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Résumé

Ce manuscrit décrit les protocoles normalisés pour mesurer les tau hyperphosphorylée, mesure contraignante de tau de microtubules et la localisation de tau intracellulaire suivant des traitements médicamenteux. Ces protocoles peuvent être utilisés répétitivement pour le dépistage de drogues ou autres composés qui ciblent tau hyperphosphorylée ou microtubules contraignant.

Résumé

La protéine associée aux microtubules tau est une protéine neuronale qui se localise principalement dans les axones. Généralement les tau est essentiel pour le fonctionnement neuronal normal car elle est impliquée dans la stabilisation et l’assemblage des microtubules. En plus de neurones, tau est exprimée en maternel, de la prostate, colorectal, cancer gastrique et des cancers du pancréas où il montre une structure presque similaire et exerce des fonctions semblables comme le tau neuronale. Le montant de tau et sa phosphorylation peut changer sa fonction comme un stabilisateur de microtubules et aboutir à l’élaboration des filaments hélicoïdaux appariés dans les troubles neurodégénératifs différents, tels que la maladie d’Alzheimer. Il est important de déterminer l’état de phosphorylation de tau et ses caractéristiques de liaison de microtubules. En outre, examiner la localisation intracellulaire de tau est important dans différentes maladies. Ce manuscrit détails des protocoles standard pour la mesure de la phosphorylation de tau et liaison tau aux microtubules dans les cellules de cancer colorectal avec ou sans la curcumine et le traitement de LiCl. Ces traitements peuvent être administrés pour arrêter le développement et la prolifération des cellules cancéreuses. Localisation intracellulaire de tau est examinée à l’aide de l’immunohistochimie et la microscopie confocale lors de l’utilisation de faibles quantités d’anticorps. Ces tests peuvent servir répétitivement pour criblage de composés qui affectent les tau hyperphosphorylée ou liaison de microtubules. Nouvelles thérapeutiques utilisées pour différents tauopathies ou agents anticancéreux connexes peuvent potentiellement être caractérisées à l’aide de ces protocoles.

Introduction

Tau a été initialement identifiée comme étant une protéine associée aux microtubules thermostable qui a été purifiée conjointement avec la tubuline1. Tau est exprimée exclusivement en plus eucaryotes2,3,4. La fonction principale de tau est de contrôler les microtubules Assemblée1,5,6. Elle contribue également à la polymérisation des microtubules7, transport axonal8, changements de diamètre axonal9, formation de polarité neurinome et neurodégénérescence10. Tau agit également comme un échafaudage de protéine pour contrôler certaines voies de signalisation. Études de cerveau chez les rats suggèrent que tau est neurone-spécifique et qu’elle se localise principalement dans les axones11. Parce que la protéine tau est essentiel pour la polymérisation des microtubules et développement neuronal, dans le cas du tau, l’hypothèse a été pour jouer un rôle majeur dans le développement axonal dans le système nerveux central ; Cette hypothèse a été vérifiée par des expériences in vitro et in vivo . En plus des neurones, tau est exprimé dans des cellules non neuronales différentes, y compris le foie, les reins et les cellules de muscle12,13. Tau est exprimée également en maternel, prostate, colorectal, gastrique et le cancer du pancréas cell lines et tissus14,15,16,17,18, 19. tau est également trouvée dans myositis de corps d’inclusion comme tubulofilaments tordu dans le corps d’inclusion20.

Tau peut effectuer plusieurs modifications post-traductionnelles. Toutes les modifications post-traductionnelles, la phosphorylation est la plus courante. La phosphorylation de tau accrue diminue son affinité pour les microtubules, enfin déstabiliser le cytosquelette. Quatre-vingt cinq sites de phosphorylation ont été décrits dans la protéine tau isolé des tissus cérébraux humains la maladie d’Alzheimer. De ces sites, 53 % constituent des sérine, thréonine de 41 % et 6 % seulement des22,de21,de résidus tyrosine23. La phosphorylation de Tau influe sur sa localisation, fonction, liaison, solubilité et sa sensibilité aux autres modifications post-traductionnelles. Aussi tau phosphorylation dépasse la mesure normale (ou complètement saturée avec des groupes de phosphate) est connu comme hyperphosphorylée qui reproduit les caractéristiques structurales et fonctionnelles de la maladie d’Alzheimer24. Tau maintient le bon fonctionnement des microtubules axonales et assure un fonctionnement neuronal normal dans des conditions physiologiques. Toutefois, le tau hyperphosphorylée ne parvient pas à maintenir une liaison de microtubules bien organisé, causant la perte neuronale en raison du démontage de microtubules. Des niveaux normaux de la phosphorylation de tau sont requises pour tau de bon fonctionnement, mais tau ne parvient pas à fonctionner normalement si son niveau de phosphorylation caractéristique est modifiée et si elle est hyperphosphorylée25. Dans la maladie d’Alzheimer et de certaines autres maladies neurodégénératives liées à l’âge, tau devient hyperphosphorylée et forme des filaments hélicoïdaux appariés et les enchevêtrements neurofibrillaires26,27. Ainsi, les méthodes de détermination de la phosphorylation de tau et liaison de microtubules sont importants.

Le cancer colorectal, un cancer lié au vieillissement, est que le troisième plus fréquemment diagnostiquée cancer et le troisième important causant des décès pour les hommes et les femmes28. Le cancer colorectal est un des principaux cancers causant des décès dans le monde occidental29. Parce que le cancer colorectal et la maladie d’Alzheimer sont associés au vieillissement et les deux se produisent principalement dans les pays développés où les gens apprécient des habitudes alimentaires similaires, les deux maladies peuvent en quelque sorte être corrélés. En outre, les cellules cancéreuses tau-positifs et négatifs tau réagissent différemment aux agents chimiothérapeutiques, par exemple, paclitaxel16.

La curcumine est l’un des principaux dérivés de Curcuma longa, l’épice indienne curcuma30. Pendant des siècles, les populations sud-asiatiques ont consommé curcuma dans leur alimentation au quotidien. La curcumine est utilisée pour traiter différentes maladies, cancer colorectal, maladie d’Alzheimer, diabète, mucoviscidose, maladie inflammatoire de l’intestin, l’arthrite, hyperlipidémie, athérosclérose, et cardiopathie ischémique31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. lithium peut aussi tuer des cellules de cancer colorectal ou d’empêcher leur prolifération39. Au lithium peut également être utilisé pour le traitement de la maladie d’Alzheimer40 car il diminue l’agrégation tau et empêche sa hyperphosphorylée tel qu’observé dans une souris transgénique modèle41,42,43, 44.

Ce manuscrit a pour but de : 1) mesurer la tau totale et les niveaux d’expression de phospho-tau dans les cellules traitées ; 2) décrivent un dosage de la phosphatase pour mesurer la phosphorylation de tau globale ; 3) examiner microtubule-liaison du tau ; et 4) localiser tau en microscopie confocale en lignées cellulaires de cancer colorectal traités avec la curcumine ou de LiCl. Résultats révèlent que traitement des cellules avec la curcumine, qui est un agent chimiothérapeutique censé être bon pour le cancer du côlon, et le traitement avec LiCl peut réduire l’expression de ces deux tau totale et phosphorylée tau dans les lignées cellulaires de cancer colorectal. Ces traitements peuvent aussi causer la translocation nucléaire du tau. Cependant, contre toute attente, curcumine ne parvient pas à améliorer la liaison des tau aux microtubules.

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Protocole

1. préparation des réactifs

  1. Ajouter 10 µL de solution de fluorure de phénylméthylsulfonyle (1 mM), 10 µL (1 x de 100 actions de x) de solution cocktail inhibiteur de protéase et 10 µL (1 x de 100 actions de x) de la phosphatase solution cocktail inhibiteur à 1 mL de 1 x radioimmunoprecipitation (RIPA) tampon pour préparer le tampon de lyse complète RIPA.
  2. Prepare 10 x tampon de tubuline générales (PEM).
    1. Ajouter 800 mM (6,0474 g) pipérazine-N-N ' - bis - 2-ethanesulfonic acide, 10 mM (95,1 mg) éthylène glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N ', N '-tétraacétique acide, 10 mM (51 mg) MgCl 2 et 1,25 M (3 mL de 10 M) de NaOH dans un tube de 50 mL , mélanger avec 15 mL d’eau distillée et dissoudre à l’aide d’un vortex. Vérifier le pH (soit 6,9). Si pH > 6.9, jetez le tampon et refaire beaucoup frais.
      NOTE : NaOH devrait être inférieure à 1,25 M pour s’assurer que le pH ne pas dépasser 6,9. Il n’est pas conseillé d’utiliser des HCl pour ajuster le pH > 6.9.
    2. NaOH ajouter goutte à goutte, jusqu'à ce que le pH est de 6,9. Ajouter de l’eau distillée pour faire jusqu'à 25 mL de tampon de PEM X 10. Enfin, filtrer à l’aide d’une seringue et un filtre de seringue 0,2 µm. Diviser ce tampon en aliquotes dans des tubes de 1,5 mL et conserver à 4 ° C.
  3. Prepare 5 x tampon avec réducteur et colorant.
    1. Mix 300 µL (60 mM) de 1 M Tris-HCl (pH 6,8), 2,5 mL (25 %) de glycérol à 50 %, 1 mL (2 %) de 10 % dodécylsulfate de sodium (SDS) et 1,2 mL d’eau distillée pour rattraper les 5 mL de 5 x tampon échantillon SDS. Conserver à la − 20 ° C.
      Remarque : Étant donné que le glycérol est visqueux, mesurant 1,25 mL glycérol est difficile. 1 mL de 100 % de glycérol pèse 1,26 g. Ainsi, peser 1,575 g de glycérol à 100 % (ce qui équivaut à 1,25 mL de 100 % ou 2,5 mL de glycérol à 50 %) dans un 15 mL tube tout d’abord ; Mélangez bien avec les autres composants.

2. Cell Culture, le traitement avec la curcumine ou traitement LiCl et examen d’Expression de la protéine

  1. Ajouter ~ 1 x 10 6 116 HCT cellules en 100 mm plats de culture tissulaire contenant le média essentiel Minimum (MEM) additionné de 10 % fœtale bovine sérum (FBS) et 1 % la pénicilline-streptomycine. Après une journée de mise en culture, cellules atteindra 60-70 % confluent.
    Remarque : Le nombre de plaques nécessaires dépend du nombre de traitements décrits ci-dessous.
  2. Lorsque les cellules atteignent la confluence ~ 65 % (approchée au microscope), enlever le milieu MEM complétée et ajouter sans sérum MEM avec 5 µM, 10 µM, 30 µM curcumine ou 25 mM, 50 mM et 100 mM LiCl. Incuber à 37 ° C pendant 24 h dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO 2.
  3. 24 h après le traitement, laver les cellules avec glacee tampon phosphate salin (PBS) 1 mL et raclez les cellules à l’aide d’un grattoir de cellules. Transfert les cellules grattées dans 1,5 mL centrifuger tubes et centrifuger pendant 4 min à x 1 800 g à 4 ° C pour obtenir des granules cellulaires.
  4. Lyser les cellules en suspendant les pellets dans 100 µL de tampon RIPA complète à 4 ° C pendant 20 min en tapant régulièrement les tubes. Laisser agir les échantillons brièvement.
  5. Centrifuger les homogénats cellulaires dans une centrifugeuse de paillasse à 22 570 x g pendant 20 min à 4 ° C. transférer les surnageants d’autres tubes étiquetés à l’aide d’une pipette.
  6. Mesurer la concentration de protéines dans les surnageants par le dosage de Bradford 45 à l’aide de kits de dosage protéique commercial.
    7. Tampon de gel-charge
  7. préparer des échantillons de concentration protéique égale (10 µg protéine/13 µL d’échantillon) de lysats cellulaires avec 4 X SDS. Préparé 4 x mémoire tampon de gel-chargement de SDS frais contenant 400 mM le dithiothréitol (DTT).
    Remarque : À ce stade, les échantillons peuvent être conservés à − 20 ° C si nécessaire.
  8. Incuber les échantillons sur un bloc chauffant à 100 ° C pendant 5 min. mélangent les échantillons à l’aide d’un vortex et attendent pour les refroidir pendant environ 10-15 min.
  9. Monter un système d’électrophorèse.
    1. Charge 10 µg de protéines (13 µL d’échantillon) / puits sur un gel de SDS-polyacrylamide 10 % pour l’électrophorèse (SDS-PAGE). Charger l’échelle de poids moléculaire sur le gel à une seule voie.
      Remarque : Comme l’électrophorèse commence, l’échelle de la protéine résoudra dans les bandes de protéines de poids moléculaires apparents. Utilisez ces bandes pour estimer le poids moléculaire des bandes protéiques inconnue.
    2. Après avoir chargé les échantillons, connecter les électrodes positive et négatives du système électrophorèse à une source de puissance pour maintenir une tension constante. Au début, commencent à 70 V pendant 20 min pour les échantillons de protéine délaisser le gel de concentration dans le gel résolution. Ensuite, augmenter la tension à 125 V pour environ 70 à 120 min, jusqu'à ce que les échantillons et échelle de protéines atteignent la fin du gel.
    3. à l’issue de l’électrophorèse, transférer le gel sur une membrane de polyvinylidène difluoride (PVDF) en utilisant un système d’electroblotting humide. Transfert pour ~ 100 min à 100 c. Block la membrane dans un tampon bloquant 4 % d’albumine sérique bovine (BSA) pendant 90 min à température ambiante de 25 ° C.
  10. Marquer la tache en le coupant sur le côté avec l’échelle de poids moléculaire. Utilisez une feuille de plastique transparente et une lame aiguisée pour couper la tache. Préparer les solutions d’anticorps primaire (anti-tau au 1:5, 000 ; anti-phospho-tau au 1:4 000) et incuber la tache dans cette solution à 4 ° C jusqu’au lendemain.
  11. Après une nuit d’incubation, laver la tache pendant 7 minutes quatre fois dans une solution tampon phosphate salin-Tween-20 (PBST).
  12. Préparer les solutions d’anticorps secondaires pertinentes (anti-lapin de chèvre ou anti-souris IgG à 5 000:1) et incuber la tache dans cette solution pendant 90 min à température ambiante d’environ 25 ° C. Lavez dans PBST quatre fois, chaque 7 min.
  13. Développer la tache à l’aide d’un kit de chimiluminescence selon le fabricant ' recommandations s. Couvrir la tache à l’aide d’une pellicule de plastique transparente. Acquisition d’images par une système de chimiluminescence avec logiciel approprié d’imagerie de la chimiluminescence.

3. Test de la phosphatase

  1. traiter les lysats cellulaires (de l’étape 2.5) à la phosphatase alcaline dans le tampon de la phosphatase alcaline.
    1. Pour les deux contrôlent et préparer les échantillons traités, 20 µL échantillons contenant 20 µg de protéines totales. Ajouter le volume de lysats de cellules contenant 20 µg de protéines totales, suivie de 2 µL de tampon de la phosphatase alcaline et phosphatase alcaline 10 µL. Ajouter de l’eau distillée pour rattraper 20 µL.
  2. Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 1 h. arrêter la réaction en ajoutant de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à une concentration finale de 50 mM, ou en ajoutant l’orthovanadate de sodium (Na 3 VO + 4) à une concentration finale de 10 mM. La réaction peut également être arrêtée par chauffage à 75 ° C pendant 5 min.
  3. Avant la fin de l’incubation d’échantillons avec phosphatase, préparer les échantillons de la même concentration sans ajouter de phosphatase pour la comparaison avec des échantillons traités phosphatase.
  4. Tampon de gel-charge X SDS ajouter les 4 fraîchement préparés contenant 400 mM TNT.
  5. Incuber les échantillons sur un bloc chauffant à 100 ° C pendant 5 min. mélanger les échantillons à l’aide d’un vortex. Refroidir à température ambiante pendant ~ 10-15 min.
  6. Assembler un système d’électrophorèse pour l’exécution d’un gel de polyacrylamide 10 % par SDS-PAGE.
    1. Charge 10 µg protéine (13 µL d’échantillon) / puits sur une polyacry de 10 %gel de Jack. Charger l’échelle de poids moléculaire.
    2. Après le chargement de l’échantillon, connecter les électrodes positive et négatives du système électrophorèse à une source de puissance pour maintenir une tension constante. Au début, commencent à 70 V pendant 20 min pour les échantillons de protéine délaisser le gel de concentration dans le gel résolution. Ensuite, augmenter la tension à 125 V et exécutez le gel pendant environ 70-120 min, jusqu'à ce que les échantillons et échelle de protéines atteignent la fin du gel.
    3. à l’issue de l’électrophorèse, transférer le gel sur une membrane PVDF, en utilisant un système d’electroblotting humide. Transfert pour ~ 100 min à 100 c.
    4. Marquer la tache en faisant un petit coupé sur le côté de l’échelle de poids moléculaire. Utiliser une feuille de plastique transparente et une lame aiguisée pour la découpe de la tache.
  7. Bloquent la membrane dans un tampon bloquant 4 % BSA pendant 90 min à température ambiante.
  8. Incuber la tache en solution primaire-anticorps (anti-tau au 1:5, 000) à 4 ° C jusqu’au lendemain. Lavez la tache dans du PBST quatre fois, pendant 7 min chaque.
  9. Préparer la solution d’anticorps secondaires pertinente (chèvre anti-souris IgG à 5 000:1) et incuber la tache pendant 90 min à température ambiante. Laver dans du PBST quatre fois, pendant 7 min chaque.
  10. Développer la tache à l’aide d’un kit de chimiluminescence selon le fabricant ' recommandations s. Couvrir la tache au sein d’une pellicule de plastique transparente. Acquisition d’images par une système de chimiluminescence avec logiciel approprié d’imagerie de la chimiluminescence.

4. Essai de microtubule-liaison

  1. pour l’essai de liaison de microtubules, répétez les étapes 2.1-2.6.
  2. Préparer 1 X (2 mL) PEM tampon de 10 tampons X PEM stockés à 4 ° C en ajoutant 20 µM (40 µL) paclitaxel et GTP (20 µL) de 1 mM. Dresser un bilan des microtubules (MT) de − congélateur 80 ° C et le stock de travail tau e. coli de − congélateur de 20 ° C.
  3. Préparer les échantillons selon le tableau 1.
  4. Incuber à 37 ° C pendant 30 min. ultracentrifugeuse à 25 ° C pendant 60 min à 100 000 x g.
  5. Transfert 120 µL de surnageants contenant non consolidé tau, pour nettoyer et étiqueté tubes.
  6. Ajouter 120 µL (même volume que le surnageant) de 5 X échantillon de tampon au culot contenant lié tau et bien mélange. Transférer la solution pour nettoyer les tubes étiquetés et mélanger soigneusement.
  7. Mesurer la concentration de protéine (voir étape 2.6).
    Remarque : Lors de la préparation des échantillons, utiliser le volume de solution (point 4.6) pour la préparation des échantillons le pellet et le surnageant.
  8. Préparer les échantillons de concentration de l’équivalent en protéines et ajouter fraîchement préparés 4 x tampon de chargement gel SDS contenant du TNT (400 mM).
    Remarque : Les échantillons peuvent être conservés à − 20 ° C à ce stade.
  9. Répéter les étapes 3.5-3.10.
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exemple nom Microtubule nécessaire principale protéine nécessaire PEM-GTP-PTX
1 HCT 116-contrôle (6,21 μg/μl) 2 μl 9,66 μl (60 μg) μl 108.34
2 HCT 116-curcumine 10 μM (4,81 μg/μl) 2 μl 16,63 μl (80 μg) μl 101.37
3 HCT 116-curcumine 20 μM (3.28 μg/μl) 2 μl 30.49 μl (100 μg) μl 87.51
4 HCT 116-LiCl 25 mM (5,43 μg/μl) 2 μl 18.42 μl (100 μg) μl 99,58
5 e. coli tau μl 2 1 μl Tau-352 μl 117
6 MT seulement μl 2 X 118 μl
120 μl de chaque

tableau 1 : préparation pour l’analyse de microtubule-fixation des échantillons.

5. localisation et Expression de Tau après traitement des cellules avec la curcumine

  1. nettoyer un lamelle couvre-objet à l’aide d’éthanol à 70 % et séchez-le à l’aide d’un chiffon de laboratoire. Insérer un lamelle couvre-objet unique dans chaque puits d’une plaque de culture de tissus marqué 6 puits. Placer la plaque sur une sécurité biologique du cabinet et allumer une lumière pendant au moins 3 h UV
  2. Repiquer les cellules et les graines dans les puits pertinents de la plaque 6 puits à 2,5 x 10 5 cellules/puits dans le milieu de culture recommandée.
  3. Après ~ 24 h, examiner les cellules à l’aide d’un microscope inversé en utilisant aussi bien les 10 X et 40 X objectifs pour vérifier les modifications morphologiques cellulaires. Enregistrer des photos si nécessaire.
  4. Rincer les cellules deux fois à l’aide de PBS. Fixer les cellules à 3,7 % de formaldéhyde dans un incubateur à 37 ° C dans l’obscurité.
    Remarque : La Fixation par le formaldéhyde à la température ambiante fonctionne bien, aussi. Portez un équipement de protection individuelle approprié lorsque vous manipulez formaldéhyde.
  5. Laver les cellules dans du PBS. Difficulté des cellules dans le méthanol glacée à − 20 ° C pendant 15 minutes Permeabilize les cellules en incubant les 3 % de BSA et 0,1 % Triton X-100 dans du PBS sur la glace pendant 10 min. laver les cellules avec du PBS.
  6. Incuber les cellules dans un tampon bloquant (3 % de BSA et 0,1 % Tween-20 dans une solution de PBS) pendant 1 h à température ambiante.
    Remarque : Une Incubation de 2 h à 4 ° C fonctionne bien, aussi.
  7. Préparer la solution primaire-anticorps (anti-tau au 1 : 200) dans 3 % de BSA et 0,1 % Tween-20 dans du PBS (p. ex., 2 µL tau-13 anticorps à 0,4 mL de tampon).
  8. Couper de petits morceaux d’un PVDF membrane afin que les éléments s’ajustent correctement au sein de chaque puits de la plaque 6 puits ; tremper dans l’eau pendant 5 min. Place la coupe PVDF dans chaque puits.
  9. Ajouter 60 µL de solution d’anticorps primaire à la coupe les morceaux PVDF dans chaque puits. Placer les lamelles couvre-objet, telle que les cellules peuvent toucher la solution d’anticorps primaires. Incuber une nuit à 4 ° C dans une chambre sombre et humide. Laver les quatre fois dans du PBS.
  10. Préparer la solution d’anticorps secondaire (fluorescéine conjuguée 594 anti-souris IgG à 1 : 400) à 3 % de BSA et 0,1 % Tween-20 dans du PBS.
  11. Couper de petits morceaux d’une membrane PVDF pour que les morceaux s’inscrivent bien dans chaque puits de la plaque 6 puits et les tremper dans l’eau pendant 5 min. Place la coupe PVDF dans chaque puits.
  12. Ajouter 80 µL de solution d’anticorps secondaire à chacune des pièces dans la plaque de 6 puits PVDF. Placer la lamelle couvre-objet, telle que les cellules peuvent toucher la solution d’anticorps secondaires. Incuber dans une chambre sombre et humide à température ambiante pendant 2 h. lavage avec du PBS quatrefois.
  13. Monter les échantillons dans le milieu de montage avec 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et fixer les lamelles sur lames de verre.
    1. Ajouter une goutte du milieu de montage au DAPI sur lames de verre. Retirez les lamelles de chaque puits et placez-les sur les lames de verre contenant le milieu de montage au DAPI. S’assurer que la surface de chaque lamelle contenant des cellules colorées touche du mounmoyen de Ting sur la lame de verre correspondant.
    2. Appliquer vernis à ongles tout autour de chaque lamelle couvre-objet pour sceller et fixez-les hermétique sur les lames de verre. Si nécessaire, effectuer cette étape deux fois.
  14. Laisser incuber pendant 1,5 h à température ambiante dans une chambre noire.
  15. Examiner les diapositives à l’aide d’un microscope confocal en utilisant l’huile d’immersion sur la lamelle couvre-objet dans une pièce sombre.

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Résultats

Expression de tau totale et phospho-tau a été examinée après traitant les cellules avec différentes concentrations de curcumine ou LiCl (Figure 1). Traitement des cellules avec les trois concentrations différentes de la curcumine ont diminué les niveaux d’expression tau ; expression de phospho-tau a augmenté après traitement avec une faible concentration de curcumine mais diminué après traitement de cellules avec des concentrations plus élevée...

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Discussion

Ce manuscrit mis en place des conditions procédurales différentes pour détecter les tau totale et phosphorylé tau dans les cellules de cancer colorectal traités avec la curcumine et de LiCl. Pour évaluer l’état global de la phosphorylation de tau dans les échantillons de protéines, un test de la phosphatase a été décrite. Ce dosage est potentiellement utilisable pour examiner l’état de phosphorylation d’une protéine.

Cette analyse est basée sur le principe selon lequel pho...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette recherche a été réalisée dans le cadre du projet intitulé « Développement et industrialisation de matières premières cosmétiques de haute valeur de micro-algues marines », financé par le ministère des Océans et la pêche, la Corée et a été financée par une subvention intra-muros (2Z04930) de KIST Gangneung Institut des produits naturels.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
HCT 116 cellATCCCCL-247
MEM (EBSS)HycloneSH30024.01
Fetal Bovine Serum (FBS)ThermoFisher (Gibco)16000044Store at -20 °C
penicillin-streptomycinHycloneSV30010
Trypsin-EDTA solutionWelGeneLS 015-01
100 mm dishCorning430161
6 well plateCorningCoster 3516
Anti-Tau 13 antibodyabcamab19030
Dithiothreitol (DTT)Roche10 708 984 001Storage Temperature 2–8 °C
Microlitre CentrifugesHettich ZentrifugenMIKRO 200 R
PaclitaxelSigma-AldrichT1912Storage Temperature 2–8 °C
CurcuminSigma-Aldrich (Fluka)78246Storage Temperature 2–8 °C
Microtubules (MT)CytoskeletonMT001Store at 4 °C (desiccated)
Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200Store at 4 °C in the dark
Sodium hydroxideSigma72068
Magnesium ChlorideSigma-AldrichM2670
GTPSigma-AldrichG8877Store at -20 °C
DPBSWelGeneLB 001-02
Sonic DismembratorFisher ScientificModel 500
UltracentrifugeBeckman CoulterOptima L-100 XP
PIPESSigmaP1851
Bovine serum Albumin (BSA)SigmaA7906
Molecular ImagerBio-RadChemiDoc XRS+Store at 4 °C
Protein assay dye reagentBio-Rad500-0006
α-tubulin (11H10) Rabbit mAbCell signalling2125
GAPDH (14C10) Rabbit mAbCell signalling2118
Anti-Tau (phospho S396) antibodyabcamab109390
EGTASigmaE3889Store at room temperature
FastAP Thermosensitive Alkaline PhosphataseThermo ScientificEF0651Store at -20 °C
PMSFSigmaP7626Store at room temperature
Phosphatase Inhibitor CocktailCell Signalling5870Store at 4 °C
Protease Inhibitor CocktailCell Signalling5871Store at 4 °C
RIPA BufferSigmaR 0278Storage Temperature 2–8 °C
Tau-352 humanSigmaT 9950Store at -20 °C
Triton X-100 Sigma-AldrichX - 100Store at around 25 °C
PVDF membraneBio-Rad162-0177
Goat anti-mouse IgG Secondary AntibodyThermoFisherA-11005Store at 4 °C in the dark
Confocal MicroscopyLeica MicrosystemLeica TCS SP5
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Affymetrix75819
Protein AssayBio-Rad500-0006Store at 4 °C

Références

  1. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1858-1862 (1975).
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