Un metodo per la caratterizzazione di embriogenesi in Arabidopsis

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo per osservare l'embriogenesi in Arabidopsis tramite liquidazione ovulo seguita dal controllo della formazione di pattern di embrione sotto un microscopio.

Abstract

Data la natura altamente prevedibile del loro sviluppo, embrioni di Arabidopsis sono stati utilizzati come modello per gli studi della morfogenesi in piante. Tuttavia, primi embrioni di pianta di fase sono piccoli e contengono poche cellule, che li rende difficili da osservare e analizzare. Un metodo è descritto qui per caratterizzare la formazione di pattern in embrioni di pianta sotto un microscopio usando l'organismo modello Arabidopsis. A seguito della liquidazione di ovuli freschi utilizzando soluzione di Hoyer, il numero di cell in e la morfologia degli embrioni ha potuto essere osservati, e loro stadio di sviluppo potrebbe essere determinata da microscopia di contrasto di interferenza differenziale utilizzando un 100x obiettivo d'immersione in olio. Inoltre, l'espressione delle proteine marker specifici contrassegnati con proteina fluorescente verde (GFP) è stato monitorato per annotare la specifica identità cellulare durante patterning di embrione di microscopia a scansione laser confocale. Pertanto, questo metodo può essere utilizzato per osservare la formazione di pattern in embrioni di selvaggio-tipo pianta a livello cellulare e molecolare e di caratterizzare il ruolo di geni specifici nel patterning embrione confrontando la formazione di pattern in embrioni da piante wild type e mutanti embrione-letale. Pertanto, il metodo può essere utilizzato per caratterizzare l'embriogenesi in Arabidopsis.

Introduzione

L'embriogenesi è l'evento più iniziale in maggiore sviluppo delle piante. Forma un embrione maturo da uno zigote attraverso divisione delle cellule e differenziazione sotto rigoroso controllo genetico^1,2. Embrioni di Arabidopsis sono un modello utile per studiare il controllo della morfogenesi, perché la sequenza di divisioni cellulari durante l'embriogenesi segue un modello previsto^3,4. Tuttavia, un embrione di Arabidopsis contenente uno a parecchie cellule è troppo piccolo per essere osservata e analizzata. Inoltre, la mutazione di determinati geni possa causare embrione letalità⁵, che indica il ruolo chiave di questi geni nell'embriogenesi. La caratterizzazione della formazione di pattern nei mutanti embrione-letale fornisce una base per la comprensione del meccanismo molecolare con cui geni essenziali regolano lo sviluppo dell'embrione.

Un metodo dettagliato è descritto qui per la caratterizzazione di formazione modello dell'embrione nella pianta modello Arabidopsis mediante osservazione microscopica diretta. Il metodo prevede la liquidazione dell'ovulo seguita dall'osservazione al microscopio di un embrione. La caratterizzazione di un mutante di embrione-letale è anche descritto.

La morfologia degli embrioni a diversi stadi di sviluppo può essere determinata direttamente da microscopia utilizzando gli ovuli che sono stati cancellati con soluzione^{6,7 di Hoyer}. Tali ovuli esibiscono un alto indice di rifrazione; così, questo ovulo metodo di compensazione è particolarmente vantaggioso per gli esemplari che devono essere osservati da microscopia (DIC) contrasto differenziale di interferenza.

Inoltre, i geni che sono espressi in una determinata cella o un numero limitato di cellule durante l'embriogenesi utilizzabile come marcatori per identificare le cellule di un embrione. Pertanto, la specifica identità cellulare durante l'embriogenesi può essere annotata monitorando l'espressione della GFP-etichettato marker proteici mediante microscopia a scansione laser confocale. Al contrario, osservando il pattern di espressione di un gene funzionale sconosciuto -GFP fusione durante l'embriogenesi può fornire un collegamento tra embrione patterning e l'espressione di quel gene e facilitare l'identificazione di nuovi geni che sono necessari per l'embriogenesi in Arabidopsis.

Il metodo qui descritto è utilizzabile anche per caratterizzare il fenotipo di un embrione-letale mutante e per determinare l'impatto del gene interessato su embriogenesi a livello cellulare. Inoltre, in combinazione con un confronto del modello di espressione dei geni marcatori durante l'embriogenesi tra piante wild-type e mutanti, il metodo può produrre indizi circa i meccanismi molecolari e le vie di segnalazione coinvolte nella embriogenesi^8,9. Infatti, il metodo è stato applicato agli impianti di naa10 , e si è constatato che la divisione anormale del hypophysis nel mutante può essere causata da un cambiamento nella distribuzione dell'auxina durante l'embriogenesi⁵.

Protocollo

Nota: Questo protocollo ha tre parti: 1) osservando la formazione di pattern in embrioni di Arabidopsis di selvaggio-tipo usando microscopia DIC; 2) che caratterizza l'embrione modello formazione tramite l'osservazione dell'espressione della proteina marker utilizzando laser confocale microscopia; e 3) determinazione del ruolo di un gene specifico nell'embriogenesi (utilizzando il mutante di naa10 ad esempio).

1. ovulo schiarimento

1. Preparazione del materiale vegetale
   Nota: Il protocollo descritto qui è un esempio su come far crescere piante sane; funzionano anche altri modi per far crescere piante sane.
   1. Aggiungere 100 semi in una provetta da 1,5 mL e quindi aggiungere 1 mL di 1,5% di ipoclorito di sodio (mix 15 mL di 10% di cloro con 85 mL di acqua) per sterilizzare i semi per 5 min, Inverti il tubo più volte per garantire che i semi e la soluzione siano ben mescolate per sterilizzare il superfici semi completamente.
   2. I semi della forza verso il basso del tubo mediante centrifugazione per 30 s a 1.200 x g, eliminare il surnatante e lavare i semi con acqua sterile quattro volte una panchina per rimuovere il residuo di ipoclorito di sodio.
   3. Aggiungere 4,4 g di miscela di sale basale di Murashige e Skoog (MS) e 10 g di saccarosio in 1 L di acqua ultrapura. Mescolare per sciogliere i sali e saccarosio. Regolare la soluzione a pH 5,8 con 1m KOH, aggiungere 3 g di agente gelificante, ad esempio Phytagel, la soluzione di MS-saccarosio e sterilizzare la soluzione a 121 ° C per 15 min rendere MS Media.
   4. Versare 30 mL di terreno MS in una piastra di coltura di 12 cm per generare piastre di terreno di MS.
   5. Collocare i semi sterilizzati sulla piastra di MS. Trasferire la piastra ad una camera di crescita e mantenere la piastra in condizioni di giorno lungo (22 ° C per 16 h nella luce e a 18 ° C per 8 h al buio) dopo stratificazione di seme (3 giorni a 4 ° C al buio).
   6. Dopo 8 giorni di crescita, trasferire le piante al suolo (mix ricco di sostanze nutritive del terreno e vermiculite con un rapporto 1:1) in un vassoio, coprire il vassoio con coperchio bianco, trasparente per 5 giorni evitare la perdita di acqua e lasciare uno spazio vuoto per evitare la vetrificazione delle piante.
   7. Prendere il coperchio del vassoio e coltivare le piante in una camera di cabina in condizioni di giorno lungo (Vedi 1.1.5). Accendere la luce alle 6:00 e si spegne alle 22:00. Dopo circa 20 giorni di crescita nella camera di cabina, le piante saranno hanno fiorito e prodotto silique.
   8. Mark i boccioli dei fiori con un thread nella posizione del seme gambi in infiorescenza alle 20:00 (non utilizzare il primo per i terzi boccioli di fiori; silique generati da questi boccioli di fiori di solito sviluppano alcuni semi abortiti, e ciò può alterare la proporzione di normale di ovuli anormali). Definire l'inizio dell'impollinazione dell'ovulo come quando il germoglio contrassegnato apre al fiore alle 8:00 la mattina successiva.
2. Preparazione della soluzione di Hoyer
   1. Aggiungere 24 g di idrato di cloralio in una provetta da 50 mL e avvolgere il tubo completamente con foglio di alluminio (soluzioni di idrato di cloralio non sono stabili alla luce).
   2. Successivamente, aggiungere 9 mL di acqua ultrapura e 3 mL di glicerolo per la soluzione di cui sopra e agitare la provetta per scioglierne l'idrato di cloralio. Per rendere la soluzione di Hoyer, lasciare riposare per una notte a temperatura ambiente per eliminare eventuali bolle.
3. Liquidazione e separazione dell'ovulo
   1. Attaccare un pezzo di nastro bi adesivo per un vetrino per microscopio. Posizionare un anemofila coltivata per il numero desiderato di giorni dopo l'impollinazione (DAP) sulla diapositiva con la pseudoseptum perpendicolare alla superficie; Questo renderà più facile dividere i carpelli (figure 1A e 1B).
   2. Dividere i carpelli su entrambi i lati della pseudoseptum con un ago di siringa e collegare i due carpelli dissecati alla diapositiva in modo che gli ovuli nell'anemofila sono visibili sotto uno stereoscopio (figure 1 e 1 D).
   3. Dispensare 70 µ l di soluzione di Hoyer su lastra di vetro e quindi inumidire la punta di un paio di pinzette a punta fine con soluzione di Hoyer immergendo. Utilizzando lo stereoscopio, spostare gli ovuli in soluzione di Hoyer sul vetrino con le pinzette per pulire gli embrioni. Applicare un vetrino coprioggetti alla diapositiva delicatamente per evitare di generare tutte le bolle.
   4. Mettere il vetrino finito in una scatola in una stanza buia per 2-12 h (più un ovulo è maturo, più tempo sarà necessario) a temperatura ambiente. Embrioni allo stadio di 2/4-cella (1-2 DAP) possono essere osservati microscopicamente dopo 2 h, mentre gli embrioni tra l'ottante e prime fasi globulare (DAP 3) possono essere osservati dopo 4 h. Più maturi embrioni (4-8 DAP) possono essere osservati dopo 12 h.
   5. Esaminare gli ovuli eliminati utilizzando la funzione DIC di un microscopio. Individuare gli embrioni in un campo di bassa potenza (10x) e quindi modificare a un campo ad alta potenza (100 X obiettivo ad immersione) per osservare il modello cellulare negli embrioni sviluppati.
   6. Esaminare gli embrioni a diversi stadi di sviluppo.

2. caratterizzazione di Patterning di embrione e identità cellulare tramite l'osservazione dell'espressione della proteina Marker

1. Preparazione di materiali vegetali
   1. Clonare il promotore e la sequenza dell'elemento di risposta marcatore gene o ormone di codificazione e poi si fondono con una proteina fluorescente (ad esempio di GFP); Successivamente, è possibile inserire il costrutto nel vettore binario (ad esempio pCambia1300). Qui, l'elemento di risposta dell'auxina DR5 è presentato come un esempio¹⁰.
   2. Introdurre il plasmide DR5-GFP risultante le piante di selvaggio-tipo di Agrobacterium tumefaciens-mediata trasformazione¹¹. Selezionare le piante T1 utilizzando MS medie piastre contenenti igromicina (50 mg/mL di acqua madre, diluito 1:1, 000). Le piante transgeniche si esibiscono le radici lunghe e generare due foglie di Rosetta dopo 8 giorni di crescita nelle condizioni descritte in 1.1.5.
   3. Trasferire le piante transgeniche per il suolo e coltivarli come indicato in 1.1.6 e 1.1.7.
   4. Raccogliere i semi di T2 dalle linee T1 indipendente. Seminare i semi su MS-igromicina piastre, selezionare le piante che trasportano una copia dell'inserzione DR5-GFP (il rapporto di piante resistenti a piante sensibili sarà circa 3:1) e trasferirli al suolo.
   5. Coltivare le piante di T2 come indicato in 1.1.6 e 1.1.7.
   6. Raccogliere i semi di T3 dalle piante T2. Seminare i semi su MS-igromicina piastre, selezionare le piante transgeniche omozigoti (tutte le piante da una singola riga esporrà igromicina resistenza) e trasferirli al suolo.
   7. Segnare i boccioli dei fiori delle piante omozigoti T3 come indicato nella 1.1.8.
2. Osservazione del segnale GFP
   1. Mescolare 3 mL di glicerolo con 47 mL di acqua ultrapura per generare una soluzione di glicerolo di 6%.
   2. Attaccare un pezzo di nastro bi adesivo per un vetrino per microscopio e fissare un anemofila come indicato in 1.3.1.
   3. Split dei carpelli su entrambi i lati della pseudoseptum con un ago di siringa e collegare i due carpelli dissecati il vetrino sotto uno stereoscopio come indicato in 1.3.2.
   4. Versare 30 µ l di 6% glicerolo su lastra di vetro e inserire tutti gli ovuli da carpelli dissecati nella soluzione usando la pinzetta appuntita. Appoggiate delicatamente un vetrino coprioggetto sul vetrino.
   5. Come il cappotto di seme ed endosperma in ogni ovulo può impedire l'osservazione dei segnali GFP nell'embrione, estrarre l'embrione da ovulo. Tocca la diapositiva rapidamente e delicatamente per estrudere l'embrione da ovulo (più un ovulo è maturo, meno la forza deve essere applicata alla diapositiva).
   6. Esaminare il vetrino per fluorescenza GFP mediante microscopia a scansione laser confocale. Trovare gli embrioni isolati sotto un campo di bassa potenza (10x) e registrare la loro posizione, poi cambiare per un campo ad alta potenza (100 X obiettivo ad immersione) per osservare il DR5-GFP espressione negli embrioni impostando la sorgente di luce di eccitazione a 488 nm per il rilevamento del segnale GFP.
   7. Rilevare l'espressione di GFP negli embrioni per selezionare la linea T3 adatta per ulteriori analisi.

3. caratterizzazione della formazione di Pattern dell'embrione in un embrione-letale mutante tramite Clearance dell'ovulo e l'osservazione di proteina Marker: Naa10 come un esempio

1. Patterning di embrione in piante mutanti naa10
   1. Preparare i materiali vegetali come indicato in 1.1.1-1.1.7.
   2. Identificare il naa10^{+ / −} piante mediante PCR usando gli iniettori di gene-specific⁵e poi mark i boccioli dei fiori di naa10^{+ / −} piante come indicato in 1.1.8.
   3. Eseguire la clearance dell'ovulo e l'esame al microscopio di naa10^{+ / −} embrioni come indicato in 1.2 e 1.3.
2. Analisi delle proteine marker utilizzando embrioni naa10
   1. Ottenere il DR5-GFP adatti linee transgeniche utilizzando la procedura descritta al punto 2.1-2.2.
   2. Attraversare una linea di transgenici omozigotica DR5-GFP con un naa10^{+ / −} pianta per ottenere naa10^{+ / −} piante che sono omozigotiche per il marcatore di fluorescenza di GFP alla generazione F2 (identificata dalla PCR del gene-specifico) per caratterizzare naa10^{+ / −5} e osservare il segnale GFP sotto un microscopio utilizzando una linea di DR5-GFP omozigotica.
   3. Contrassegnare i boccioli dei fiori di naa10^{+ / −} piante che sono omozigotiche per DR5-GFP come indicato in 2.1.7.
   4. Ricerca il segnale GFP in embrioni di naa10 che sono omozigotici per DR5-GFP come indicato al punto 2.2.

Risultati

Il metodo descritto in questo documento può essere utilizzato per osservare l'embriogenesi direttamente sotto un microscopio, annotare la specifica identità cellulare durante l'embriogenesi con marcatori specifici e caratterizzare il ruolo di un gene particolare durante l'embriogenesi.

Risultati rappresentativi dall'analisi dell'embrione patterning (dalla fase di zigote allungata per la fase matura del bastone) nel selvaggio-t...

Discussione

La clearance dell'ovulo è un metodo utile per rilevare la divisione cellulare e valutare morfologia durante l'embriogenesi in Arabidopsis; utilizzando questa tecnica, gli embrioni possono essere osservati direttamente nel DIC microscopia^5,12. Il passaggio fondamentale per lo sdoganamento dell'ovulo è punto 1.3.4. Il tempo richiesto per lo sdoganamento dell'ovulo nel passaggio 1.3.4 è variabile. Embrioni allo stadio di 2/4-cellule possono essere osserv...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chloral Hydrate	Sigma	15307
Murashige and Skoog Basal Medium	Sigma	M5519
Phytagel	Sigma	P8169
Hygromycin	Roche	10843555001
Growth chamber	Percival	CU36L5
Fluorescence microscope	Zeiss Oberkochen	Zeiss Image M2	camera: AxioCam 506 color
Confocal Laser Scanning Microscopy	Zeiss Oberkochen	Zeiss LSM 5	filters: BP 495 - 555 nm
Stereoscope	Zeiss Oberkochen	Axio Zoom V16	camera: AxioCam MRc5
nutrient-rich soil	KLASMANN, Germany
50-mL tube	Corning Inc.
1.5-mL tube	Corning Inc.
10% sodium hypochlorite solution			Domestic analytical reagent
sucrose			Domestic analytical reagent
KOH			Domestic analytical reagent
glycerol			Domestic analytical reagent
culture dish			Domestic supplies
vermiculite			Domestic supplies
glass slide			Domestic supplies
syringe needle			Domestic supplies
fine-tipped tweezers			Domestic supplies
super clean bench			Domestic equipment