for neurodegenerative disease. Trends Mol Med. 15, 112-119 (2009).
  23. Sergeant, N., et al. Biochemistry of Tau in Alzheimer's disease and related neurological disorders. Expert Rev Proteomics. 5, 207-224 (2008).
  24. Fath, T., Eidenmuller, J., Brandt, R. Tau-mediated cytotoxicity in a pseudohyperphosphorylation model of Alzheimer's disease. J Neurosci. 22, 9733-9741 (2002).
  25. Kolarova, M., Garcia-Sierra, F., Bartos, A., Ricny, J., Ripova, D. Structure and pathology of tau protein in Alzheimer disease. Int J Alzheimers Dis. 2012, 731526(2012).
  26. Kosik, K. S., Joachim, C. L., Selkoe, D. J. Microtubule-associated protein tau (tau) is a major antigenic component of paired helical filaments in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4044-4048 (1986).
  27. Wood, J. G., Mirra, S. S., Pollock, N. J., Binder, L. I. Neurofibrillary tangles of Alzheimer disease share antigenic determinants with the axonal microtubule-associated protein tau (tau). Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4040-4043 (1986).
  28. American Cancer Society. Colorectal Cancer Facts, Figures 2011-2013. , Available from: http://www.cancer.org/acs/groups/content/@epidemiologysurveilance/documents/document/acspc-028312.pdf (2016).
  29. Jemal, A., et al. Cancer statistics, 2003. CA Cancer J Clin. 53, 5-26 (2003).
  30. Patel, V. B., Misra, S., Patel, B. B., Majumdar, A. P. Colorectal cancer: chemopreventive role of curcumin and resveratrol. Nutr Cancer. 62, 958-967 (2010).
  31. Lim, G. P., et al. The curry spice curcumin reduces oxidative damage and amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse. J Neurosci. 21, 8370-8377 (2001).
  32. Venkatesan, N. Curcumin attenuation of acute adriamycin myocardial toxicity in rats. Br J Pharmacol. 124, 425-427 (1998).
  33. Srinivasan, M. Effect of curcumin on blood sugar as seen in a diabetic subject. Indian J Med Sci. 26, 269-270 (1972).
  34. Deodhar, S. D., Sethi, R., Srimal, R. C. Preliminary study on antirheumatic activity of curcumin (diferuloyl methane). Indian J Med Res. 71, 632-634 (1980).
  35. Rao, C. V., Rivenson, A., Simi, B., Reddy, B. S. Chemoprevention of colon carcinogenesis by dietary curcumin, a naturally occurring plant phenolic compound. Cancer Res. 55, 259-266 (1995).
  36. Araujo, C. C., Leon, L. L. Biological activities of Curcuma longa L. Mem Inst Oswaldo Cruz. 96, 723-728 (2001).
  37. Lim, T. G., et al. Curcumin suppresses proliferation of colon cancer cells by targeting CDK2. Cancer Prev Res (Phila). 7, 466-474 (2014).
  38. Ringman, J. M., Frautschy, S. A., Cole, G. M., Masterman, D. L., Cummings, J. L. A potential role of the curry spice curcumin in Alzheimer's disease. Curr Alzheimer Res. 2, 131-136 (2005).
  39. Li, H., et al. Lithium chloride suppresses colorectal cancer cell survival and proliferation through ROS/GSK-3beta/NF-kappaB signaling pathway. Oxid Med Cell Longev. , 241864(2014).
  40. Forlenza, O. V., De-Paula, V. J., Diniz, B. S. Neuroprotective effects of lithium: implications for the treatment of Alzheimer's disease and related neurodegenerative disorders. ACS Chem Neurosci. 5, 443-450 (2014).
  41. Noble, W., et al. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by lithium correlates with reduced tauopathy and degeneration in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6990-6995 (2005).
  42. Perez, M., Hernandez, F., Lim, F., Diaz-Nido, J., Avila, J. Chronic lithium treatment decreases mutant tau protein aggregation in a transgenic mouse model. J Alzheimers Dis. 5, 301-308 (2003).
  43. Engel, T., Goni-Oliver, P., Lucas, J. J., Avila, J., Hernandez, F. Chronic lithium administration to FTDP-17 tau and GSK-3beta overexpressing mice prevents tau hyperphosphorylation and neurofibrillary tangle formation, but pre-formed neurofibrillary tangles do not revert. J Neurochem. 99, 1445-1455 (2006).
  44. Caccamo, A., Oddo, S., Tran, L. X., LaFerla, F. M. Lithium reduces tau phosphorylation but not A beta or working memory deficits in a transgenic model with both plaques and tangles. Am J Pathol. 170, 1669-1675 (2007).
  45. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  46. Gupta, K. K., Bharne, S. S., Rathinasamy, K., Naik, N. R., Panda, D. Dietary antioxidant curcumin inhibits microtubule assembly through tubulin binding. FEBS J. 273, 5320-5332 (2006).
  47. Lee, J. W., Park, S., Kim, S. Y., Um, S. H., Moon, E. Y. Curcumin hampers the antitumor effect of vinblastine via the inhibition of microtubule dynamics and mitochondrial membrane potential in HeLa cervical cancer cells. Phytomedicine. 23, 705-713 (2016).
  48. Liu, F., et al. Site-specific effects of tau phosphorylation on its microtubule assembly activity and self-aggregation. Eur J Neurosci. 26, 3429-3436 (2007).
  49. Sultan, A., et al. Nuclear tau, a key player in neuronal DNA protection. J Biol Chem. 286, 4566-4575 (2011).
  50. Bukar Maina, M., Al-Hilaly, Y. K., Serpell, L. C. Nuclear Tau and Its Potential Role in Alzheimer's Disease. Biomolecules. 6, 9(2016).
  51. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9, 790-803 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

128

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены