أسلوب لوصف امبريوجينيسيس في نبات

Jinlin Feng; Ligeng Ma

doi:10.3791/55969

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

ويحدد هذا البروتوكول وسيلة لمراقبة امبريوجينيسيس في نبات عن طريق إزالة ovule متبوعاً بالتفتيش على تشكيل نمط الجنين تحت مجهر.

Abstract

نظراً لطبيعة شديدة يمكن التنبؤ بها لتنميتها، استخدمت أجنة نبات كنموذج للدراسات morphogenesis في النباتات. ولكن الأجنة النباتية المرحلة المبكرة الصغيرة وتحتوي على بعض الخلايا، مما يجعل من الصعب مراقبة وتحليل. يتم وصف أسلوب هنا لوصف تشكيل نمط في الأجنة النباتية تحت مجهر باستخدام نموذج الكائن الحي نبات. بعد إزالة البويضات الطازجة الحل هوير باستخدام، يمكن ملاحظة مورفولوجيا الأجنة وعدد الخلايا في، ومرحلة إنمائية يمكن أن تحددها التدخل التفاضلية تباين مجهرية باستخدام 100 × النفط غمر عدسة. وبالإضافة إلى ذلك، تم رصد التعبير عن البروتينات علامة محددة معلم مع أخضر نيون البروتين (التجارة والنقل) لإضافة تعليق توضيحي مواصفات هوية الخلية أثناء الزخرفة الجنين بالليزر [كنفوكل] الفحص المجهري. وهكذا، يمكن استخدام هذا الأسلوب لمراقبة تشكيل نمط في الأجنة النباتية البرية من نوع المستويات الخلوية والجزيئية، وتلخص الدور جينات محددة في الزخرفة الجنين بمقارنة تشكيل نمط في الأجنة من النباتات البرية من نوع وطفرات الجنين الفتاكة. ولذلك، يمكن استخدام الأسلوب تميز embryogenesis في نبات.

Introduction

امبريوجينيسيس هو الحدث أقرب في أعلى النبات التنمية. أشكال جنين ناضجة من الزيجوت عن طريق انقسام الخلايا وتمايزها تحت رقابة صارمة على الوراثية¹^،². أجنة نبات نموذجا مفيداً لدراسة مراقبة morphogenesis لأنه يتبع تسلسل انقسامات الخلية أثناء امبريوجينيسيس نمط المتوقع³^،⁴. ومع ذلك، جنين نبات يحتوي على واحد إلى عدة خلايا صغير جداً مراعاتها وتحليلها. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يسبب الطفرة لبعض الجينات الجنين الفتك⁵، مما يشير إلى الدور الرئيسي لتلك الجينات في امبريوجينيسيس. وصف تشكيل نمط في طفرات الجنين الفتاكة يوفر أساسا لفهم الآلية الجزيئية بموجبه تنظيم الجينات الأساسية تنمية الجنين.

يتم وصف طريقة مفصلة هنا لوصف تشكيل نمط الجنين في المصنع النموذجي نبات بالملاحظة المجهرية المباشرة. الأسلوب الذي ينطوي على إزالة ovule تليها المراقبة المجهرية للجنين. ويرد أيضا وصف المسخ الجنين الفتاكة.

يمكن تحديد مورفولوجية الأجنة في مراحل إنمائية مختلفة مباشرة عن طريق الفحص المجهري باستخدام البويضات التي أزيلت مع هوير لحل⁶^،⁷. هذه البويضات يحمل إنكسار عالية؛ وهكذا، ovule هذا مسح الأسلوب مفيد خاصة للعينات التي يجب مراعاتها قبل التدخل التفاضلية التباين (DIC) الفحص المجهري.

وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الجينات التي يتم التعبير عنها في خلية معينة أو عدد محدود من الخلايا أثناء embryogenesis كعلامات لتحديد الخلايا في جنين. ولذلك، يمكن المشروح مواصفات هوية الخلية أثناء امبريوجينيسيس عن طريق رصد التعبير عن البروتينات بروتينات فلورية خضراء معلم علامة باستخدام الليزر [كنفوكل] الفحص المجهري. على العكس من ذلك، مراقبة نمط التعبيرالتجارة والنقل الانصهار الجينات الوظيفية غير معروف-أثناء embryogenesis يمكن توفير ارتباط بين الجنين الزخرفة والتعبير عن ذلك الجين، وتيسير تحديد الجينات الجديدة التي مطلوبة من أجل امبريوجينيسيس في نبات.

يمكن أيضا استخدام الأسلوب الموصوفة هنا تميز النمط الظاهري المسخ الجنين الفتاكة، وتحديد أثر الجينات المتضررة على امبريوجينيسيس على المستوى الخلوي. وعلاوة على ذلك، في تركيبة مع مقارنة بين نمط التعبير للجينات ماركر خلال امبريوجينيسيس بين النباتات البرية من نوع ومتحولة، الطريقة يمكن أن تسفر عن أدلة حول الآليات الجزيئية ومسارات الإشارات المشتركة في امبريوجينيسيس⁸^،⁹. في الواقع، تم تطبيق الأسلوب للنباتات naa10 ، ووجد أن الشعبة غير طبيعي من النخامية في المسخ قد تنجم عن تغيير في توزيع اكسين خلال embryogenesis⁵.

Protocol

ملاحظة: هذا البروتوكول له ثلاثة أجزاء: 1) مراقبة تشكيل نمط في أجنة نبات البرية من نوع استخدام الفحص المجهري DIC؛ 2) تميز الجنين نمط تشكيل عن طريق مراقبة التعبير البروتين علامة باستخدام الليزر [كنفوكل] الفحص المجهري؛ و 3) تحديد دور جين معين في امبريوجينيسيس (باستخدام المسخ naa10 على سبيل مثال).

1-أبل المقاصة

إعداد المواد النباتية
ملاحظة: بروتوكول الموصوفة هنا مثال على كيفية زراعة النباتات صحية؛ طرق أخرى لزراعة النباتات صحية تعمل أيضا.
1. إضافة بذور 100 إلى أنبوب 1.5 مل ومن ثم أضف 1 مل من محلول هيبوكلوريت الصوديوم 1.5% (ميكس 15 مل كلور 10% مع 85 مل من الماء) لتعقيم بذور دقيقة 5 عكس الأنبوبة عدة مرات لضمان جيدا مختلطة لتعقيم بذور السطحية تماما بالبذور والحل.
2. قوة البذور إلى الجزء السفلي من الأنبوب بالطرد المركزي لمدة 30 ثانية في س 1,200 ز، إزالة المادة طافية، وتغسل البذور بالماء المعقم أربع مرات على مقاعد البدلاء لإزالة تحت كلوريت الصوديوم المتبقية.
3. إضافة 4.4 غ من خليط الملح القاعدي Murashige وسكوغ (مللي ثانية) و 10 غم من السكروز إلى 1 لتر الماء عالي النقاوة. يقلب الخليط لإذابة الأملاح والسكروز. ضبط الحل للأس الهيدروجيني 5.8 مع 1 م كوه، إضافة الجيل الثالث 3g عامل مجمد، مثل فيتاجيل، إلى حل مرض التصلب العصبي المتعدد-السكروز، وتعقيم الحل في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لجعل متوسط MS.
4. صب 30 مل الوسط مرض التصلب العصبي المتعدد في صحن 12-سم ثقافة لإنشاء لوحات متوسطة مرض التصلب العصبي المتعدد.
5. وضع بذور معقمة على لوحة مرض التصلب العصبي المتعدد. نقل اللوحة إلى دائرة نمو وإبقاء اللوحة تحت ظروف طويلة أيام (22 درجة مئوية ح 16 في الضوء و 18 درجة مئوية ح 8 في الظلام) بعد بذور التقسيم الطبقي (3 أيام في 4 درجات مئوية في الظلام).
6. بعد 8 أيام نمو، نقل النباتات للتربة (التربة الغنية بالمغذيات ميكس والفيرميكوليت بنسبة 1:1) في علبة وتغطي العلبة مع غطاء أبيض وشفاف لمدة 5 أيام لتجنب فقدان الماء، ويترك ثغرة لتجنب عمليات التزجيج النباتات.
7. تتخذ الغطاء قبالة الدرج وزراعة النباتات في حجرة حجرة تحت ظروف أيام طويلة (انظر 1.1.5). تبديل الضوء الساعة 06:00 ص وإيقاف الساعة 10:00 م. بعد حوالي 20 يوما نمو في قاعة حجرة، سوف يكون مزهر النباتات وإنتاج سيليكويس.
8. مارك يطارد براعم الزهور مع مؤشر ترابط في الموضع للبذور في نورات الساعة 08:00 م (لا تستخدم الأولى لبراعم الزهور الثالث؛ سيليكويس المتولدة من هذه البراعم الزهرة عادة وضع بذور إحباط عدد قليل، وهذا قد يغير نسبة طبيعية للبويضات غير طبيعي). تحديد بداية التلقيح ovule كما عند فتح برعم ملحوظ زهرة الساعة 08:00 ص في صباح اليوم التالي.
إعداد الحل هوير
1. إضافة 24 ز من كلورال هيدرات لأنبوب 50 مل ولف الأنبوب تماما مع رقائق الألومنيوم (حلول كلورال هيدرات ليست مستقرة تحت الضوء).
2. المقبل، بإضافة 9 مل من الماء عالي النقاوة و 3 مل من الجلسرين إلى الحل أعلاه ويهز أنبوب لإذابة هيدرات كلورال. لجعل الحل هوير، اسمحوا الأنبوب الوقوف بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة لإزالة أي فقاعات.
فصل ovule وإزالة الألغام
1. إرفاق قطعة من شريط لاصق الوجهين بشريحة زجاجية مجهر. ضع خردلة نمت للعدد المطلوب من أيام بعد التلقيح (حزب العمل الديمقراطي) على الشريحة مع بسيودوسيبتوم عمودي على السطح؛ هذا سيجعل من السهل تقسيم carpels (الأرقام 1A و 1B).
2. تقسيم كاربيلس على كلا الجانبين من بسيودوسيبتوم بإبرة محقن وإرفاق carpels تشريح اثنين إلى الشريحة حيث تكون البويضات في خردلة مرئية تحت ستيريوسكوبي (الأرقام 1 ود 1).
3. الاستغناء عن 70 ميليلتر من محلول هوير لعلى الشريحة الزجاجية، ومن ثم ترطيب غيض من زوج من ملاقط مقلوب غرامة مع الحل هوير بالغمس. تستخدم في ستيريوسكوبي، نقل البويضات إلى الحل هوير على الشريحة مع ملاقط لتنظيف الأجنة. تطبيق ساترة على الشريحة برفق لتجنب توليد أي فقاعات.
4. وضع الشريحة الانتهاء في مربع في غرفة مظلمة ح 2-12 (أكثر نضجاً ovule، ستكون هناك حاجة إلى مزيد من الوقت) في درجة حرارة الغرفة. ويمكن ملاحظة الأجنة في المرحلة 2/4-الخلية (1-2 مديرية إدارة السجون) مجهريا بعد ح 2، في حين يمكن ملاحظة الأجنة بين أوكتانت والمراحل المبكرة كروي (3 سماد) بعد ح 4. ويمكن ملاحظة أكثر نضجاً الأجنة (4-8 سماد) بعد 12 ساعة.
5. فحص البويضات تم مسحها باستخدام الدالة DIC مجهر. حدد الأجنة ضمن حقل طاقة منخفضة (10 X) ثم قم بتغيير إلى حقل عالية الطاقة (النفط غمر عدسة 100 X) لمراقبة نمط الخلوية في الأجنة المتقدمة النمو.
6. فحص الأجنة في مراحل إنمائية مختلفة.

2-توصيف الجنين الزخرفة وهوية الخلية عن طريق مراقبة تعبير البروتين علامة

تحضير المواد النباتية
1. استنساخ المروج والترميز تسلسل علامة عنصر استجابة الجينات أو الهرمونات والصمامات ثم أنه مع بروتين فلوري (مثل التجارة والنقل)؛ بعد ذلك، إدراج في البناء ناقلات ثنائية (مثل pCambia1300). هنا، عنصر الاستجابة اكسين DR5 يقدم ك مثال¹⁰.
2. إدخال بلازميد DR5-التجارة والنقل الناتجة عن النباتات البرية من نوع من توميفاسينس المتبعة-بوساطة تحويل¹¹. تحديد النباتات T1 باستخدام MS لوحات متوسطة الحجم التي تحتوي على هيجروميسين (50 ملغم/مل الخمور الأم، المخفف 1:1، 000). النباتات المعدلة وراثيا سوف يحمل جذور طويلة وتولد اثنين روزيت يترك بعد 8 أيام نمو في ظل الشروط الموضحة في 1.1.5.
3. نقل النباتات المعدلة وراثيا إلى التربة وزراعتها كما هو مبين في 1.1.6 و 1.1.7.
4. جمع بذور T2 من خطوط T1 مستقلة. بذر البذور في لوحات MS-هيجروميسين وتحديد النباتات تحمل نسخة واحدة من الإدراج DR5-التجارة والنقل (نسبة نباتات مقاومة للنباتات الحساسة سيكون تقريبا 3:1)، ونقلها إلى التربة.
5. زراعة النباتات T2 كما هو مبين في 1.1.6 و 1.1.7.
6. جمع بذور T3 من النباتات T2. بذر البذور في لوحات MS-هيجروميسين وتحديد النباتات المعدلة وراثيا متماثل (جميع النباتات من سطر واحد سوف يحمل المقاومة هيجروميسين)، ونقلها إلى التربة.
7. وضع علامة على براعم الزهور من النباتات T3 متماثل كما هو مبين في 1.1.8.
بروتينات فلورية خضراء إشارة المراقبة
1. خلط 3 مل الجلسرين مع 47 مل من الماء عالي النقاوة لإنشاء حل والغليسيرول 6%.
2. إرفاق قطعة من شريط لاصق الوجهين إلى شريحة الميكروسكوب زجاجية وإصلاح خردلة النحو المبين في 1.3.1.
3. تقسيم كاربيلس على كلا الجانبين من بسيودوسيبتوم بإبرة محقن وإرفاق carpels تشريح اثنين للشريحة تحت ستيريوسكوبي كما هو مبين في 1.3.2.
4. الاستغناء عن 30 ميليلتر من الجلسرين 6% على شريحة زجاجية ووضع كل من البويضات من carpels تشريح في الحل باستخدام الملقط مقلوب غرامة. ضع ساترة على الشريحة بلطف.
5. كما يمكن منع البذور معطف والسويداء في كل ovule مراقبة إشارات التجارة والنقل في الجنين، استخراج الجنين من أبل. انقر فوق الشريحة بسرعة و بلطف قذف الجنين من ovule (أكثر نضجاً ovule، ينبغي أن تطبق قوة أقل على الشريحة).
6. تفحص الشريحة للأسفار التجارة والنقل باستخدام الليزر [كنفوكل] الفحص المجهري. البحث عن الأجنة المعزولة تحت حقل طاقة منخفضة (10 X) وتسجيل مواقعها، ثم قم بتغيير إلى حقل عالية الطاقة (النفط غمر عدسة 100 X) لمراقبة التعبير DR5-التجارة والنقل في الأجنة بإعداد مصدر الضوء الإثارة إلى 488 نانومتر للكشف عن إشارة التجارة والنقل.
7. الكشف عن تعبير بروتينات فلورية خضراء في الأجنة لتحديد خط T3 مناسبة لمزيد من التحليل.

3. وصف تشكيل نمط الجنين في المسخ الجنين الفتاكة عن طريق إزالة Ovule وعلامة البروتين المراقبة: Naa10 كمثال

الزخرفة الجنين في نباتات متحولة naa10
1. إعداد المواد النباتية وكما هو مبين في 1.1.1-1.1.7.
2. تحديد naa10^{+ −} النباتات ببكر استخدام الجينات محددة كبسولة تفجير⁵، ومارك ثم براعم الزهور ل ناه10^{+ −} النباتات كما هو مبين في 1.1.8.
3. تؤدي إزالة ovule والفحص المجهري ل ناه10^{+ −} الأجنة كما هو مبين في 1.2 و 1.3.
تحليل البروتين علامة باستخدام أجنة naa10
1. الحصول على خطوط المعدلة وراثيا DR5-بروتينات فلورية خضراء مناسبة باستخدام الإجراء المبين في 2.1-2.2.
2. عبور خط DR5-التجارة والنقل المعدلة وراثيا متماثل مع ناه10^{+ −} المصنع للحصول على ناه10^{+ −} النباتات متماثل لعلامة fluorescence بروتينات فلورية خضراء في الجيل F2 (المعرفة بواسطة PCR الخاصة بالجينات) لوصف naa10^{+ −}⁵ ونلاحظ إشارة بروتينات فلورية خضراء تحت مجهر باستخدام خط DR5-بروتينات فلورية خضراء متماثل.
3. وضع علامة على براعم الزهور ل ناه10^{+ −} النباتات التي يتم متماثل التجارة والنقل DR5 كما هو مبين في 2.1.7.
4. البحث عن إشارة بروتينات فلورية خضراء في الأجنة naa10 التي متماثل التجارة والنقل DR5 كما هو مبين في 2.2.

النتائج

يمكن استخدام الطريقة الموضحة في هذه الورقة لمراقبة embryogenesis مباشرة تحت مجهر، وإضافة تعليق توضيحي لمواصفات هوية الخلية أثناء embryogenesis مع علامات محددة، وتلخص دور الجينات خاصة أثناء امبريوجينيسيس.

وتظهر نتائج تمثيلية من التحليل للجنين الزخر...

Discussion

إزالة ovule طريقة مفيدة للكشف عن انقسام الخلية وتقييم مورفولوجيا أثناء امبريوجينيسيس في نبات؛ باستخدام هذا الأسلوب، يمكن ملاحظة الأجنة مباشرة تحت المجهر DIC⁵^،¹². أن الخطوة الحاسمة لإزالة ovule خطوة 1.3.4. الوقت اللازم لإزالة أبل في الخطوة 1.3.4 متغير. يمكن ملاحظة ...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

ونشكر الدكتور جيسيكا حبشي لقراءة خطيرة من المخطوطة. ونشكر الدكتور Xianyong شنغ من مركز التصوير، كلية علوم الحياة، جامعة العاصمة للمعلمين (بيجين، الصين)، للقيام بترجمة الإنزيم DR5-التجارة والنقل . هذا العمل كان يدعمها المنح من "مؤسسة العلوم حكومة بلدية بكين" (CIT & TCD20150102) ومن "مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية" (31600248).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chloral Hydrate	Sigma	15307
Murashige and Skoog Basal Medium	Sigma	M5519
Phytagel	Sigma	P8169
Hygromycin	Roche	10843555001
Growth chamber	Percival	CU36L5
Fluorescence microscope	Zeiss Oberkochen	Zeiss Image M2	camera: AxioCam 506 color
Confocal Laser Scanning Microscopy	Zeiss Oberkochen	Zeiss LSM 5	filters: BP 495 - 555 nm
Stereoscope	Zeiss Oberkochen	Axio Zoom V16	camera: AxioCam MRc5
nutrient-rich soil	KLASMANN, Germany
50-mL tube	Corning Inc.
1.5-mL tube	Corning Inc.
10% sodium hypochlorite solution			Domestic analytical reagent
sucrose			Domestic analytical reagent
KOH			Domestic analytical reagent
glycerol			Domestic analytical reagent
culture dish			Domestic supplies
vermiculite			Domestic supplies
glass slide			Domestic supplies
syringe needle			Domestic supplies
fine-tipped tweezers			Domestic supplies
super clean bench			Domestic equipment

References

Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W. Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 207-236 (2007).
Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern. Annu Rev Plant Biol. 63, 483-506 (2012).
Wendrich, J. R., Weijers, D. The Arabidopsis embryo as a miniature morphogenesis model. New Phytol. 199 (1), 14-25 (2013).
ten Hove, C. A., Lu, K. J., Weijers, D. Building a plant: cell fate specification in the early Arabidopsis embryo. Development. 142 (3), 420-430 (2015).
Feng, J., et al. Protein N-terminal acetylation is required for embryogenesis in Arabidopsis. J Exp Bot. 67 (15), 4779-4789 (2016).
Berleth, T., Jurgens, G. The role of the monopteros gene in organising the basal body region of the Arabidopsis embryo. Development. 118, 575-587 (1993).
Luo, Y., et al. D-myo-inositol-3-phosphate affects phosphatidylinositol-mediated endomembrane function in Arabidopsis and is essential for auxin-regulated embryogenesis. Plant Cell. 23 (4), 1352-1372 (2011).
Nodine, M. D., Yadegari, R., Tax, F. E. RPK1 and TOAD2 are two receptor-like kinases redundantly required for Arabidopsis embryonic pattern formation. Dev Cell. 12 (6), 943-956 (2007).
Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell. 9 (11), 1963-1971 (1997).
Friml, J., et al. Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis. Nature. 426 (6963), 147-153 (2003).
Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (16), 735-743 (1998).
Fiume, E., Fletcher, J. C. Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8. Plant Cell. 24 (3), 1000-1012 (2012).
Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein. Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

126 ovule

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: