Метод для характеризующие эмбриогенеза в проростках Arabidopsis

Резюме

Этот протокол описывает метод для наблюдения эмбриогенеза в проростках Arabidopsis через яйцеклетку Распродажа следуют инспекции формирования зародыша шаблон под микроскопом.

Аннотация

Учитывая весьма предсказуемый характер их развития, Arabidopsis эмбрионы использовались как модель для изучения морфогенеза растений. Однако ранней стадии завод эмбрионов малы и содержат несколько клеток, что делает их трудно наблюдать и анализировать. Характеризующих формирование шаблон в завод эмбрионов под микроскопом, используя модель организма Arabidopsisздесь описан метод. После очистки свежей яйцеклеток, используя Хойер решение мобильный номер в и морфология эмбрионы могут наблюдаться и стадии их развития могут определяться дифференциальной помехи контрастной микроскопии с помощью 100 X объектив погружения нефти. Кроме того выражение определенных маркер белков, помеченный с зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) для аннотирования Спецификация идентификации клеток во время структурирования эмбриона контролируется Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. Таким образом этот метод может использоваться соблюдать модель формирования в зародыши дикого типа растений на клеточном и молекулярном уровнях и охарактеризовать роль конкретных генов в эмбрион патронирования, сравнивая модели формирования в эмбрионы от дикого типа растений и эмбрионов смертоносных мутантов. Таким образом этот метод может использоваться для характеристики эмбриогенеза в проростках Arabidopsis.

Введение

Эмбриогенез является раннее событие в развитии высших растений. Зрелая эмбриона формы из зиготы через клеточного деления и дифференциации под строгим генетическим контролем^1,2. Арабидопсис эмбрионов являются полезной моделью для изучения управления морфогенеза, потому что последовательность клеточных делений во время эмбриогенеза ниже ожидаемых шаблон^3,4. Однако эмбрион Arabidopsis , содержащие один в несколько ячеек слишком малы, чтобы быть замечен и проанализированы. Кроме того мутация некоторых генов может вызвать эмбриона летальность⁵, указывающее ключевую роль этих генов в эмбриогенезе. Характеристика формирования шаблона в зародыш смертоносных мутантов обеспечивает основу для понимания молекулярный механизм, при котором важно генов регулировать развитие эмбриона.

Подробный метод описан здесь для характеристики формирования зародыша шаблон в модели растение Arabidopsis прямого микроскопические наблюдения. Метод предполагает яйцеклетку Распродажа следуют микроскопические наблюдения эмбриона. Характеристика эмбриона смертоносных мутантов также описал.

Морфология эмбрионов на разных этапах своего развития может определяться непосредственно микроскопии, используя яйцеклеток, которые были очищены с Hoyer решение^6,7. Такие семяпочек демонстрируют высокий коэффициент преломления; Таким образом этот яйцеклетку, очистка метод особенно выгодно для образцов, которые должны соблюдаться дифференциальной помехи микроскопия контраста (ОПК).

Кроме того гены, которые выражаются в определенной ячейке или ограниченное количество клеток во время эмбриогенеза может использоваться в качестве маркеров для идентификации клетки эмбриона. Таким образом Спецификация идентификации клеток во время эмбриогенеза может быть Аннотированная контролируя экспрессию белков GFP-тегами маркер, используя Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. И наоборот наблюдения выражения неизвестного функциональных генов -GFP фьюжн во время эмбриогенеза может служить связующим звеном между эмбриона кучность и экспрессия этого гена и способствовать выявлению новых генов, которые требуются для эмбриогенеза в арабидопсиса.

Метод, описанный здесь может использоваться также характеризовать фенотип эмбриона смертоносных мутантов и для определения воздействия пострадавших гена на эмбриогенеза на клеточном уровне. Кроме того в сочетании с сравнение выражения шаблона маркерных генов во время эмбриогенеза между растениями дикого типа и мутантов, метод может принести подсказки о молекулярных механизмов и сигнальных путей, участвующих в эмбриогенезе^8,9. Действительно этот метод был применен к naa10 растений, и было установлено, что аномальные разделение гипофиза в мутанта может быть вызвано изменением ауксинов распределения во время эмбриогенеза⁵.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Примечание: Этот протокол состоит из трех частей: 1) наблюдения за модель формирования в одичал тип Arabidopsis эмбрионов, с помощью микроскопии ДВС; 2) характеризующие эмбриона модель формирования через наблюдение маркер выражения протеина используя Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия; и 3) определение роли определенного гена в эмбриогенезе (с использованием naa10 мутант в качестве примера).

1. яйцеклетка очистка

1. Подготовка растений
   Примечание: Протокол, описанные здесь приведен пример о том, как вырастить здоровых растений; также работают другие способы вырастить здоровых растений.
   1. Добавить 100 семян в 1,5 мл, а затем добавьте 1 мл 1,5% гипохлорита натрия (смесь 15 мл 10% хлора с 85 мл воды) для стерилизации семена для 5 минут инвертировать трубки несколько раз для обеспечения полностью перемешанных полностью стерилизовать поверхности семена семена и решения.
   2. Сила семена в нижней части трубки центрифугированием 30 s на 1200 x g, удалить супернатант и мыть семена с стерильной водой четыре раза на скамейку, чтобы удалить остаточные гипохлорита натрия.
   3. Добавьте 1 Л ультрачистая вода 4,4 г фотосинтетическую и Скуг (МС) базальной смеси соли и 10 г сахарозы. Перемешайте смесь распустить солей и сахароза. Настроить решение для pH 5,8 с 1 M Кох, добавить 3 g желеобразователь, таких как Phytagel, MS-сахароза решение и стерилизовать раствор при температуре 121 ° C 15 мин сделать MS среднего.
   4. Налейте в культуры 12-см блюдо для создания средних пластины MS 30 мл среды MS.
   5. Поместите стерилизованные семена на табличке MS. Передача пластины в камере роста и держать пластину в условиях Лонг день (22 ° C 16 h в свете и 18 ° C в течение 8 ч в темноте) после стратификации семян (3 дня при температуре 4 ° C в темноте).
   6. После 8 дней роста передача растений в почву (микс богатые питательными веществами почвы и вермикулита в соотношении 1:1) в лоток, охватывают лоток с крышкой белый, прозрачный на 5 дней, чтобы избежать потери воды и оставить зазор во избежание витрификации растений.
   7. Возьмите крышку лотка и выращивать растения в камере ходить в Лонг день условиях (см. 1.1.5). Включите свет в 6:00 утра и с 10:00 вечера. Примерно через 20 дней роста в зале ходить растения цветками и производства siliques.
   8. Марк, бутоны с потоком на позиции семя стебли в соцветие в 8:00 вечера (не используйте первый для третьего бутоны; siliques, созданный из этих бутоны обычно разработать несколько прерванных семян, и это может изменить долю нормальным ненормального яйцеклеток). Определите в начале опыления яйцеклетку как когда отмеченные бутон открывает цвести в 8:00 утра утром следующего дня.
2. Приготовление раствора Хойер в
   1. Добавьте 50 мл 24 g хлораль гидрата и обернуть трубу полностью с алюминиевой фольгой (решения хлораль гидрата не стабильны при свете).
   2. Далее добавить 9 мл ультрачистая вода и 3 мл глицерина в выше решение и встряхнуть трубки распустить хлораль гидрат. Чтобы сделать Хойер в раствор, пусть трубку на ночь стоять при комнатной температуре, чтобы устранить любые пузыри.
3. Яйцеклетка разделения и Специальные акции
   1. Прикрепите кусок двухсторонний скотч на стекло микроскопа. Место стручок, выращенных на нужное количество дней после опыления (DAP) на слайде с pseudoseptum перпендикулярно поверхности; Это позволит сделать его легко разделить плодолистиков (цифры 1A и 1B).
   2. Сплит плодолистиков по обе стороны pseudoseptum с иглой шприца и прикрепить два расчлененных плодолистиков к слайду, так что семяпочек в стручок видны под стереоскоп (цифры 1 c и 1 D).
   3. Лунки 70 мкл Хойер в раствор на стеклянное скольжение, а затем смачивают кончик острым концом пинцет с Hoyer в раствор путем погружения. С помощью стереоскоп, переместите семяпочек в Hoyer решение на слайде с помощью пинцета, чтобы очистить эмбрионов. Применить coverslip к слайду осторожно, чтобы избежать создания любой пузыри.
   4. Положите готового слайд в коробку в темной комнате на 2-12 ч (более зрелые яйцеклетку, тем больше времени потребуется) при комнатной температуре. Эмбрионы на стадии 2/4-ячейки (1-2 DAP) может наблюдаться микроскопически после 2 ч, в то время как эмбрионы между Октант и ранних стадиях шаровых (3 DAP) может наблюдаться после 4 ч. Более зрелые эмбрионов (4-8 DAP) может наблюдаться через 12 ч.
   5. Изучите очищается яйцеклеток, используя функцию DIC микроскопа. Найдите эмбрионы под полем малой мощности (10 X), а затем измените мощных поле (100 X нефти погружения объектив) соблюдать Сотовый шаблон в развитых эмбрионов.
   6. Изучите эмбрионы на разных этапах своего развития.

2. характеристика эмбриона кучность и ячеек самобытности через наблюдение маркер выражения протеина

1. Подготовка материалов завод
   1. Клонировать промоутер и кодирования последовательность маркеров генов или гормон ответ элемента и затем сливаются с флуоресцентный белок (например GFP); затем вставьте конструкцию в бинарный вектор (например pCambia1300). Здесь элемент ответа ауксинов DR5 представлен как пример¹⁰.
   2. Привнести одичал тип заводов Agrobacterium tumefaciensрезультате плазмида DR5-GFP -опосредованной преобразования¹¹. Выберите T1 растений с использованием MS средних плит, содержащих hygromycin (50 мг/мл ликера мать, разбавленный 1:1, 000). Трансгенные растения будут выставлять длинные корни и создавать две розетки листьев после 8 дней роста в условиях, описанных в 1.1.5.
   3. Передачи трансгенные растения в почве и обрабатывать их, как указано в 1.1.6 и 1.1.7.
   4. Собирают семена T2 от независимых линий T1. Сеять семена на MS-hygromycin пластины, выберите растения, перевозящих одну копию вставки DR5-GFP (соотношение устойчивых растений для чувствительных растений будет примерно 3:1) и перевести их в почву.
   5. Культивируйте растения T2, как указано в 1.1.6 и 1.1.7.
   6. Собирают семена T3 от T2 растений. Сеять семена на MS-hygromycin пластины, выберите гомозиготных трансгенных растений (все растения из одной строки будет экспонат hygromycin сопротивления) и передавать их в почву.
   7. Марк бутоны гомозиготных T3 растений, как указано в 1.1.8.
2. GFP сигнал наблюдения
   1. Смешайте 3 мл глицерина с 47 мл ультрачистая вода для создания 6% раствором глицерина.
   2. Прикрепить кусок двухсторонний скотч на стекло микроскопа и исправить стручок, как указано в 1.3.1.
   3. Разделение плодолистиков по обе стороны pseudoseptum с иглой шприца и прикрепить два расчлененных плодолистиков слайд под стереоскоп, как указано в 1.3.2.
   4. Обойтись 30 мкл 6% глицерина на слайд стекла и поместите все яйцеклеток из расчлененных плодолистиков в решения с помощью пинцета, острым концом. Осторожно разместите coverslip на слайде.
   5. Как семя Пальто и эндосперма в каждом яйцеклетка может предотвратить наблюдения сигналов GFP в эмбрион, извлечения эмбриона из яйцеклетку. Коснитесь слайда, быстро и аккуратно выдавливание эмбриона от яйцеклетку (более зрелая яйцеклетка является, меньше силы должны применяться к слайду).
   6. Просмотрите слайд для флуоресценции GFP с помощью Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. Найти изолированных зародышей под полем малой мощности (10 X) и записывать их местоположение, а затем изменить мощных поле (100 X нефти погружения объектив) соблюдать экспрессия Гена GFP DR5 в эмбрионы, установив источник света возбуждения 488 нм для обнаружения сигнала GFP.
   7. Обнаружить экспрессия гена GFP в эмбрионов позволяет выбрать подходящую линию T3 для дальнейшего анализа.

3. характеристика формирования шаблон эмбриона в зародыш смертельное мутант через Распродажа яйцеклетку и маркер белка наблюдения: Naa10 качестве примера

1. Кучность эмбриона в мутантных растений naa10
   1. Подготовьте материалы завода, как указано в 1.1.1-1.1.7.
   2. Определить naa10^{+/ −} растений методом ПЦР с использованием гена специфические праймеры⁵, а затем Марк бутоны naa10^{+/ −} растения, как указано в 1.1.8.
   3. Распродажа яйцеклетку и микроскопическое исследование naa10^{+/ −} эмбрионы, как указано в 1.2 и 1.3.
2. Анализ белка маркера с использованием naa10 эмбрионов
   1. Получения подходящей DR5-GFP трансгенных линий с помощью процедуры, изложенные в пункте 2.1-2.2.
   2. Крест гомозиготных трансгенные линии DR5-GFP с naa10^{+/ −} завода для получения naa10^{+/ −} растения, которые гомозиготных GFP флуоресценции маркера на поколение F2 (определяется по ген специфического PCR) характеризовать naa10^{+/ −5} и наблюдать GFP сигнал под микроскопом с помощью гомозиготных линии DR5-GFP .
   3. Марк бутоны naa10^{+/ −} растения, которые гомозиготных для DR5-GFP как указано в 2.1.7.
   4. Поиск GFP сигнала в naa10 эмбрионов, которые гомозиготных для DR5-GFP как указано в 2.2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Метод, описанный в этом документе может использоваться для наблюдения эмбриогенеза непосредственно под микроскопом, аннотировать Спецификация идентификации клеток во время эмбриогенеза с конкретными маркеров и охарактеризовать роль определенного гена во время эм?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Распродажа яйцеклетку является полезным методом для обнаружения деление клеток и оценки морфологии во время эмбриогенеза в арабидопсиса; используя эту технику, эмбрионы можно наблюдать непосредственно под ДВС микроскопии^5,12. Важным шагом для офор?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chloral Hydrate	Sigma	15307
Murashige and Skoog Basal Medium	Sigma	M5519
Phytagel	Sigma	P8169
Hygromycin	Roche	10843555001
Growth chamber	Percival	CU36L5
Fluorescence microscope	Zeiss Oberkochen	Zeiss Image M2	camera: AxioCam 506 color
Confocal Laser Scanning Microscopy	Zeiss Oberkochen	Zeiss LSM 5	filters: BP 495 - 555 nm
Stereoscope	Zeiss Oberkochen	Axio Zoom V16	camera: AxioCam MRc5
nutrient-rich soil	KLASMANN, Germany
50-mL tube	Corning Inc.
1.5-mL tube	Corning Inc.
10% sodium hypochlorite solution			Domestic analytical reagent
sucrose			Domestic analytical reagent
KOH			Domestic analytical reagent
glycerol			Domestic analytical reagent
culture dish			Domestic supplies
vermiculite			Domestic supplies
glass slide			Domestic supplies
syringe needle			Domestic supplies
fine-tipped tweezers			Domestic supplies
super clean bench			Domestic equipment