Embriyogenez Arabidopsis olarak karakterize bir yöntem

Özet

Bu iletişim kuralı Arabidopsis içinde embriyogenez embriyo Desen oluşumu bir mikroskop altında incelenmesi ve ardından ovule izni ile gözlemlemek için bir yöntem özetliyor.

Özet

Gelişimleri çok öngörülebilir doğası göz önüne alındığında, Arabidopsis embriyo bir model olarak morfogenez tesislerinde çalışmaları için kullanılmaktadır. Ancak, erken aşamada bitki embriyo küçük ve onları gözlemlemek ve çözümlemek zor hale birkaç hücre içeriyor. Bir yöntemi Desen oluşumu bitki embriyo model organizma Arabidopsiskullanma mikroskop altında karakterize için burada kullanılmıştır. Taze ovules Hoyer'ın solution'ı kullanma izni, cep telefonu numarasını ve Morfoloji embriyo gözlenen ve onların gelişim aşamasında fark girişim kontrast mikroskobu bir 100 X yağı daldırma objektifi kullanarak tarafından tespit edilemedi. Buna ek olarak, belirli işaret proteinlerin yeşil flüoresan Protein (GFP ile) öğesini ifade mikroskobu tarama confocal lazerle hücre Kimlik belirtimi embriyo desenlendirme sırasında ek açıklama eklemek için takip. Böylece, bu yöntem vahşi-türü bitki embriyolar, hücresel ve moleküler düzeyde oluşumunda desen gözlemlemek ve embriyo vahşi-türü bitkiler ve embriyo ölümcül mutantlar Desen oluşumu karşılaştırarak embriyo desenlendirme belirli genlerin rol tanımlamak için kullanılabilir. Bu nedenle, yöntem Arabidopsisembriyogenez karakterize etmek için kullanılabilir.

Giriş

Embriyogenez daha yüksek bitki gelişiminde ilk olaydır. Olgun embriyo formlarının dışında bir zigot hücre bölünmesi ve farklılaşma altında sıkı genetik kontrol^1,2. Arabidopsis embriyoların hücre bölünmeler embriyogenez sırasında dizi beklenen desen^3,4takip çünkü morfogenez kontrolünü çalışmaya uzun bir faydalı model vardır. Ancak, bir birkaç hücreyi içeren bir Arabidopsis embriyo gözlenen ve analiz için çok küçük. Buna ek olarak, bazı genler mutasyon embriyo ölümcül⁵embriyo bu genlerin rol gösteren, neden olabilir. Embriyo ölümcül mutantlar Desen oluşumu karakterizasyonu sayede embriyo gelişimi temel genler düzenleyen moleküler mekanizması anlamak için bir temel sağlar.

Detaylı bir yöntem burada embriyo Desen oluşumu model bitki Arabidopsis karakterizasyonu için doğrudan mikroskobik gözlem tarafından açıklanmıştır. Yöntem ovule izni bir embriyo mikroskobik gözlem tarafından takip içerir. Embriyo öldürücü bir mutant karakterizasyonu ayrıca açıklanmıştır.

Embriyo farklı gelişim aşamalarında morfolojisi Hoyer'ın çözüm^6,7ile temizlenmiş ovules kullanarak doğrudan mikroskobu tarafından belirlenebilir. Böyle ovules bir yüksek Kırılma indisi sergi; Böylece, bu ovule yöntemi temizlenmesi özellikle fark girişim kontrast (DIC) mikroskopi tarafından uyulmalıdır numuneler için avantajlıdır.

Buna ek olarak, belirli bir hücre veya hücreler sınırlı sayıda embriyo sırasında ifade edilir genler imleyicileri bir embriyo hücreleri tanımlamak için kullanılabilir. Bu nedenle, hücre Kimlik belirtimi embriyogenez sırasında ifade confocal lazer mikroskobu tarama kullanarak GFP öğesini işaret proteinlerin izleyerek açıklamalı. Tersine, bir bilinmeyen işlev gen -GFP füzyon embriyogenez sırasında ifade desenini gözlemleyerek embriyo desenlendirme ve o gen ifade arasında bir bağlantı sağlamak ve Arabidopsisembriyo için gerekli olan yeni genlerin tanımlaması kolaylaştırmak.

Burada açıklanan yöntemi de embriyo öldürücü bir mutant fenotip karakterize ve etkilenen gen embriyogenez hücresel düzeyde üzerinde etkisini belirlemek için kullanılabilir. Ayrıca, marker gen ifade deseninin ile birlikte bir karşılaştırma sırasında embriyogenez vahşi tipi ve mutant bitkiler arasında moleküler mekanizmaları ve sinyal yollar embriyogenez^8,9' ilgili hakkında ipuçları yöntemi yol açabilir. Gerçekten de, naa10 bitkiler için yöntem uygulandı ve mutant hypophysis anormal bölünmesi sırasında embriyo⁵auxin dağıtım bir değişiklik nedeni olabilir bulundu.

Protokol

Not: Bu protokol üç bölümden oluşur: 1) vahşi tipi Arabidopsis embriyo DIC mikroskobu; kullanarak desen oluşumunda gözlemleyerek 2) embriyo Desen oluşumu ile işaret protein ifade confocal lazer mikroskobu tarama kullanarak gözlenmesi karakterize; ve 3) ( naa10 mutant örnek olarak kullanarak) embriyogenez olarak belirli bir gen rolünün belirlenmesi.

1. ovule takas

1. Bitki malzeme hazırlama
   Not: Burada açıklanan protokol nasıl sağlıklı bitkiler büyümek bir örnektir; sağlıklı bitkiler büyümek için başka yollar da iş.
   1. 1.5 mL tüp 100 tohum ekleyin ve sonra 5 dk. ters çevir'i tohumları tüp birkaç kez tohum ve çözüm yüzey tohumlar tamamen sterilize etmek için iyi karışık olduğundan emin olmak için sterilize etmek için 1 mL % 1.5 sodyum hipoklorit (mix 85 mL su ile 15 mL % 10 klor) ekleyin.
   2. Tohumlar tüp altına Santrifüjü 30 tarafından zorla 1200 x g, s süpernatant kaldırmak ve steril su ile tohum kalan sodyum hipoklorit kaldırmak için bir Bank dört kez yıkayın.
   3. 4.4 g Bazal tuz karışımı Murashige ve Skoog (MS) ve 10 g Sükroz 1 litre ultrasaf su ekleyin. Tuzları ve sukroz çözmek için karışımı ilave edin. MS-Sükroz çözüm için eklemek gibi Phytagel, jelleşme Aracısı'nın 3 g çözüm pH 5.8 ile 1 M KOH, için ayarlayın ve belgili tanımlık eriyik vasıl 121 ° C MS orta yapmak 15 dakika sterilize.
   4. MS orta 30 mL MS orta plakaları oluşturmak için 12 cm kültür çanak içine dökün.
   5. Steril tohum MS tabağa yerleştirin. Plaka bir büyüme odasına aktarmak ve tohum stratifikasyon (3 gün karanlıkta 4 ° C'de) sonra plaka uzun günlük koşullar (16 h ışık ve karanlık 8 h için 18 ° C 22 ° C) altında tutun.
   6. 8 gün sonra büyüme, bitkiler toprak (karışım besin açısından zengin toprak ve vermikülit 1:1 oranında) içinde bir tepsi, tepsi su kaybını önlemek 5 gün boyunca beyaz, şeffaf kapaklı kapağı takabilir ve Vitrifiye bitkilerin önlemek için bir boşluk bırakmak.
   7. Tepsiyi kapalı kapağı almak ve gömme Odası (1.1.5 bakınız) uzun günlük koşullar altında bitkilerde yetiştirmek. 6: 00'de ışık açma ve kapatma 10:00 PM. Artış Walk odası yaklaşık 20 gün sonra bitkiler çiçekli ve siliques üretilen.
   8. Çiçek tomurcukları ile tohum konumunu bir iplik takip ediyor önümüzdeki pm 08:00 işareti (ilk üçüncü çiçek tomurcukları için kullanmayın; Bu çiçek tomurcukları genellikle oluşturulan siliques bir kaç iptal edilen tohumlar geliştirmek ve bu anormal ovules normale oranda değiştirebilir). İşaretli bud ertesi sabah saat 8: 00'de çiçek açtığında ovule tozlaşma başlangıcı tanımlayın.
2. Hoyer'ın çözüm hazırlanması
   1. Kloral hidrat 24 g 50 mL tüp ekleyin ve tüp tamamen (kloral hidrat çözümler ışık altında istikrarlı değildir) alüminyum folyo ile sarın.
   2. Daha sonra 9 mL ultrasaf su ve gliserol 3 mL yukarıdaki ekleyin ve kloral hidrat çözülmeye tüp sallamak. Hoyer'ın çözüm sağlamak için herhangi bir kabarcıkları ortadan kaldırmak için oda sıcaklığında gecede stand tüp ver.
3. Ovule ayrılık ve gümrükleme
   1. Çift taraflı yapışkan bant bir parça mikroskop cam slayda ekleyin. Bir silique gün sonra tozlaşma (DAP) ile yüzeye dik pseudoseptum slaytta istediğiniz sayıyı yetiştirilen yer; Bu da carpels (şekil 1A ve 1B) bölmek kolay hale getirecek.
   2. Carpels pseudoseptum her iki tarafında bir şırınga iğnesi bölünmüş ve silique ovules bir stereoscope (rakamlar 1 c ve 1 D) altında görülebilir iki disseke carpels slayda ekleyin.
   3. Hoyer'ın çözüm cam slayt üzerine 70 µL dağıtmak ve sonra ince uçlu cımbız Hoyer'ın çözüm ile bir çift ucu daldırma nemlendirin. Stereoscope kullanarak, ovules slayt üzerinde embriyo temizlemek için cımbızla Hoyer'ın çözüm taşıyın. Bir coverslip yavaşça herhangi bir kabarcıklar oluşturulmasını engellemek için slayda uygulanır.
   4. 2-12 h için karanlık bir odada bir kutu içine bitmiş slayt (daha olgun bir ovule daha fazla zaman gerektiğini) oda sıcaklığında attın. Embriyo octant ve erken küresel aşamaları (3 DAP) arasında 4 h sonra görülebilir iken, 2/4 hücreli aşamada (1-2 DAP) embriyo mikroskobik 2 h sonra görülebilmektedir. Daha olgun embriyo (4-8 DAP) 12 h sonra görülebilir.
   5. Mikroskop DIC işlevini kullanarak temizlenen ovules inceleyin. Embriyo bir düşük güç alan (10 X) altında bulun ve sonra geliştirilen embriyolar hücresel desende gözlemlemek için yüksek güç alanına (100 X yağı daldırma objektif) değiştirin.
   6. Embriyo farklı gelişim aşamalarında inceleyin.

2. embriyo desenlendirme ve hücre kimliğini Marker Protein ifade gözlem yolu ile karakterizasyonu

1. Bitki malzemelerin hazırlanması
   1. Organizatörü ve marker gen veya hormon yanıt öğe dizisi kodlama klonu ve sonra (gibi GFP); floresan bir protein ile sigorta ardından, yapı (pCambia1300 gibi) ikili vektör içine yerleştirin. Burada, auxin yanıt öğesi bir örnek¹⁰ DR5 sunulur.
   2. İçine vahşi-türü bitkiler Agrobacterium tumefacienstarafından elde edilen DR5-GFP plazmid takdim-dönüşümü¹¹aracılı. Hygromycin içeren MS orta plakaları kullanarak T1 bitkiler seçin (50 mg/mL anne likör, seyreltilmiş 1:1, 000). Transgenik bitkiler uzun kökleri sergi ve büyüme 1.1.5 içinde açıklanan koşullar altında 8 gün sonra iki rozet yaprakları oluşturmak.
   3. Transgenik bitkiler toprağa aktarabilir ve onları 1.1.6 ve 1.1.7 belirtildiği şekilde yetiştirmek.
   4. T2 tohum bağımsız T1 hatları toplamak. MS-hygromycin plakaları tohumları ekmek, bir kopya (duyarlı bitkiler için dayanıklı bitkiler oranı kabaca 3:1-ecek var olmak) DR5-GFP ekleme taşıyan bitkiler seçmek ve onları toprağa aktarmak.
   5. T2 bitkiler 1.1.6 ve 1.1.7 belirtildiği şekilde yetiştirmek.
   6. T3 tohum T2 bitkilerden toplamak. MS-hygromycin plakaları tohumları ekmek, homozigoz transgenik bitkiler (tüm tek bir satır bitkilerden hygromycin direnç sergileyecek) seçmek ve onları toprağa aktarmak.
   7. Homozigoz T3 bitkilerin çiçek tomurcukları 1.1.8 içinde belirtildiği şekilde işaretle.
2. GFP sinyal gözlem
   1. Gliserol 3 mL 47 mL %6 gliserol çözüm üretmek için ultrasaf su ile karıştırın.
   2. Çift taraflı yapışkan bant bir parça cam mikroskop slayda ekleyin ve bir silique 1.3.1 içinde belirtildiği şekilde düzeltin.
   3. Carpels pseudoseptum her iki tarafında bir şırınga iğnesi bölünmüş ve iki disseke carpels 1.3.2 içinde belirtildiği gibi bir stereoscope altında slayt ekleyin.
   4. % 6 gliserol cam slayt üzerine 30 µL dağıtmak ve tüm ovules disseke carpels dan ince uçlu cımbız kullanarak çözüm yerleştirin. Bir coverslip slayt üzerinde yavaşça yerleştirin.
   5. Tohum ceket ve her ovule endosperm embriyo GFP sinyalleri gözlenmesi engelleyebilir gibi embriyo ovule ayıklamak. Slayt hızlı ve hafifçe dokunun (daha olgun bir ovule olan, daha az güç slayt için uygulanan) embriyo ovule üzerinden yükseltme için.
   6. GFP Floresans mikroskobu tarama confocal lazer kullanarak slayt inceleyin. Düşük güç alan (10 X) altında izole embriyo bulmak ve konumlarını kaydetmek sonra embriyo ifadede DR5-GFP 488 için uyarma ışık kaynağı ayarlayarak gözlemlemek için yüksek güç alanına (100 X yağı daldırma objektif) değiştirmek nm GFP sinyal tespiti.
   7. GFP ifade daha fazla çözümleme için uygun T3 hattı seçmek için embriyo tespit edebilir.

3. embriyo Desen oluşumu Ovule temizlik ve Marker Protein gözlem yolu ile embriyo öldürücü bir Mutant karakterizasyonu: Naa10 örnek olarak

1. Embriyo desenlendirme naa10 mutant tesislerinde
   1. Bitki malzemeleri 1.1.1-1.1.7 içinde belirtildiği şekilde hazırlayın.
   2. Naa10tespit^{+/ −} gene özgü astar⁵ve sonra işareti kullanan PCR tarafından naa10 çiçek tomurcukları bitkiler^{+/ −} bitkiler 1.1.8 içinde belirtildiği gibi.
   3. Ovule temizlik ve naa10 mikroskobik incelenmesi gerçekleştirmek^{+/ −} 1.2 ve 1.3 belirtildiği gibi embriyo.
2. Naa10 embriyo marker protein analizi
   1. 2.1-2.2 içinde özetlenen yordamı kullanarak uygun DR5-GFP transgenik satırları elde edilir.
   2. Homozigoz DR5-GFP transgenik bir naa10 ile çizgiyi^{+/ −} naa10 elde etmek için bitki^{+/ −} (gene özgü PCR tarafından tanımlanan) F2 üretimi, naa10karakterize etmek için GFP Floresans marker için homozigoz bitkiler^{+/ −5} ve GFP sinyal homozigoz DR5-GFP satırını kullanarak bir mikroskop altında gözlemlemek.
   3. Naa10 çiçek tomurcukları mark^{+/ −} 2.1.7 içinde belirtildiği gibi DR5-GFP için homozigoz bitkiler.
   4. 2.2 içinde belirtildiği gibi DR5-GFP için homozigoz naa10 embriyo GFP sinyalin arayın.

Sonuçlar

Bu makalede açıklanan yöntemi embriyogenez doğrudan bir mikroskop altında gözlemlemek, belirli işaretleri ile hücre Kimlik belirtimi embriyogenez sırasında ek açıklama eklemek ve belirli bir gen rolü embriyogenez sırasında karakterize için kullanılabilir.

Temsilcisi sonuçları analiz (olgun yürüyüş-stick sahneye uzun zigot sahneden) içinde vahşi tipi Arabidopsis biçimlenme embriyo

Tartışmalar

Ovule izni hücre bölünmesi tespit ve Morfoloji Arabidopsisembriyogenez sırasında değerlendirilmesi için kullanışlı bir yöntemdir; Bu tekniği kullanarak, embriyo doğrudan DIC mikroskobu^5,12altında görülebilir. Kritik ovule izni için adım 1.3.4 adımdır. Adım 1.3.4 ovule izni için gereken süreyi değişkendir. 12 h sonra belli belirsiz görünüyorlar ise 2/4 hücreli aşamada embriyo Hoyer'ın çözümünde, 2 h sonra açıkça gör?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chloral Hydrate	Sigma	15307
Murashige and Skoog Basal Medium	Sigma	M5519
Phytagel	Sigma	P8169
Hygromycin	Roche	10843555001
Growth chamber	Percival	CU36L5
Fluorescence microscope	Zeiss Oberkochen	Zeiss Image M2	camera: AxioCam 506 color
Confocal Laser Scanning Microscopy	Zeiss Oberkochen	Zeiss LSM 5	filters: BP 495 - 555 nm
Stereoscope	Zeiss Oberkochen	Axio Zoom V16	camera: AxioCam MRc5
nutrient-rich soil	KLASMANN, Germany
50-mL tube	Corning Inc.
1.5-mL tube	Corning Inc.
10% sodium hypochlorite solution			Domestic analytical reagent
sucrose			Domestic analytical reagent
KOH			Domestic analytical reagent
glycerol			Domestic analytical reagent
culture dish			Domestic supplies
vermiculite			Domestic supplies
glass slide			Domestic supplies
syringe needle			Domestic supplies
fine-tipped tweezers			Domestic supplies
super clean bench			Domestic equipment