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摘要

本手稿描述了测量 tau tau, 测量 tau 结合到微管的标准协议, 以及药物治疗后细胞内 tau 的定位。这些协议可以重复使用, 以筛选药物或其他化合物的目标 tau 或微管结合。

摘要

微管相关蛋白 tau 是一种神经元蛋白, 本地化主要在轴突。一般来说, tau 是正常的神经功能的必要条件, 因为它涉及微管组装和稳定。除了神经元, tau 是在人的乳房, 前列腺, 胃, 结直肠癌和胰腺癌, 它显示几乎类似的结构和发挥类似功能的神经元 tau。tau 及其磷酸化的数量可以改变其作为微管的稳定剂的功能, 并导致在不同的神经退行性疾病, 如阿尔茨海默氏病的配对螺旋纤维的发展。确定 tau 的磷酸化状态及其微管结合特性是很重要的。此外, 检查 tau 的细胞内定位是重要的不同疾病。这份手稿详细的标准协议, 测量 tau 磷酸化和 tau 结合到微管的大肠癌细胞与或没有姜黄素和氯化治疗。这些治疗可以用来阻止癌细胞的增殖和发育。在使用低剂量的抗体时, 使用免疫组化和共聚焦显微镜检查 tau 的细胞内定位。这些化验可以反复用于筛选影响 tau tau 或微管结合的化合物。新的治疗方法用于不同的 tauopathies 或相关的抗癌药物, 可以潜在的特点使用这些协议。

引言

头最初被确定为热稳定的微管相关蛋白, co-purified 与蛋白1。头是完全表达在更高的真核生物2,3,4。tau 的主要功能是控制微管组件1,5,6。它还有助于聚合的微管的7, 轴突传输的8, 轴突直径9, 形成的神经瘤极性, 和神经10。Tau 也充当蛋白质支架来控制一些信号通路。鼠脑研究表明, tau 是神经元特异的, 它主要本地化在轴突11。由于 tau 是微管聚合和神经元发育的关键, 因此 tau 被假设在中枢神经系统的轴突发育中起主要作用;这一假说后来通过体外和活体实验来验证。除了神经元, tau 是表达在不同的神经细胞细胞, 包括肝脏, 肾脏和肌肉细胞12,13。Tau 也被表达在人的乳房, 前列腺, 大肠, 胃, 和胰腺癌细胞系和组织14,15,16,17,18,19. 头也被发现在包涵体肌炎作为扭 tubulofilaments 在包含身体20。

头可进行几修饰修改。在所有修饰的修饰中, 磷酸化是最常见的。增加的 tau 磷酸化降低了它对微管的亲和性, 最终破坏了细胞骨架。八十五磷酸化部位已被描述在 tau 蛋白从人类阿尔茨海默病的脑组织分离。这些网站中, 53% 构成丝氨酸, 41% 苏氨酸, 只有6% 酪氨酸残留物21,22,23。Tau 磷酸化影响其定位, 功能, 约束力, 溶解度, 其易感性的其他修饰的修改。并且 tau 磷酸化到超过正常程度 (或完全饱和与磷酸盐小组) 被称为 tau, 复制结构和功能特征的阿尔茨海默氏病24。Tau 保持轴突微管的正常功能, 并确保在生理条件下的神经功能。然而, hyperphosphorylated tau 没有保持一个组织良好的微管结合, 导致神经元的损失, 因为微管的拆卸。tau 磷酸化的正常水平是需要正确的 tau 功能, 但 tau 无法正常工作, 如果其特征磷酸化水平被改变, 如果它是 hyperphosphorylated25。在阿尔茨海默氏病和其他一些与年龄相关的神经退行性疾病中, tau 成为 hyperphosphorylated, 形成配对的螺旋纤维和纤维缠结26,27。因此, 确定 tau 磷酸化和微管结合的方法很重要。

结直肠癌, 一个年龄相关的癌症, 是第三个最常见的诊断癌症和第三个突出的死亡导致的男性和女性的癌症28。大肠癌是西方世界主要的致死性癌症之一,29。因为结肠直肠癌和阿尔茨海默病都与衰老有关, 这两种疾病主要发生在发达国家, 那里的人们享有类似的饮食习惯, 这两个疾病可能会有某种程度的关联。此外, tau 阳性和 tau 阴性癌细胞对化疗药物的反应不同,例如, 紫杉醇16。

姜黄素是姜黄姜黄的主要衍生物之一, 印度香料姜黄30。几个世纪以来, 南亚人口每天都在饮食中消耗姜黄。姜黄素用于治疗不同的疾病, 包括结直肠癌, 阿尔茨海默氏病, 糖尿病, 囊性纤维化, 炎症肠病, 关节炎, 高血脂, 动脉粥样硬化和缺血性心脏病31,32,33,34,35,36,37,38. 锂也能杀死大肠癌细胞或防止其增殖39。锂也可用于治疗阿尔茨海默氏病40 , 因为它减少 tau 聚集, 并防止其 tau 在转基因鼠标模型41,42,43中观察到, 44。

本手稿旨在: 1) 测量治疗细胞的总 tau 和磷头表达水平;2) 描述磷酸酶的测定, 以测量整体 tau 磷酸化;3) 检查 tau 的微管结合;4) 用姜黄素或氯化在大肠癌细胞系中用共焦显微镜定位 tau。结果表明, 细胞治疗的姜黄素, 这是一个所谓的良好的化疗药物的结肠癌, 和治疗氯化可以减少在大肠癌细胞系的总 tau 和磷酸化 tau 的表达。这些处理也可能导致头的核易位。然而, 出乎意料的是, 姜黄素未能改善 tau 与微管的结合。

研究方案

1. 试剂的制备

  1. 添加10和 #181; (1 毫米) 磺氟化物溶液, 10 和 #181; l (1x 从100x 库存) 蛋白酶抑制剂鸡尾酒溶液, 10 和 #181; l (1x 从100x 存货) 磷酸酶抑制剂鸡尾酒解决方案, 以1毫升的 1x radioimmunoprecipitation 检测 (帕) 缓冲区准备完整的帕裂解缓冲液.
  2. 准备10x 通用蛋白缓冲区 (PEM) 缓冲区.
    1. 添加800毫米 (6.0474 克) 哌嗪-n-氮和 #39;-bis-2-ethanesulfonic 酸, 10 毫米 (95.1 毫克) 乙二醇二 (和 #946;-氨基乙基醚)-n, n, #39;, n-和 #39;-乙酸酸, 10 毫米 (51 毫克) 氯化镁 2 , 1.25 m (3 毫升10米) 氢氧化钠在50毫升管, 用15毫升蒸馏水混合, 用涡流溶解。检查 pH 值 (应为 6.9)。如果 pH 值和 #62; 6.9、丢弃缓冲区并重新改造一个新的批次.
      注: 氢氧化钠应低于1.25 米, 以确保 pH 值不超过6.9。不建议使用 HCl 来调节 pH 值和 #62; 6.9.
    2. 添加氢氧化钠滴直到 pH 值为6.9。添加蒸馏水, 使多达25毫升的 10X PEM 缓冲。最后, 使用注射器和 0.2 #181; m 注射器过滤器。将此缓冲器分成等分 1.5 mL 管, 并存储在4和 #176; C.
  3. 使用还原剂和染料准备5x 示例缓冲区.
    1. 混合300和 #181; L (60 毫米) 1 米的三盐酸 (pH 6.8), 2.5 毫升 (25%) 50% 的甘油, 1 毫升 (2%) 10% 钠十二烷基硫酸钠 (sds), 和1.2 毫升蒸馏水组成5毫升的 5x SDS 样品缓冲。存储在 #8722; 20 和 #176; C.
      注: 由于甘油是粘性的, 测量1.25 毫升甘油是困难的。一毫升100% 甘油重1.26 克。因此, 首先在2.5 毫升管中重1.575 克100% 甘油 (相当于1.25 毫升的100% 或50% 毫升的15甘油);与其他组件混合良好.

2。细胞培养, 用姜黄素或氯化治疗, 并检查蛋白质表达

  1. 添加〜 1 x 10 6 小贩的116细胞到100毫米组织培养皿中, 含有最低基本培养基 (记忆) 补充10% 胎牛血清 (FBS) 和1% 青霉素-链霉素。经过一天的培养, 细胞将达到60-70% 汇合.
    注: 所需的车牌数量取决于下面所述的处理数量.
  2. 当细胞到达 ~ 65% 汇合 (近似地使用显微镜), 去除记忆补充培养基并且增加无血清记忆与5和 #181; m, 10 和 #181; m 和30和 #181; m 姜黄素或25毫米, 50 毫米, 和100毫米氯化。在37和 #176 中孵育, 在含有 5% CO 2 的湿润气氛中为 24 h.
  3. 24 小时治疗后, 用1毫升 ice-cold 磷酸缓冲盐水 (PBS) 冲洗细胞, 用刮板机刮掉细胞。将刮成的细胞转移到1.5 毫升离心管和离心机4分钟在 1800 x g 在4和 #176; C 获得细胞小球.
  4. 通过在100和 #181 中悬浮小球来溶解细胞; 在4和 #176 上完成帕缓冲; C 为20分钟, 同时定期敲击管子。简要几种样品.
  5. 离心机匀在台式离心机在 22570 x g 为20分钟在4和 #176; c. 用吸管将清转移到其他带标签的管子上.
  6. 测量清中的蛋白质浓度由布拉德福德化验 45 使用商用蛋白质检测试剂盒.
  7. 用 4X SDS 凝胶缓冲液制备等蛋白质浓度 (10 和 #181; g protein/13 和 #181; L 样本) 的样品。准备好 4x SDS 凝胶-装载缓冲液, 内含400毫米糖 (德勤).
    注: 在这个阶段, 样品可以存储在和 #8722; 20 和 #176; 如果需要的话.
  8. 在100和 #176 的热块上孵育样品; C 为 5 min. 用涡流混合样品, 等待冷却10-15 分钟.
  9. 装配一个电泳系统 。
    1. 在 10% sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sds 页) 上加载10和 #181; g 蛋白 (13 和 #181; L 样本)。将分子量阶梯放到凝胶上一条车道上.
      注意: 当电泳开始时, 蛋白质阶梯将分解成具有明显分子重量的蛋白质带。使用这些波段来估计未知蛋白质带的分子量.
    2. 在加载样品后, 将电泳系统的正负电极连接到电源以保持恒定电压。最初, 从 70 V 开始在20分钟移动蛋白质样品从堆积胶凝体入解决胶凝体。然后, 增加电压到 125 V 大约70-120 分钟, 直到样品和蛋白质梯子到达胶凝体的末端.
    3. 电泳完成后, 用湿 electroblotting 系统将凝胶转移到聚偏氟 (PVDF) 膜上。转移为〜100分钟在 100 v 块和 #160; 4% 牛血清白蛋白 (BSA) 的膜在室温下为90分钟的封闭缓冲, 大约25和 #176; C.
  10. 通过在分子量阶梯的侧面切割它来标记印迹。使用透明的塑料薄片和锋利的切割刀, 以减少印迹。准备主要抗体溶液 (anti-tau 在 1:5, 000; anti-phospho 在 1:4, 000), 并在这个溶液中孵育在4和 #176; C 过夜.
  11. 在夜间孵育后, 在磷酸盐缓冲 saline-Tween-20 (PBST) 溶液中洗涤 7 min 四倍.
  12. 准备相关的二级抗体溶液 (山羊兔或 anti-mouse IgG 在 1:5, 000), 并孵化该溶液中的印迹为90分钟, 室温下约25和 #176; c. PBST 四次, 每7分钟洗一次.
  13. 根据制造商和 #39 的建议, 使用化学发光试剂盒开发印迹。用透明的塑料包装覆盖印迹。通过化学发光成像系统和 #160 获取图像; 用相关软件进行化学发光.

3。磷酸酶检测

  1. 在碱性磷酸酶缓冲中处理细胞裂解 (从步骤 2.5) 到碱性磷酸酶。
    1. 对于控件和处理过的示例, 准备20和 #181; 包含20和 #181 的样本; g 总蛋白。添加含有20和 #181 的细胞裂解的体积; g 总蛋白, 其次为2和 #181; 碱性磷酸酶缓冲剂和10和 #181; 碱性磷酸酶。添加蒸馏水, 以弥补20和 #181; L.
  2. 在37和 #176 上孵化样品; C 为 1 h. 停止反应, 加入乙酸酸 (EDTA) 在最后浓度为50毫米, 或添加钠钒 (Na 3 VO 4 ) 在最后浓度 10 mm。该反应也可以停止加热75和 #176; C 为 5 min.
  3. 在样品与磷酸酶的培养完成之前, 准备相同浓度的样品, 而不添加磷酸酶来与磷酸酶处理的样品进行比较.
  4. 添加新准备的 4X SDS 凝胶缓冲液, 其中包含400毫米的双制式.
  5. 在100和 #176 的热块上孵育样品; C 为5分钟, 用涡流将样品混合。室温下冷却10-15 分钟.
  6. 通过 SDS 页组装一个用于运行10% 聚丙烯酰胺凝胶的电泳系统.
    1. 在 10% polyacry 上加载10和 #181; g 蛋白 (13 和 #181; L 样本)。lamide 凝胶。加载分子量阶梯.
    2. 在加载样本后, 将电泳系统的正负电极连接到电源以保持恒定电压。最初, 从 70 V 开始在20分钟移动蛋白质样品从堆积胶凝体入解决胶凝体。然后, 增加电压到 125 V 和运行的凝胶约70-120 分钟, 直到样品和蛋白质阶梯到达凝胶的末端.
    3. 电泳完成后, 使用湿 electroblotting 系统将凝胶转移到 PVDF 膜上。转让为〜100分钟在 100 v.
    4. 通过在分子量阶梯的一侧做一个小切口来标记印迹。使用透明的塑料板和锋利的切割器, 以减少印迹.
  7. 块和 #160; 膜和 #160; 4% BSA 在室温下阻塞90分钟的缓冲区.
  8. 在第一抗体溶液中孵育印迹 (anti-tau 在 1:5, 000) 在4和 #176; C。洗 PBST 四次, 每7分钟的印迹.
  9. 准备相关的二级抗体溶液 (山羊 anti-mouse IgG 在 1:5, 000), 并孵化在室温下90分钟的印迹。洗涤在 PBST 四次, 每7分钟.
  10. 根据制造商和 #39 的建议, 使用化学发光试剂盒开发印迹。在透明的塑料包装内覆盖印迹。通过化学发光成像系统获取图像与相关软件.

4。微管结合试验

  1. 对于微管结合试验, 重复步骤 2.1-2.6.
  2. 准备 1X (2 毫升) pem 缓冲器, 从 10X pem 缓冲区存储在4和 #176; C 通过添加20和 #181; M (40 和 #181; l) 紫杉醇和1毫米 (20 和 #181; l) GTP。从和 #8722 中取出微管 (MT) 的股票; 80 和 #176; c 冷冻机和 大肠杆菌 头工作库存, 从和 #8722; 20 和 #176; c 冷冻机.
  3. 准备示例, 按 表 1 .
  4. 孵育在37和 #176; c 为30分钟, Ultracentrifuge 在25和 #176; c 为60分钟, 在 10万 x g .
  5. 传输120和 #181; 包含未绑定头的清, 用于清洁和标记管.
  6. 添加120和 #181; L (与上清相同体积) 的5X 样品缓冲液到含有粘合头的颗粒上并彻底混合。将溶液转移到清洁的标签管, 并彻底混合.
  7. 测量蛋白质浓度 (请参见步骤 2.6).
    注: 在准备样品时, 使用溶液体积 (步骤 4.6) 来制备颗粒和上清样品.
  8. 制备等效蛋白质浓度样品, 并加入新制备的 4x SDS 凝胶缓冲液 (含 400 mM).
    注: 样品可存储在 #8722; 20 和 #176; C 在这个阶段.
  9. 重复步骤 3.5-3.10.
    10. 需要
1 116 控制 (6.21 和 #956; g/和 #956; l) 2 和 #956; l 3 116-姜黄素20和 #956; M (3.28 和 #956; g/和 #956; l) 氯化 116--25 mM (5.43 和 #956; g/和 #956; l) 2 和 #956; l 1 和 #956;tau-352 2 ">>
样本 名称 主要蛋白质需要 PEM-GTP-PTX
9.66 和 #956; l (60 #956; g) 108.34 和 #956; l
2 小贩 116-姜黄素 10 & #956; M (4.81 和 #956; g/和 #956; l) 2 和 #956; l 16.63 和 #956; l (80 和 #956; g) 101.37 和 #956; l
2 和 #956; l 30.49 和 #956; l (100 和 #956; g) 87.51 和 #956; l
4 2 和 #956; l 18.42 和 #956; l (100 和 #956; g) 99.58 和 #956;
5 大肠杆菌 头 117 和 #956; l
6 MT 2 和 #956; l X 118 和 #956; l
120 和 #956; l 每个

表 1: 微管结合试验的样品制备.

5. 姜黄素治疗细胞后的定位和表达

  1. 使用70% 乙醇清洗片, 使用实验室组织将其烘干。在一个标记为6的组织培养板的每个井中插入一个单一的片。将板放在生物安全柜上, 并在紫外线灯上切换至少3小时.
  2. 亚文化细胞和种子他们到6个井板的相关井在 2.5 x 10 5 细胞/井在推荐的培养基中.
  3. 24 小时后, 使用倒置显微镜检查细胞, 同时使用10X 和40X 的目标来检测细胞形态学变化。如果需要, 记录照片.
  4. 使用 PBS 冲洗两次单元格。在37和 #176 中固定3.7% 甲醛中的细胞; C 在黑暗中孵化.
    注: 甲醛固定在室温下工作也很好。在处理甲醛时, 要佩戴适当的个人防护设备.
  5. 在 PBS 中清洗单元格。将 ice-cold 甲醇中的细胞固定在 #8722; 20 和 #176; C 为15分钟 Permeabilize 的细胞, 在 3% BSA 和0.1% 海卫一在 pbs 冰上孵化他们10分钟, 用 pbs 将细胞洗净.
    6. 在室温下,
  6. 在 PBS 溶液中孵育阻塞缓冲液 (3% BSA 和 0.1% Tween-20) 中的细胞.
    注: 在4和 #176 孵化2小时; C 也很管用.
  7. 在 PBS 中准备 3% BSA 和 0.1% Tween-20 中的主抗体 (anti-tau 1:200) 解决方案 (, 如 、2和 #181; 0.4 mL 缓冲区中的 tau-13 抗体).
  8. 切割 pvdf 薄膜的小块, 使其在6孔板的每一个井内都能适当地适合; 浸泡在水中5分钟. 将切割的 pvdf 放在每个井中.
  9. 在每个井中添加60和 #181; 主要抗体解决方案。放置片, 使细胞能够触及主抗体溶液。在一个黑暗潮湿的室内过夜, 在4和 #176 孵育;PBS 四次清洗.
  10. 在 PBS 中制备二级抗体溶液 (荧光素-共轭 594 anti-mouse IgG, 1:400) 3% BSA 和 0.1% Tween-20.
  11. 切割 pvdf 薄膜的小块, 使其在6孔板的每一个井内都能正确地放置, 并将其浸泡在水中5分钟. 在每个井中放上 pvdf.
  12. 在 6-井板中添加80和 #181; 二级抗体溶液中的每一个 PVDF 片的 L。放置片使细胞能够接触二次抗体溶液。在一个阴暗潮湿的室温下孵育2小时, 用 PBS 洗涤四次.
  13. 在安装介质中装入4和 #39 的样品, 6-diamidino-2-吲 (DAPI), 并将片固定在玻璃幻灯片上.
    1. 在玻璃幻灯片上添加一滴安装介质和 DAPI。从每个井中取出片, 并将其放在含有 DAPI 的安装介质的玻璃幻灯片上。确保每个含有染色细胞的片的表面接触蔓在相应的玻璃滑梯上放上中号.
    2. 在每个片上涂抹指甲油, 密封并固定在玻璃上。如果需要, 请执行此步骤两次.
  14. 在暗室中在室温下孵育1.5 小时.
  15. 在暗室中使用浸入式油对片进行共聚焦显微镜检查幻灯片.

结果

用不同浓度的姜黄素或氯化 (图 1) 治疗后, 对全头和磷的表达进行了研究。三种不同浓度的姜黄素对细胞的治疗降低了 tau 表达水平;但是, 磷在低浓度姜黄素的治疗下增加, 但在处理姜黄素浓度较高的细胞时却减少。抗磷头 (Ser396) 用于检测磷头。在三种不同浓度的氯化 (图 1) 中, 总 tau 和磷的水平都降低了。先前的研究表明, tau ?...

讨论

该手稿建立了不同的程序条件, 检测总 tau 和磷酸化 tau 在大肠癌细胞治疗姜黄素和氯化。为了评估蛋白样品中 tau 的总磷酸化状态, 本文描述了磷酸酶的测定方法。这种检测方法有可能用于检测任何蛋白质的磷酸化状态。

这种方法是基于磷酸化蛋白比其 non-phosphorylated 状态慢的原理。本协议采用碱性磷酸酶和碱性磷酸酶缓冲剂。在将化验成分加入到细胞裂解后, 样品应在特定的...

披露声明

作者声明他们没有什么可透露的。

致谢

这项研究是作为项目的一部分, 题为 ' 开发和产业化的高价值的海洋微藻的化妆品原料 ', 由海洋和渔业部, 韩国, 并得到了内部资助 (2Z04930) 的支持来自 KIST 江陵天然产物研究所。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
HCT 116 cellATCCCCL-247
MEM (EBSS)HycloneSH30024.01
Fetal Bovine Serum (FBS)ThermoFisher (Gibco)16000044Store at -20 °C
penicillin-streptomycinHycloneSV30010
Trypsin-EDTA solutionWelGeneLS 015-01
100 mm dishCorning430161
6 well plateCorningCoster 3516
Anti-Tau 13 antibodyabcamab19030
Dithiothreitol (DTT)Roche10 708 984 001Storage Temperature 2–8 °C
Microlitre CentrifugesHettich ZentrifugenMIKRO 200 R
PaclitaxelSigma-AldrichT1912Storage Temperature 2–8 °C
CurcuminSigma-Aldrich (Fluka)78246Storage Temperature 2–8 °C
Microtubules (MT)CytoskeletonMT001Store at 4 °C (desiccated)
Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200Store at 4 °C in the dark
Sodium hydroxideSigma72068
Magnesium ChlorideSigma-AldrichM2670
GTPSigma-AldrichG8877Store at -20 °C
DPBSWelGeneLB 001-02
Sonic DismembratorFisher ScientificModel 500
UltracentrifugeBeckman CoulterOptima L-100 XP
PIPESSigmaP1851
Bovine serum Albumin (BSA)SigmaA7906
Molecular ImagerBio-RadChemiDoc XRS+Store at 4 °C
Protein assay dye reagentBio-Rad500-0006
α-tubulin (11H10) Rabbit mAbCell signalling2125
GAPDH (14C10) Rabbit mAbCell signalling2118
Anti-Tau (phospho S396) antibodyabcamab109390
EGTASigmaE3889Store at room temperature
FastAP Thermosensitive Alkaline PhosphataseThermo ScientificEF0651Store at -20 °C
PMSFSigmaP7626Store at room temperature
Phosphatase Inhibitor CocktailCell Signalling5870Store at 4 °C
Protease Inhibitor CocktailCell Signalling5871Store at 4 °C
RIPA BufferSigmaR 0278Storage Temperature 2–8 °C
Tau-352 humanSigmaT 9950Store at -20 °C
Triton X-100 Sigma-AldrichX - 100Store at around 25 °C
PVDF membraneBio-Rad162-0177
Goat anti-mouse IgG Secondary AntibodyThermoFisherA-11005Store at 4 °C in the dark
Confocal MicroscopyLeica MicrosystemLeica TCS SP5
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Affymetrix75819
Protein AssayBio-Rad500-0006Store at 4 °C

参考文献

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