JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כתב יד זה מתאר פרוטוקולים סטנדרטיים למדידת hyperphosphorylation טאו, מדידת מחייב טאו microtubules, לוקליזציה של טאו תאיים בעקבות טיפולים תרופות. פרוטוקולים אלה ניתן להשתמש שוב ושוב לסינון סמים או תרכובות אחרות המכוונות איגוד hyperphosphorylation או microtubule טאו.

Abstract

טאו חלבונים הקשורים microtubule הוא חלבון עצביים רגישה בעיקר ב אקסונים. בדרך כלל טאו הוא חיוני לתפקוד נורמלי עצביים מכיוון מעורב microtubule הרכבה, מייצב. מלבד הנוירונים, טאו מתבטא בשד האנושי, הערמונית, קיבה, המעי הגס, סרטן הלבלב איפה זה מציג מבנה דומה כמעט ולא מפעילה פונקציות דומות כמו טאו עצביים. הסכום של טאו שלה זרחון יכול לשנות את תפקידה בתור מייצב של microtubules ולאחר להוביל להתפתחות של חוטים לוליינית לזווג הפרעות ניווניות שונות, כגון מחלת אלצהיימר. קביעת המדינה זירחון של טאו ומאפייניה microtubule מחייב חשוב. בנוסף, בחינת ההתאמה תאיים של טאו היא חשובה מחלות שונות. זה כתב היד פרטים פרוטוקולים סטנדרטיים עבור מדידת זרחון טאו טאו מחייב microtubules בתאי סרטן המעי הגס עם או בלי כורכומין וטיפול LiCl. טיפולים אלה יכולים לשמש כדי לעצור את התפשטות תאים סרטן ופיתוח. לוקליזציה תאיים של טאו נבדק על-ידי שימוש אימונוהיסטוכימיה מיקרוסקופיה קונפוקלית תוך שימוש כמויות נמוכות של נוגדנים. מבחני אלה ניתן להשתמש שוב ושוב לסינון תרכובות המשפיעים על hyperphosphorylation טאו או microtubule מחייב. הריפוי משמש tauopathies שונים או סוכנים נגד סרטן הקשורים יכול באופן פוטנציאלי להתאפיין באמצעות פרוטוקולים אלה.

Introduction

טאו זוהה במקור בחום-היציב הקשורים microtubule חלבון זה היה מזוכך במשותף עם טובולין1. טאו מתבטא באופן בלעדי גבוה פרוקריוטים2,3,4. הפונקציה העיקרית של טאו היא לשלוט microtubule הרכבה1,5,6. זה גם תורם פלמור של microtubules7, תחבורה עצב8, שינויים בעצב בקוטר9, היווצרות נירומה קוטביות, הקשורים ניוון מוחיים10. טאו פועלת גם בדומה לפיגום חלבון כדי לשלוט איזה איתות המסלולים. עכברוש המוח מחקרים מראים את טאו הוא נוירון ספציפי, זה בעיקר. רגישה אקסונים11. מכיוון טאו הוא חיוני microtubule הפילמור ופיתוח עצביים, טאו היה שיערו לשחק תפקיד מרכזי בהתפתחות עצב במערכת העצבים המרכזית; השערה זו היה אח כ אומתה על ידי ניסויים במבחנה , ויוו . בנוסף הנוירונים, טאו מתבטא תאים שאינם עצביים שונים, כולל הכבד, הכליה שרירים תאים12,13. טאו, מתבטאת גם אנושי השד, הערמונית, המעי הגס, קיבה, ו סרטן הלבלב תא קווים ורקמות14,15,16,17,18, 19. טאו נמצא גם הכללה-הגוף לומבגו כמו tubulofilaments מעוות הכללה גופות20.

טאו עשוי לבצע מספר שינויים post-translational. של כל השינויים post-translational, זרחון היא הנפוצה ביותר. טאו מוגברת זרחון מקטין את האהדה microtubules, בסופו של דבר יציב את שלד התא. אתרי זירחון 85 תוארו חלבון טאו מבודד ברקמות המוח האנושי מחלת אלצהיימר. האתרים האלה 53% מהווים סרין טראונין 41%, רק 6% טירוזין שאריות21,22,23. טאו זרחון משפיעה על לוקליזציה שלה, פונקציה, איגוד, המסיסות, והרגישות שלו כדי שינויים post-translational אחרים. גם טאו זירחון כדי יותר במידה נורמלית (או רווי לחלוטין עם קבוצות פוספט) המכונה hyperphosphorylation משכפל מאפיינים מבניים ופונקציונליים של מחלת האלצהיימר24. טאו שומר על התפקוד התקין של microtubules עצב ומבטיחה לתפקוד תקין עצביים בתנאים פיזיולוגיים. עם זאת, טאו hyperphosphorylated מצליח לשמור על איגוד microtubule מאורגן היטב, גרימת הפסד עצביים בגלל microtubule פירוק. רמות נורמליות של טאו זרחון נדרשים עבור טאו תקין בתפקוד, אך טאו לא יצליח לתפקד באופן נורמלי, אם רמת זירחון האופייני שלו היא שונה, ואם זה hyperphosphorylated25. מחלת אלצהיימר, הפרעות ניווניות הקשורות לגיל אחרים, טאו הופך hyperphosphorylated, יוצר חוטים לוליינית לזווג בין קשרים neurofibrillary26,27. לכן, שיטות לקביעת טאו זרחון ואיגוד microtubule חשובים.

סרטן המעי הגס, סרטן הקשורים להזדקנות, הוא שהשלישי מרבה אובחן סרטן וסרטן את השלישי בולטים גורמי המוות עבור גברים ונשים כאחד28. סרטן המעי הגס הוא אחד של סרטן סיבת המוות העיקרית העולם המערבי29. כי סרטן המעי הגס וגם מחלת אלצהיימר קשורים עם ההזדקנות ובמקרה שניהם בעיקר במדינות המפותחות בה אנשים נהנים הרגלי התזונה דומה, ייתכן ושתי המחלות איכשהו בקורלציה. בנוסף, תאים סרטניים טאו-חיוביים ושליליים -טאו להגיב באופן שונה על סוכנים כימותרפיות, למשל, פקליטקסל16.

כורכומין הוא אחד נגזרות הראשי של כורכום longa, כורכום תבלין הודי30. במשך מאות שנים, אוכלוסיות בדרום אסיה יש לצרוך כורכום בדיאטה שלהם על בסיס יומי. כורכומין משמש לטיפול במחלות שונות, כולל סרטן המעי הגס, מחלת אלצהיימר, סוכרת, סיסטיק פיברוזיס, מחלות מעי דלקתיות, דלקת פרקים, היפרליפידמיה, טרשת עורקים, מחלת לב איסכמית31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. ליתיום יכול גם להרוג תאים סרטן המעי הגס או למנוע את התפשטות39. ליתיום יכול לשמש גם לטיפול מחלת אלצהיימר40 כפי שהוא מקטין צבירת טאו מונע hyperphosphorylation שלה, כפי שנצפתה על העכבר הטרנסגניים דגם41,42,43, 44.

כתב יד זה שואף: 1) למדוד את טאו הכולל ואת רמות ביטוי פוספו-טאו בתאים שטופלו; 2) לתאר וזמינותו פוספטאז למדוד זרחון טאו הכללית; 3) לבחון microtubule-איגוד של טאו; . ו-4) בתרגום טאו מאת מיקרוסקופיה קונפוקלית בשורות תאים סרטן המעי הגס, מטופלים עם כורכומין או LiCl. תוצאות חושפים כי טיפול תאי עם כורכומין, אשר הוא סוכן טוב כביכול כימותרפיות לסרטן המעי הגס, טיפול עם LiCl יכול להפחית את הביטוי של טאו הכולל שני, phosphorylated טאו בשורות תאים סרטן המעי הגס. טיפולים אלה יכול גם לגרום רוברטסונית הגרעין של טאו. עם זאת, באופן בלתי צפוי, כורכומין נכשל לשפר את הכריכה של טאו כדי microtubules.

Protocol

1. הכנה של ריאגנטים

µL
  1. µL להוסיף 10 בפתרון פלואוריד phenylmethylsulfonyl (1 מ מ), 10 (1 x 100 x מניות) של פתרון קוקטייל של מעכבי פרוטאז, µL 10 (1 x 100 x מניות) של פוספטאז פתרון קוקטייל מעכב 1 מ"ל 1 x radioimmunoprecipitation assay (ריפה) המאגר כדי להכין מאגר שלם של פירוק ריפה.
  2. הכן 10 x טובולין כללי מאגר (PEM) מאגר.
    1. הוסף 800 מ מ (6.0474 g) piperazine-N-N ' - bis - 2-ethanesulfonic חומצה 10 מ מ (95.1 מ ג) אתילן גליקול-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N ', N '-tetraacetic חומצה, 10 מ מ (51 מ ג) MgCl 2 ו- 1.25 מ' (3 מ"ל של 10 מ') NaOH בשפופרת 50-mL , לערבב עם מים מזוקקים 15 מ"ל, לפזר על-ידי שימוש מערבולת. בדוק את ה-pH (צריך להיות 6.9). אם ה-pH > 6.9, לבטל את המאגר, מהדורה מחודשת הרבה טריים.
      הערה: NaOH צריך להיות מתחת 1.25 מ' כדי להבטיח שאת ה-pH לא להחטיא 6.9. לא מומלץ להשתמש HCl להתאמת pH > 6.9.
    2. הוסף NaOH dropwise עד ה-pH הוא 6.9. להוסיף מים מזוקקים כדי להפוך עד 25 מ של מאגר X PEM 10. לבסוף, לסנן באמצעות מזרק ומסנן מזרק 0.2 µm. לחלק את המאגר aliquots 1.5 mL צינורות ולאחסן ב-4 מעלות צלזיוס
  3. הכן 5 x מדגם מאגר עם הסוכן צמצום וצבע. µL
    1. מיקס 300 (60 מ מ) של 1 מ' טריס-HCl (pH 6.8), 2.5 מ ל (25%) של 50% גליצרול, 1 מ"ל (2%) של 10% dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות) ומים 1.2 מ"ל מזוקקים כדי לפצות 5 מיליליטר 5 x מרחביות דוגמת המאגר. חנות − 20 ° C
      הערה: מכיוון גליצרול צמיגה, מדידת 1.25 mL גליצרול קשה. ML אחת של גליצרול 100% שוקל גרם 1.26. לפיכך, שוקל גרם 1.575 של 100% גליצרול (אשר שווה ל- mL 1.25 של 100% או 2.5 מ של גליצרול 50%) ב 15 מ"ל צינור ראשון; מערבבים היטב עם רכיבים אחרים.

2. תא תרבות, וטיפול עם כורכומין או טיפול LiCl, בדיקה של ביטוי חלבון

  1. הוסף ~ 1 x 10 תאים 6 של HCT 116 לתוך 100 מ מראגנטים מנות המכיל את המינימום חיוני מדיה (MEM) בתוספת 10% שור עוברית סרום (FBS), 1% פניצילין-סטרפטומיצין. אחרי יום אחד של culturing, תאים יגיעו למפגש 60-70%-
    הערה: מספר לוחות הדרושים תלוי מספר הטיפולים המתוארים להלן.
  2. כאשר תאים להגיע למפגש ~ 65% (לקרב את ערכיהן באמצעות מיקרוסקופ), להסיר את המדיום MEM שיושלם ולהוסיף ללא סרום MEM עם 5 מיקרומטר, 10 מיקרומטר, ו 30 מיקרומטר כורכומין או 25 מ מ, 50 מ מ 100 מ מ LiCl. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה באווירה humidified, המכילה 5% CO 2.
  3. 24 שעות לאחר הטיפול, לשטוף את התאים עם 1 מ"ל כקרח באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), לגרד את התאים באמצעות המגרד של התא. העברת התאים שרוטים 1.5 mL צנטריפוגה צינורות, צנטריפוגה במשך 4 דקות ב- 1,800 x g ב- 4 ° C כדי להשיג כדורי תא.
  4. Lyse התאים על ידי השעיית כדורי ב- 100 µL מאגר ריפה מלאה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בעת ההקשה באופן קבוע הצינורות. Sonicate את הדגימות בקצרה.
  5. Centrifuge את homogenates תא ומפרידה benchtop ב 22,570 x g למשך 20 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס. להעביר את supernatants אחרים צינורות עם תוויות באמצעות פיפטה של.
  6. למדוד ריכוז חלבון ב supernatants על ידי שיטת ברדפורד 45 באמצעות ערכות מסחריות-שיטת.
  7. הכן דוגמאות ריכוז חלבון שווה (10 µg חלבון/13 µL לדוגמה) של תאים lysates עם 4 X מרחביות ג'ל-טעינת מאגר. מוכן 4 x מרחביות ג'ל-טעינת מאגר טריים המכילים 400 מ dithiothreitol (DTT).
    הערה: בשלב זה, דוגמאות שניתן לאחסן ב − 20 ° C במידת הצורך.
  8. Incubate הדגימות על גוש חום ב 100 מעלות צלזיוס במשך 5 דק לערבב את הדגימות באמצעות מערבולת, לחכות כדי לקרר אותם עבור ~ 10-15 דקות
  9. להרכיב מערכת אלקטרופורזה.
    1. µG 10 עומס חלבון (דוגמה µL 13) ליום טוב-10% מרחביות-לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (מרחביות-עמוד). לטעון את הסולם משקל מולקולרי על גבי הג'ל ליין אחד.
      הערה: כפי אלקטרופורזה מתחיל, הסולם חלבון יפתור לתוך להקות חלבון של משקולות מולקולרית נראית לעין. להשתמש הלהקות האלה כדי לאמוד את המשקולות מולקולרית של להקות חלבון לא ידוע.
    2. לאחר טעינת הדגימות, חיבור האלקטרודות חיוביים ושליליים של מערכת אלקטרופורזה למקור כוח לשמור על מתח קבוע. בתחילה, התחל להעביר את דגימות חלבון בג'ל הערימה לתוך הג'ל פתרון 70 V עבור 20 דקות. לאחר מכן, תגביר את המתח ל 125 V כ 70-120 דקות עד הסולם חלבון ודוגמאות להגיע לסוף של הג'ל.
    3. לאחר השלמת אלקטרופורזה, להעביר את הג'ל קרום difluoride (PVDF) polyvinylidene באמצעות מערכת electroblotting רטוב. העברת ~ 100 דקות ב-100 נ' בלוק הקרום במאגר חסימה 4% אלבומין שור (BSA), במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר בסביבות 25 מעלות צלזיוס
  10. לסמן את האבן החשופה על ידי חיתוך זה בצד עם הסולם משקל מולקולרי. להשתמש סדין פלסטיק שקוף וחותך חדה חותכים את האבן החשופה. להכין את הפתרונות ראשי-נוגדנים (אנטי-טאו-1:5, 000; אנטי-פוספו-טאו-1:4, 000), דגירה את האבן החשופה בפתרון זה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  11. לאחר דגירה לילה, לשטוף את האבן החשופה למשך 7 דקות ארבע פעמים בפתרון באגירה פוספט תמיסת מלח-Tween-20 (PBST).
  12. להכין את הפתרונות משנית-נוגדן הרלוונטיים (ארנב נגד עז או העכבר אנטי איג-1:5, 000), דגירה את האבן החשופה בפתרון זה במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר כ-25 מעלות צלזיוס. לרחוץ PBST ארבע פעמים, 7 דקות כל אחד.
  13. לפתח את האבן החשופה באמצעות ערכת chemiluminescence על פי היצרן ' s המלצות. מכסים את האבן החשופה באמצעות ללאפה פלסטיק שקוף. לרכוש תמונות על-ידי chemiluminescence מערכת עבור chemiluminescence עם תוכנה רלוונטי הדמיה-

3. פוספטאז Assay

  1. לפנק את lysates תא (מתוך שלב 2.5) עם phosphatase אלקליין המאגר phosphatase אלקליין.
    1. עבור שניהם לשלוט ולהכין דגימות שטופלו, 20 µL דוגמיות המכילה חלבון הכולל 20 µg. הוסף את עוצמת הקול של lysates תא המכיל 20 חלבון הכולל µg, ואחריו 2 מאגר phosphatase אלקליין µL, phosphatase אלקליין 10 µL. להוסיף מים מזוקקים כדי לפצות 20 µL-
  2. דגירה בדגימות ב 37 ° C עבור ה 1 להפסיק את התגובה על ידי הוספת חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ריכוז סופי של 50 מ מ, או על-ידי הוספת orthovanadate נתרן (Na 3 VO 4)-ריכוז סופי של 10 מ מ. גם ניתן לעצור את התגובה על ידי חימום ב 75 מעלות צלזיוס במשך 5 דק
  3. לפני הדגירה של דגימות עם פוספטאז מסיים, הכנת דוגמאות של ריכוז זהה ללא הוספת פוספטאז להשוואה עם דגימות שטופלו פוספטאז.
  4. הוסף 4 שזה עתה הוכנו X מרחביות ג'ל-טעינת מאגר המכיל 400 מ DTT.
  5. דגירה בדגימות על גוש חום ב 100 מעלות צלזיוס במשך 5 דק לערבב הדגימות באמצעות מערבולת. מגניב בטמפרטורת החדר במשך ~ 10-15 דקות
  6. להרכיב מערכת אלקטרופורזה להפעלת ג'ל לזיהוי 10% על ידי עמודים מרחביות.
    1. µG 10 עומס חלבון (דוגמה µL 13) ליום טוב על polyacry 10%lamide ג'ל. לטעון את הסולם משקל מולקולרי.
    2. לאחר טעינה הדגימה, חיבור האלקטרודות חיוביים ושליליים של מערכת אלקטרופורזה למקור כוח לשמור על מתח קבוע. בתחילה, התחל להעביר את דגימות חלבון בג'ל הערימה לתוך הג'ל פתרון 70 V עבור 20 דקות. לאחר מכן, תגביר את המתח ל 125 V ולהפעיל את הג'ל כ- 70-120 דקות עד הסולם חלבון ודוגמאות להגיע לסוף של הג'ל.
    3. לאחר השלמת אלקטרופורזה, להעביר את הג'ל על גבי קרום PVDF באמצעות מערכת electroblotting רטוב. העברת ~ 100 דקות ב-100 נ'
    4. לסמן את האבן החשופה על-ידי הפיכת קטן חתוך בצד הסולם משקל מולקולרי. להשתמש סדין פלסטיק שקוף וחותך חדה חותכים את האבן החשופה.
  7. לחסום את הקרום במאגר 4% BSA חסימה למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. דגירה את האבן החשופה בפתרון הראשי-נוגדנים (אנטי-טאו-1:5, 000) ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לשטוף את האבן החשופה ב PBST ארבע פעמים, במשך 7 דקות כל אחד.
  9. להכין את הפתרון משנית-נוגדן הרלוונטיים (עז אנטי עכבר IgG-1:5, 000), דגירה את האבן החשופה למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר. לכבס במים PBST ארבע פעמים, במשך 7 דקות כל אחד.
  10. לפתח את האבן החשופה באמצעות ערכת chemiluminescence על פי היצרן ' s המלצות. מכסים את האבן החשופה בתוך ללאפה פלסטיק שקוף. לרכוש תמונות על-ידי chemiluminescence מערכת עבור chemiluminescence עם תוכנה רלוונטי הדמיה-

4. מחייב microtubule Assay

  1. עבור microtubule איגוד וזמינותו, חזור על השלבים 2.1-2.6.
  2. הכן 1 X (2 מ"ל) PEM מאגר מהמאגר X PEM 10 מאוחסן ב 4 ° C על-ידי הוספת 20 מיקרומטר (40 µL) פקליטקסל ל GTP (20 µL) 1 מ מ. . קח microtubule מניות (MT) מ − מקפיא 80 ° C ו- e. coli טאו עובד המניה מ − מקפיא 20 ° C.
  3. הכין דוגמיות לפי טבלה 1-
  4. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות Ultracentrifuge 25 ° c עבור 60 דקות ב 100,000 x g.
  5. µL 120 העברה של supernatants המכילה לא מאוגדים טאו, לנקות ומתויגים צינורות.
  6. µL להוסיף 120 (באותו אמצעי אחסון כמו תגובת שיקוע) של 5 X לטעום המאגר כדי בגדר המכיל טאו מאוגד ומערבבים ביסודיות. העברת הפתרון כדי לנקות צינורות שכותרתו ומערבבים היטב.
  7. מודדים את ריכוז חלבון (ראה שלב 2.6).
    הערה: בעת הכנת דוגמאות, להשתמש באמצעי האחסון של פתרון (שלב 4.6) עבור הכנת דוגמאות צניפה והן תגובת שיקוע.
  8. הכין דוגמיות של ריכוז החלבון המקביל ולהוסיף 4 שזה עתה הוכנו x מרחביות ג'ל-טעינת מאגר המכיל DTT (400 מ מ)-
    הערה: הדוגמאות שניתן לאחסן ב − 20 ° C בשלב זה.
  9. חזור על השלבים 3.5-3.10.
< td colspan = " 2">
מדגם שם Microtubule הדרושים ראשי חלבון הדרוש PEM-GTP-PTX
1 של HCT 116-Control (6.21 μg/μl) 2 μl 9.66 μl (60 μg) 108.34 μl
2 μM 116-כורכומין 10 של HCT (4.81 μg/μl) 2 μl 16.63 μl (80 μg) 101.37 μl
3 של HCT 116-כורכומין 20 μM (3.28 μg/μl) 2 μl μl 30.49 (100 μg) 87.51 μl
4 של HCT 116-LiCl 25 מ מ (5.43 μg/μl) 18.42 μl (100 μg) 2 μl 99.58 μl
5 טאו e. coli 2 μl 1 μl טאו-352 117 μl
6 MT רק 2 μl X 118 μl
120 μl

טבלה 1: לטעום הכנה microtubule-איגוד וזמינותו.

5. לוקליזציה, ביטוי של טאו לאחר טיפול של תאים עם כורכומין

  1. coverslip באמצעות אתנול 70% יבש ונקי בעזרת טישו מעבדה. הכנס coverslip יחיד של כל טוב של צלחת שכותרתו 6-ובכן-תרביות רקמה. מניחים את הצלחת על בטיחות ביולוגית ארון ולעבור על אולטרה אור במשך לפחות 3 ח'
  2. תת-תרבות התאים ואת הזרעים אותם לתוך הבארות הרלוונטיים של צלחת 6-ובכן-2.5 x 10 5 תאים/היטב במדיום תרבות מומלצים-
  3. לאחר ~ 24 h, לבחון את התאים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה באמצעות ה-10 X והן מטרות X 40 כדי לבדוק שינויים מורפולוגיים הסלולר. להקליט תמונות אם יש צורך.
  4. לשטוף את התאים פעמיים באמצעות PBS. לתקן את התאים בפורמלין 3.7% בחממה 37 ° C בחושך.
    הערה: קיבוע באמצעות פורמלין בטמפרטורת החדר, גם עובד. ללבוש ציוד מגן אישי המתאים בעת טיפול פורמלדהיד.
  5. לרחוץ את התאים ב- PBS. לתקן תאים מתנול כקרח-− 20 ° C במשך 15 דקות Permeabilize התאים על ידי המקננת בהם BSA 3% ו- 0.1% X-100 Triton ב- PBS בקרח במשך 10 דקות לשטוף את התאים עם PBS.
  6. דגירה התאים במאגר חסימה (BSA 3% ו- 0.1% Tween-20 בפתרון PBS) לשעה בטמפרטורת החדר.
    הערה: הדגירה עבור 2 h ב 4 ° C, גם עובד.
  7. להכין את הפתרון העיקרי-נוגדנים (אנטי-טאו-1:200) BSA 3% ו- 0.1% Tween-20 ב- PBS (למשל, 2 µL טאו-13 נוגדן במאגר 0.4 mL).
  8. לחתוך חתיכות קטנות של PVDF ממברנה כך החלקים התאימו כראוי בתוך כל טוב של צלחת 6-טוב; להשרות אותם במים למשך 5 דק מקום החתך PVDF היטב לכל.
  9. µL להוסיף 60 נוגדן ראשוני לפתרון החתך PVDF חתיכות מכל קידוח. מניחים את coverslips כך התאים יכולה לגעת הפתרון העיקרי-נוגדן. דגירה ב 4 ° C בחדר חשוך, לח בין לילה. לרחוץ ב- PBS ארבע פעמים.
  10. להכין את הפתרון המשני-נוגדנים (fluorescein מצומדת 594 אנטי עכבר IgG-1:400) BSA 3% ו- 0.1% Tween-20 ב- PBS.
  11. לחתוך חתיכות קטנות של קרום PVDF כך החלקים שיתאים כראוי כל טוב של צלחת 6-ובכן, להשרות אותם במים למשך 5 דק מקום החתך PVDF היטב לכל.
  12. 80 להוסיף µL של הפתרון המשני-נוגדן כל אחד מהחלקים PVDF בצלחת 6-. טוב. מניחים את coverslip כך התאים יכולה לגעת הפתרון המשני-נוגדן. דגירה בחדר חשוך, לחים בטמפרטורת החדר במשך 2 ח' לשטוף עם PBS ארבע פעמים.
  13. הר דגימות במדיום הרכבה עם 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) ולקבוע coverslips בשקופיות זכוכית-
    1. הוסף אחד טיפה של המדיום הרכבה עם דאפי בשקופיות זכוכית. הסר את coverslips מכל קידוח ומניחים בשקופיות זכוכית המכיל המדיום הרכבה עם דאפי. להבטיח כי פני השטח של כל coverslip המכיל תאים מוכתם נוגע אני הולך לשחקטינג בינוני בשקופית זכוכית המתאים.
    2. החל לק לציפורניים מסביב לכל coverslip חותם ולתקן אותם אטום בשקופיות זכוכית. במידת הצורך, לבצע שלב זה פעמיים.
  14. Incubate עבור h 1.5 בטמפרטורת החדר בחדר חשוך.
  15. לבחון את השקופיות בעזרת מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות טבילה שמן coverslip בחדר חשוך.

תוצאות

ביטוי הכולל טאו טאו פוספו נבדקה לאחר טיפול תאי עם ריכוזים שונים של כורכומין או LiCl (איור 1). טיפול של תאים עם שלושה ריכוזים שונים של כורכומין ירד טאו רמות הביטוי; עם זאת, הביטוי פוספו-טאו מוגברת בעת טיפול עם ריכוז נמוך של כורכומין אך ירד על טיפול תאים עם ריכוז ...

Discussion

כתב יד זה הוקמה תנאים פרוצדורליים שונים לגילוי טאו הכולל ואת phosphorylated טאו בתאי סרטן המעי הגס שטופלו כורכומין, LiCl. כדי להעריך את המצב זרחון הכוללת של טאו בדגימות חלבון, תוארה של assay פוספטאז. Assay הזה יכול לשמש באופן פוטנציאלי כדי לבחון את המצב זירחון של כל חלבון.

Assay זו מבוססת על ה...

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם כלום לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה בוצע כפי חלק מהפרוייקט שכותרתו 'פיתוח ו ה תיעוש של חומרי גלם קוסמטיים ערך גבוה מ microalgae ימית', ממומן על ידי משרד של אוקיינוסים, חלוצת, קוריאה, נתמך על ידי מענק מגזר (2Z04930) ממוסד KIST Gangneung של מוצרים טבעיים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
HCT 116 cellATCCCCL-247
MEM (EBSS)HycloneSH30024.01
Fetal Bovine Serum (FBS)ThermoFisher (Gibco)16000044Store at -20 °C
penicillin-streptomycinHycloneSV30010
Trypsin-EDTA solutionWelGeneLS 015-01
100 mm dishCorning430161
6 well plateCorningCoster 3516
Anti-Tau 13 antibodyabcamab19030
Dithiothreitol (DTT)Roche10 708 984 001Storage Temperature 2–8 °C
Microlitre CentrifugesHettich ZentrifugenMIKRO 200 R
PaclitaxelSigma-AldrichT1912Storage Temperature 2–8 °C
CurcuminSigma-Aldrich (Fluka)78246Storage Temperature 2–8 °C
Microtubules (MT)CytoskeletonMT001Store at 4 °C (desiccated)
Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200Store at 4 °C in the dark
Sodium hydroxideSigma72068
Magnesium ChlorideSigma-AldrichM2670
GTPSigma-AldrichG8877Store at -20 °C
DPBSWelGeneLB 001-02
Sonic DismembratorFisher ScientificModel 500
UltracentrifugeBeckman CoulterOptima L-100 XP
PIPESSigmaP1851
Bovine serum Albumin (BSA)SigmaA7906
Molecular ImagerBio-RadChemiDoc XRS+Store at 4 °C
Protein assay dye reagentBio-Rad500-0006
α-tubulin (11H10) Rabbit mAbCell signalling2125
GAPDH (14C10) Rabbit mAbCell signalling2118
Anti-Tau (phospho S396) antibodyabcamab109390
EGTASigmaE3889Store at room temperature
FastAP Thermosensitive Alkaline PhosphataseThermo ScientificEF0651Store at -20 °C
PMSFSigmaP7626Store at room temperature
Phosphatase Inhibitor CocktailCell Signalling5870Store at 4 °C
Protease Inhibitor CocktailCell Signalling5871Store at 4 °C
RIPA BufferSigmaR 0278Storage Temperature 2–8 °C
Tau-352 humanSigmaT 9950Store at -20 °C
Triton X-100 Sigma-AldrichX - 100Store at around 25 °C
PVDF membraneBio-Rad162-0177
Goat anti-mouse IgG Secondary AntibodyThermoFisherA-11005Store at 4 °C in the dark
Confocal MicroscopyLeica MicrosystemLeica TCS SP5
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Affymetrix75819
Protein AssayBio-Rad500-0006Store at 4 °C

References

  1. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1858-1862 (1975).
  2. Cambiazo, V., Gonzalez, M., Maccioni, R. B. DMAP-85: a tau-like protein from Drosophila melanogaster larvae. J Neurochem. 64, 1288-1297 (1995).
  3. Goedert, M., et al. PTL-1, a microtubule-associated protein with tau-like repeats from the nematode Caenorhabditis elegans. J Cell Sci. 109 (Pt 11), 2661-2672 (1996).
  4. Goedert, M., Spillantini, M. G., Jakes, R., Rutherford, D., Crowther, R. A. Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease. Neuron. 3, 519-526 (1989).
  5. Cleveland, D. W., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. Purification of tau, a microtubule-associated protein that induces assembly of microtubules from purified tubulin. J Mol Biol. 116, 207-225 (1977).
  6. Fellous, A., Francon, J., Lennon, A. M., Nunez, J. Microtubule assembly in vitro. Purification of assembly-promoting factors. Eur J Biochem. 78, 167-174 (1977).
  7. Witman, G. B., Cleveland, D. W., Weingarten, M. D., Kirschner, M. W. Tubulin requires tau for growth onto microtubule initiating sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 73, 4070-4074 (1976).
  8. Dixit, R., Ross, J. L., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. Differential regulation of dynein and kinesin motor proteins by tau. Science. 319, 1086-1089 (2008).
  9. Harada, A., et al. Altered microtubule organization in small-calibre axons of mice lacking tau protein. Nature. 369, 488-491 (1994).
  10. Caceres, A., Kosik, K. S. Inhibition of neurite polarity by tau antisense oligonucleotides in primary cerebellar neurons. Nature. 343, 461-463 (1990).
  11. Binder, L. I., Frankfurter, A., Rebhun, L. I. The distribution of tau in the mammalian central nervous system. J Cell Biol. 101, 1371-1378 (1985).
  12. Gu, Y. J., Oyama, F., Ihara, Y. tau is widely expressed in rat tissues. J Neurochem. 67, 1235-1244 (1996).
  13. Kenner, L., et al. Expression of three- and four-repeat tau isoforms in mouse liver. Hepatology. 20, 1086-1089 (1994).
  14. Souter, S., Lee, G. Microtubule-associated protein tau in human prostate cancer cells: isoforms, phosphorylation, and interactions. J Cell Biochem. 108, 555-564 (2009).
  15. Sangrajrang, S., et al. Estramustine resistance correlates with tau over-expression in human prostatic carcinoma cells. Int J Cancer. 77, 626-631 (1998).
  16. Rouzier, R., et al. Microtubule-associated protein tau: a marker of paclitaxel sensitivity in breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8315-8320 (2005).
  17. Mimori, K., et al. Reduced tau expression in gastric cancer can identify candidates for successful paclitaxel treatment. Brit J Cancer. 94, 1894-1897 (2006).
  18. Jimeno, A., et al. Development of two novel benzoylphenylurea sulfur analogues and evidence that the microtubule-associated protein tau is predictive of their activity in pancreatic cancer. Mol Cancer Ther. 6, 1509-1516 (2007).
  19. Huda, M. N., Kim, D. H., Erdene-Ochir, E., Kim, Y. S., Pan, C. H. Expression, phosphorylation, localization, and microtubule binding of tau in colorectal cell lines. Appl Biol Chem. 59, 807-812 (2016).
  20. Askanas, V., Engel, W. K., Bilak, M., Alvarez, R. B., Selkoe, D. J. Twisted tubulofilaments of inclusion body myositis muscle resemble paired helical filaments of Alzheimer brain and contain hyperphosphorylated tau. The American journal of pathology. 144, 177-187 (1994).
  21. Buee, L., Bussiere, T., Buee-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res Brain Res Rev. 33, 95-130 (2000).
  22. Hanger, D. P., Anderton, B. H., Noble, W. Tau phosphorylation: the therapeutic challenge for neurodegenerative disease. Trends Mol Med. 15, 112-119 (2009).
  23. Sergeant, N., et al. Biochemistry of Tau in Alzheimer's disease and related neurological disorders. Expert Rev Proteomics. 5, 207-224 (2008).
  24. Fath, T., Eidenmuller, J., Brandt, R. Tau-mediated cytotoxicity in a pseudohyperphosphorylation model of Alzheimer's disease. J Neurosci. 22, 9733-9741 (2002).
  25. Kolarova, M., Garcia-Sierra, F., Bartos, A., Ricny, J., Ripova, D. Structure and pathology of tau protein in Alzheimer disease. Int J Alzheimers Dis. 2012, 731526 (2012).
  26. Kosik, K. S., Joachim, C. L., Selkoe, D. J. Microtubule-associated protein tau (tau) is a major antigenic component of paired helical filaments in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4044-4048 (1986).
  27. Wood, J. G., Mirra, S. S., Pollock, N. J., Binder, L. I. Neurofibrillary tangles of Alzheimer disease share antigenic determinants with the axonal microtubule-associated protein tau (tau). Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4040-4043 (1986).
  28. Jemal, A., et al. Cancer statistics, 2003. CA Cancer J Clin. 53, 5-26 (2003).
  29. Patel, V. B., Misra, S., Patel, B. B., Majumdar, A. P. Colorectal cancer: chemopreventive role of curcumin and resveratrol. Nutr Cancer. 62, 958-967 (2010).
  30. Lim, G. P., et al. The curry spice curcumin reduces oxidative damage and amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse. J Neurosci. 21, 8370-8377 (2001).
  31. Venkatesan, N. Curcumin attenuation of acute adriamycin myocardial toxicity in rats. Br J Pharmacol. 124, 425-427 (1998).
  32. Srinivasan, M. Effect of curcumin on blood sugar as seen in a diabetic subject. Indian J Med Sci. 26, 269-270 (1972).
  33. Deodhar, S. D., Sethi, R., Srimal, R. C. Preliminary study on antirheumatic activity of curcumin (diferuloyl methane). Indian J Med Res. 71, 632-634 (1980).
  34. Rao, C. V., Rivenson, A., Simi, B., Reddy, B. S. Chemoprevention of colon carcinogenesis by dietary curcumin, a naturally occurring plant phenolic compound. Cancer Res. 55, 259-266 (1995).
  35. Araujo, C. C., Leon, L. L. Biological activities of Curcuma longa L. Mem Inst Oswaldo Cruz. 96, 723-728 (2001).
  36. Lim, T. G., et al. Curcumin suppresses proliferation of colon cancer cells by targeting CDK2. Cancer Prev Res (Phila). 7, 466-474 (2014).
  37. Ringman, J. M., Frautschy, S. A., Cole, G. M., Masterman, D. L., Cummings, J. L. A potential role of the curry spice curcumin in Alzheimer's disease. Curr Alzheimer Res. 2, 131-136 (2005).
  38. Li, H., et al. Lithium chloride suppresses colorectal cancer cell survival and proliferation through ROS/GSK-3beta/NF-kappaB signaling pathway. Oxid Med Cell Longev. , 241864 (2014).
  39. Forlenza, O. V., De-Paula, V. J., Diniz, B. S. Neuroprotective effects of lithium: implications for the treatment of Alzheimer's disease and related neurodegenerative disorders. ACS Chem Neurosci. 5, 443-450 (2014).
  40. Noble, W., et al. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by lithium correlates with reduced tauopathy and degeneration in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6990-6995 (2005).
  41. Perez, M., Hernandez, F., Lim, F., Diaz-Nido, J., Avila, J. Chronic lithium treatment decreases mutant tau protein aggregation in a transgenic mouse model. J Alzheimers Dis. 5, 301-308 (2003).
  42. Engel, T., Goni-Oliver, P., Lucas, J. J., Avila, J., Hernandez, F. Chronic lithium administration to FTDP-17 tau and GSK-3beta overexpressing mice prevents tau hyperphosphorylation and neurofibrillary tangle formation, but pre-formed neurofibrillary tangles do not revert. J Neurochem. 99, 1445-1455 (2006).
  43. Caccamo, A., Oddo, S., Tran, L. X., LaFerla, F. M. Lithium reduces tau phosphorylation but not A beta or working memory deficits in a transgenic model with both plaques and tangles. Am J Pathol. 170, 1669-1675 (2007).
  44. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  45. Gupta, K. K., Bharne, S. S., Rathinasamy, K., Naik, N. R., Panda, D. Dietary antioxidant curcumin inhibits microtubule assembly through tubulin binding. FEBS J. 273, 5320-5332 (2006).
  46. Lee, J. W., Park, S., Kim, S. Y., Um, S. H., Moon, E. Y. Curcumin hampers the antitumor effect of vinblastine via the inhibition of microtubule dynamics and mitochondrial membrane potential in HeLa cervical cancer cells. Phytomedicine. 23, 705-713 (2016).
  47. Liu, F., et al. Site-specific effects of tau phosphorylation on its microtubule assembly activity and self-aggregation. Eur J Neurosci. 26, 3429-3436 (2007).
  48. Sultan, A., et al. Nuclear tau, a key player in neuronal DNA protection. J Biol Chem. 286, 4566-4575 (2011).
  49. Bukar Maina, M., Al-Hilaly, Y. K., Serpell, L. C. Nuclear Tau and Its Potential Role in Alzheimer's Disease. Biomolecules. 6, 9 (2016).
  50. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9, 790-803 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

128tauopathymicrotubules

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved