Eine Methode zur Charakterisierung der Embryogenese in Arabidopsis

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Beobachtung der Embryogenese in Arabidopsis über Ovulum Abstand gefolgt von der Inspektion der Embryo Musterbildung unter dem Mikroskop.

Zusammenfassung

Angesichts der sehr vorhersehbare Art ihrer Entwicklung, haben Arabidopsis Embryonen als Modell für Studien der Morphogenese in Pflanzen verwendet. Jedoch frühe Werk Embryonen sind klein und enthalten nur wenige Zellen, wodurch sie schwer zu beobachten und zu analysieren. Eine Methode wird hier beschrieben, zur Charakterisierung der Musterbildung im Werk Embryonen unter dem Mikroskop mit Hilfe der Modellorganismus Arabidopsis. Nach der Freigabe von frischen Eizellen mit Hoyer Lösung die Zellzahl in und Morphologie der Embryonen konnten beobachtet werden, und ihre Entwicklungsstufe konnte vom differential Interferenz Kontrast Mikroskopie mit 100 X Öl Immersion Objektiv festgestellt werden. Darüber hinaus war der Ausdruck der spezifischen Markerproteine getaggt mit grün fluoreszierenden Proteins (GFP) überwacht, um Zelle Identität Spezifikation beim Embryo Musterung mit Anmerkungen versehen durch konfokale Laser-scanning-Mikroskopie. Somit kann diese Methode, Musterbildung in Wildtyp Pflanze Embryonen auf zellulärer und molekularer Ebene zu beobachten und um die Rolle bestimmter Gene im Embryo Musterung zu charakterisieren, durch den Vergleich der Musterbildung in Embryonen aus Embryo-letale Mutanten und Wildtyp Pflanzen verwendet werden. Daher kann die Methode zur Charakterisierung der Embryogenese in Arabidopsisverwendet werden.

Einleitung

Embryogenese ist das früheste Ereignis höherer Pflanzenentwicklung. Ein Reifen Embryo bildet sich aus einer Zygote durch Zellteilung und Differenzierung unter strengen genetischen Kontrolle^1,2. Arabidopsis Embryos sind ein nützliches Modell für die Kontrolle der Morphogenese zu studieren, weil die Reihenfolge der Zellteilungen in der Embryogenese eine erwartete Muster^{3,4 folgt}. Embryo Arabidopsis , enthält ein bis mehreren Zellen ist jedoch zu klein, um beobachtet und analysiert werden. Darüber hinaus kann die Mutation bestimmter Gene Embryo Letalität⁵, zeigt die wichtige Rolle der Gene in der Embryogenese verursachen. Die Charakterisierung der Musterbildung in der Embryo-letale Mutanten bietet eine Grundlage für das Verständnis der molekularen Mechanismus, wobei wesentlichen Gene, Entwicklung des Embryos regulieren.

Eine detaillierte Methode wird hier für die Charakterisierung der Embryo Musterbildung in der Modellpflanze Arabidopsis durch direkte mikroskopische Beobachtung beschrieben. Die Methode beinhaltet Ovulum Abstand gefolgt von der mikroskopischen Beobachtung eines Embryos. Die Charakterisierung von einem Embryo-tödliche Mutant wird ebenfalls beschrieben.

Die Morphologie der Embryonen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien kann direkt durch Mikroskopie mit den Eizellen die freigemachte mit Hoyers Lösung^6,7bestimmt werden. Diese Eizellen weisen einen hohen Brechungsindex. Somit ist das Ovulum clearing-Methode besonders vorteilhaft für Exemplare, die von differential Interferenz Kontrast (DIC) Mikroskopie beachtet werden müssen.

Darüber hinaus können die Gene, die in einer bestimmten Zelle oder eine begrenzte Anzahl von Zellen in der Embryogenese exprimiert werden als Marker verwendet werden, um die Zellen in einem Embryo zu identifizieren. Daher kann die Zelle-Identität-Spezifikation in der Embryogenese durch Überwachung des Ausdrucks der GFP-Tags Markerproteine konfokale Laser-scanning-Mikroskopie mit annotiert werden. Umgekehrt kann beobachten das Expressionsmuster von einer unbekannten funktionale gen -GFP Fusion in der Embryogenese eine Verbindung zwischen Embryo Musterung und der Ausdruck dieses Gens und erleichtern die Identifizierung neuer Gene, die für die Embryogenese in Arabidopsiserforderlich sind.

Die hier beschriebene Methode kann auch verwendet werden, um den Phänotyp der eine Embryo-letale Mutanten zu charakterisieren und die Auswirkungen des betroffenen Gens auf Embryogenese auf zellulärer Ebene zu ermitteln. Darüber hinaus kann die Methode in Kombination mit einem Vergleich der Expressionsmuster von Markergenen in der Embryogenese zwischen Wildtyp und mutierte Pflanzen, Hinweise über die molekularen Mechanismen und Signalwege beteiligt Embryogenese^8,9ergeben. In der Tat die Methode auf naa10 Pflanzen angewendet wurde, und festgestellt wurde, dass die abnorme Arbeitsteilung der Hypophyse in den Mutanten durch eine Veränderung der Auxin-Verteilung während der Embryogenese⁵verursacht werden kann.

Protokoll

Hinweis: Dieses Protokoll besteht aus drei Teilen: 1) beobachten die Musterbildung in Wildtyp Arabidopsis Embryonen mit DIC Mikroskopie; (2) Charakterisierung der Embryo Muster Bildung über die Beobachtung der Marker Proteinexpression mit konfokale Laser-scanning-Mikroskopie; und 3) Ermittlung der Rolle eines bestimmten Gens in der Embryogenese (mit den naa10 -Mutanten als Beispiel).

(1) Ovulum Clearing

1. Vorbereitung des pflanzlichen Materials
   Hinweis: Die hier beschriebene Protokoll ist ein Beispiel wie man gesunde Pflanzen wachsen; andere Möglichkeiten, um gesunde Pflanzen wachsen auch funktionieren.
   1. Ein 1,5 mL-Tube 100 Samen hinzu, und fügen Sie dann 1 mL 1,5 % Natriumhypochlorit (Mix 15 mL 10 % Chlor mit 85 mL Wasser), um den Samen für 5 min. invertieren das Rohr mehrmals sterilisieren, um sicherzustellen, dass die Samen und die Lösung gut gemischt, um die Oberfläche Samen vollständig zu sterilisieren.
   2. Zwingen Sie die Samen auf den Boden des Rohres durch Zentrifugation für 30 s bei 1.200 x g, den Überstand zu entfernen und waschen die Samen mit sterilem Wasser viermal bei einer Bank, die restlichen Natriumhypochlorit zu entfernen.
   3. 1 Liter Reinstwasser 4,4 g Murashige und Skoog (MS) basale Salzgemisch und 10 g Saccharose hinzufügen. Rühren Sie die Mischung der Salze und Saccharose zu lösen. Die Lösung auf pH 5.8 mit 1 M KOH, passen Sie die MS-Saccharose-Lösung 3 g Geliermittel, wie Phytagel, hinzu, und sterilisieren Sie die Lösung bei 121 ° C für 15 min, MS Medium zu machen.
   4. Gießen Sie 30 mL des Mediums MS in der 12-cm-Kulturschale MS mittlere Platten zu generieren.
   5. Legen Sie die sterilisierten Samen auf der MS-Platte. Übertragen Sie die Platte zu einer Kammer, Wachstum und halten Sie die Platte unter langen Tage Bedingungen (22 ° C 16 h im Licht und 18 ° C für 8 h im Dunkeln) nach Samen Schichtung (3 Tage bei 4 ° C im Dunkeln).
   6. Übertragen Sie nach 8 Tagen des Wachstums die Pflanzen auf Böden (Mischung nährstoffreichen Boden und Vermiculit im Verhältnis 1:1) in einer Schale, das Fach mit einem weißen, transparenten Deckel für 5 Tage, um den Wasserverlust zu vermeiden, und lassen Sie einen Abstand zur Verglasung der Pflanzen zu vermeiden.
   7. Nehmen Sie den Deckel von der Ablage und pflegen Sie die Pflanzen in einer begehbaren Kammer unter langen Tage Bedingungen (siehe 1.1.5). Schalten Sie das Licht auf 06:00 und ab auf 22:00. Nach ca. 20 Tagen des Wachstums in der begehbaren Kammer werden die Pflanzen geblüht und Siliques produziert haben.
   8. Die Blütenknospen mit einem Faden an der Position des Samens Stiele in dem Blütenstand um 20:00 Mark (verwenden Sie nicht die erste, die dritte Blütenknospen; die Siliques erzeugt in der Regel von diesen Blütenknospen entwickeln ein paar abgebrochene Samen, und kann dies zu ändern, des Anteils der normal, abnorme Eizellen). Beginn der Befruchtung der Eizelle als zu definieren, wenn die markierten Knospe öffnet um 08:00 am nächsten Morgen zu blühen.
2. Vorbereitung der Hoyer Lösung
   1. 24 g Chloral Hydrate, ein 50-mL-Tube und wickeln Sie das Rohr komplett mit Alu-Folie (Lösungen von Chloral Hydrate sind nicht stabil unter Licht).
   2. Als nächstes die obige Lösung 9 mL Reinstwasser und 3 mL Glycerin hinzu und schütteln Sie das Rohr Chloral Hydrate zu lösen. Hoyers Lösung zu machen, lassen Sie das Röhrchen über Nacht bei Raumtemperatur, Luftblasen zu beseitigen stehen.
3. Ovulum Trennung und Abfertigung
   1. Legen Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband auf einen Glas-Objektträger. Legen Sie eine Schote für die gewünschte Anzahl der Tage nach der Bestäubung (DAP) auf der Folie mit der Pseudoseptum senkrecht zur Fläche angebaut; Diese erleichtern die Fruchtblätter (Abbildungen 1A und 1 b) aufgeteilt.
   2. Die Fruchtblätter auf beiden Seiten der Pseudoseptum mit einer Spritzennadel aufgeteilt und die beiden seziert Fruchtblätter zur Folie so befestigen, dass die Eizellen in der Schote unter ein Stereoskop (Zahlen 1 und 1 D) sichtbar sind.
   3. Verzichten Sie 70 µL Hoyers Lösung auf den Objektträger zu, und befeuchten Sie die Spitze des feinen Spitzen Pinzette mit Hoyers Lösung durch Eintauchen. Bewegen Sie das Stereoskop mit die Eizellen in der Hoyer-Lösung auf der Folie mit der Pinzette um die Embryonen zu reinigen. Die Folie sanft zu vermeiden, Luftblasen erzeugen zuweisen Sie ein Deckglas.
   4. Setzen Sie die fertigen Folie in eine Box in einem dunklen Raum für 2 bis 12 h (je reifer ein Ovulum ist, desto mehr Zeit benötigt wird) bei Raumtemperatur. Embryonen im 2/4-Zell-Stadium (1-2 DAP) können mikroskopisch nach 2 h, beobachtet werden, während Embryonen zwischen der Oktant und kugelige Anfangsphase (3 DAP) nach 4 h beobachtet werden können. Reifere Embryonen (4-8 DAP) können nach 12 h beobachtet werden.
   5. Geräumte Ovula mit der DIC-Funktion eines Mikroskops zu untersuchen. Suchen Sie die Embryonen unter einem Niedrigenergie-Feld (10 X) und ändern Sie dann zu einem Hochleistungs-Feld (100 X Öl Immersion Objektiv) zu das zelluläre Muster in den entwickelten Embryonen zu beobachten.
   6. Prüfen Sie die Embryonen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien.

2. Charakterisierung der Embryo Musterung und Zelle Identität über die Beobachtung der Marker Protein-Expression

1. Vorbereitung von Pflanzenmaterial
   1. Klonen der Projektträger und Codierung Abfolge von der Marker-gen oder Hormon-Response-Element und dann verschmelzen mit einem fluoreszierenden Protein (z. B. GFP); als nächstes fügen Sie das Konstrukt in der binären Vektor (z. B. pCambia1300). Hier ist die Auxin Response-Element als ein Beispiel¹⁰ DR5 präsentiert.
   2. Die daraus resultierende DR5-GFP -Plasmid in Wildtyp Pflanzen durch Agrobacterium Tumefacienseinführen-vermittelten Umwandlung¹¹. Wählen Sie unter Verwendung der MS mittlere Platten mit Hygromycin T1-Pflanzen (50 mg/mL Mutterlauge, verdünnt 1:1, 000). Die transgenen Pflanzen werden weisen lange Wurzeln und zwei Blätter der Rosette nach 8 Tagen unter den beschriebenen Bedingungen in 1.1.5 Wachstum zu generieren.
   3. Die transgenen Pflanzen auf Boden übertragen und gemäß 1.1.6 und 1.1.7 kultivieren.
   4. Sammle die T2-Samen von der unabhängigen T1-Leitungen. Die Saat auf MS-Hygromycin Platten, wählen Sie die Pflanzen tragen eine Kopie der DR5-GFP -Einfügung (das Verhältnis von resistenten Pflanzen zu empfindlichen Pflanzen werden etwa 3:1), und übertragen Sie sie auf den Boden.
   5. Die T2-Pflanzen zu kultivieren, gemäß 1.1.6 und 1.1.7.
   6. Die T3-Samen aus den T2-Pflanzen zu sammeln. Die Saat auf MS-Hygromycin Platten, wählen Sie die homozygoten transgenen Pflanzen (alle Pflanzen aus einer einzigen Zeile wird Hygromycin-Resistenz aufweisen), und übertragen Sie sie auf den Boden.
   7. Markieren Sie die Blütenknospen der homozygoten T3 Pflanzen wie in 1.1.8 angegeben.
2. GFP-Signal-Beobachtung
   1. Mischen Sie 3 mL des Glycerins mit 47 mL Reinstwasser, eine 6 %-Glycerin-Lösung zu generieren.
   2. Legen Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband auf einen Glas-Objektträger und beheben Sie eine Schote zu, wie in 1.3.1 angegeben.
   3. Die Fruchtblätter auf beiden Seiten der Pseudoseptum mit einer Spritzennadel aufgeteilt und die Folie unter ein Stereoskop zwei seziert Fruchtblätter beimessen, gemäß 1.3.2.
   4. Verzichten Sie 30 µL 6 % Glycerin auf den Objektträger zu, und platzieren Sie alle Ovula aus seziert Fruchtblätter in die Lösung mit einer feinen Spitze Pinzette. Platzieren Sie ein Deckglas vorsichtig auf der Folie.
   5. Da die Samenschale und Endosperm in jedem Ovulum die Beobachtung der GFP Signale des Embryos verhindern können, entziehen des Embryos das Ovulum. Tippen Sie auf die Folie, schnell und schonend zu den Embryo aus das Ovulum Extrudieren (je reifer ein Ovulum ist, die weniger Kraft auf der Folie angewendet werden sollten).
   6. Untersuchen Sie die Folie für GFP Fluoreszenz mit konfokale Laser-scanning-Mikroskopie. Finden die isolierte Embryonen unter einem Niedrigenergie-Feld (10 X) und notieren Sie den Speicherort, dann ändern Sie in einem Hochleistungs-Feld (100 X Öl Immersion Objektiv), DR5-GFP Ausdruck in der Embryonen zu beobachten, indem Sie die Erregung Lichtquelle auf 488 nm für die Erkennung des GFP-Signals.
   7. Erkennen Sie den GFP-Ausdruck in die Embryonen, die geeignete T3-Linie zur weiteren Analyse auszuwählen.

3. Charakterisierung der Embryo Musterbildung in einem Embryo-tödliche Mutant über Ovulum Clearance und Marker Protein Beobachtung: Naa10 als Beispiel

1. Embryo-Musterung in naa10 mutierte Pflanzen
   1. Bereiten Sie die pflanzlichen Rohstoffen, wie in 1.1.1-1.1.7 angegeben.
   2. Identifizieren der naa10^{+ / −} Pflanzen mittels PCR mit Gen-spezifische Primer⁵, und markieren Sie dann die Blütenknospen der Naa10^{+ / −} Pflanzen wie in 1.1.8 angegeben.
   3. Ausführen Ovulum Clearance und die mikroskopische Untersuchung von Naa10^{+ / −} Embryonen wie in 1.2 und 1.3 angegeben.
2. Marker-Protein-Analyse mit naa10 Embryonen
   1. Erhalten Sie geeignete DR5-GFP transgene Linien in 2.1-2.2 beschriebene Verfahren verwenden.
   2. Überqueren eine homozygote DR5-GFP transgene Linie mit einem Naa10^{+ / −} Pflanze, Naa10 zu erhalten^{+ / −} Pflanzen, die homozygot für die GLP-Fluoreszenz-Markierung an der F2-Generation (gekennzeichnet durch Gen-spezifische PCR) zur Charakterisierung von naa10^{+ / −5} und beobachten das GFP-Signal unter dem Mikroskop mit einer homozygot DR5-GFP -Linie.
   3. Markieren Sie die Blütenknospen der Naa10^{+ / −} Pflanzen, die homozygot für DR5-GFP wie in 2.1.7 angegeben sind.
   4. Suchen Sie nach den GFP-Signal im naa10 Embryonen, die homozygot für DR5-GFP wie in 2.2 angegeben sind.

Ergebnisse

In diesem Artikel beschriebene Methode kann verwendet werden, Embryogenese direkt unter dem Mikroskop zu beobachten, kommentieren die Zelle-Identität-Spezifikation in der Embryogenese mit spezifischer Marker und charakterisieren die Rolle eines bestimmten Gens in der Embryogenese.

Repräsentative Ergebnisse aus der Analyse des Embryos (von der länglichen Zygote-Bühne auf der walking-Stick Reifestadium) in Wildtyp Arabidop...

Diskussion

Ovulum Abstand ist eine nützliche Methode für die Erkennung der Zellteilung und Beurteilung der Morphologie in der Embryogenese in Arabidopsis; mit dieser Technik können Embryonen direkt unter DIC Mikroskopie^5,12beobachtet werden. Der entscheidende Schritt zur Abfertigung ein Ovulum ist Schritt 1.3.4. Der Zeitaufwand zur Abfertigung ein Ovulum im Schritt 1.3.4 ist variabel. Embryonen im 2/4-Zell-Stadium können klar nach 2 h in der Hoyer-Lösung beoba...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chloral Hydrate	Sigma	15307
Murashige and Skoog Basal Medium	Sigma	M5519
Phytagel	Sigma	P8169
Hygromycin	Roche	10843555001
Growth chamber	Percival	CU36L5
Fluorescence microscope	Zeiss Oberkochen	Zeiss Image M2	camera: AxioCam 506 color
Confocal Laser Scanning Microscopy	Zeiss Oberkochen	Zeiss LSM 5	filters: BP 495 - 555 nm
Stereoscope	Zeiss Oberkochen	Axio Zoom V16	camera: AxioCam MRc5
nutrient-rich soil	KLASMANN, Germany
50-mL tube	Corning Inc.
1.5-mL tube	Corning Inc.
10% sodium hypochlorite solution			Domestic analytical reagent
sucrose			Domestic analytical reagent
KOH			Domestic analytical reagent
glycerol			Domestic analytical reagent
culture dish			Domestic supplies
vermiculite			Domestic supplies
glass slide			Domestic supplies
syringe needle			Domestic supplies
fine-tipped tweezers			Domestic supplies
super clean bench			Domestic equipment