Un método para la caracterización de embriogénesis en Arabidopsis

Resumen

Este protocolo describe un método para la observación de embriogénesis en Arabidopsis vía separación de óvulo, seguido por la inspección de la formación de patrones de embrión bajo un microscopio.

Resumen

Dada la naturaleza altamente predecible de su desarrollo, embriones de Arabidopsis se han utilizado como modelo de estudios de morfogénesis en plantas. Sin embargo, embriones en fase temprana de plantas son pequeños y contienen pocas células, haciéndolas difíciles de observar y analizar. Aquí se describe un método para caracterizar la formación de embriones de la planta bajo el microscopio utilizando el organismo modelo Arabidopsis. Tras la separación de óvulos frescos usando solución de Hoyer, pudieran observarse el número de celular de y morfología de los embriones, y su etapa de desarrollo podría ser determinado por microscopía de contraste de interferencia diferencial usando un 100 X lente de inmersión de aceite. Además, la expresión de proteínas del marcador específico etiquetadas con proteína fluorescente verde (GFP) fue supervisada para anotar la especificación de identidad de la célula durante el dibujo de embrión por microscopía de láser confocal. Así, este método puede utilizarse para observar la formación de embriones de la planta de tipo salvaje a nivel celular y molecular y caracterizar el papel de genes específicos en modelar embrionario mediante la comparación de la formación de patrones en los embriones de las plantas de tipo silvestre y mutantes letales para el embrión. Por lo tanto, el método puede utilizarse para caracterizar la embriogénesis en Arabidopsis.

Introducción

Embriogénesis es el evento más temprano en el desarrollo de las plantas superior. Una forma de embriones maduros de un cigoto por división celular y diferenciación bajo estricto control genético^1,2. Embriones de Arabidopsis son un modelo útil para estudiar el control de la morfogénesis porque la secuencia de divisiones celulares durante la embriogénesis sigue un patrón esperado^3,4. Sin embargo, un embrión de Arabidopsis con una a varias células es demasiado pequeño para ser observado y analizado. Además, la mutación de ciertos genes puede causar embrión letalidad⁵, que indica el papel clave de estos genes en la embriogénesis. La caracterización de la formación de patrones en los mutantes letales para el embrión constituye una base para entender el mecanismo molecular por el que genes esenciales regulan el desarrollo embrionario.

Un método detallado se describe aquí para la caracterización de la formación de patrón del embrión en la planta modelo Arabidopsis por observación microscópica directa. El método implica la separación del óvulo seguido por la observación microscópica de un embrión. También se describe la caracterización de un mutante letal para el embrión.

La morfología de los embriones en diferentes etapas de desarrollo se puede determinar directamente por microscopia con los óvulos que han sido borrados solución^{6,7 de Hoyer}. Estos óvulos exhiben un alto índice de refracción; así, este óvulo claro método es especialmente ventajoso para las muestras que deben ser observadas por microscopia de interferencia diferencial (DIC) de contraste.

Además, los genes que se expresan en una celda determinada o un número limitado de células durante la embriogénesis pueden utilizarse como marcadores para identificar las células en un embrión. Por lo tanto, la especificación de identidad celular durante la embriogénesis se puede anotar mediante el control de la expresión de proteínas del marcador etiquetado GFP utilizando microscopía de láser confocal. Por el contrario, observando el patrón de expresión de un gen funcional desconocida -GFP fusion durante la embriogénesis puede proporcionar un vínculo entre patrones de embrión y la expresión de ese gen y facilitar la identificación de nuevos genes que se requieren para la embriogénesis en Arabidopsis.

El método aquí descrito puede utilizarse también para caracterizar el fenotipo de un mutante letal para el embrión y para determinar el impacto del gen afectado en la embriogénesis a nivel celular. Además, en combinación con una comparación de los patrones de expresión de genes marcadores durante la embriogénesis entre plantas tipo salvaje y mutantes, el método puede producir pistas sobre los mecanismos moleculares y las vías de señalización implicadas en la embriogénesis^8,9. De hecho, el método fue aplicado a las plantas de naa10 , y se encontró que la división anormal de la hipófisis en el mutante puede ser causada por un cambio en la distribución de la auxina durante embriogénesis⁵.

Protocolo

Nota: Este protocolo tiene tres partes: 1) observando la formación de patrones en embriones de Arabidopsis de tipo salvaje utilizando microscopía DIC; 2) caracterizar el embrión patrón formación a través de la observación de la expresión de la proteína del marcador mediante láser confocal de barrido microscopía; y 3) determinar el papel de un gen específico en la embriogénesis (usando el mutante de naa10 como ejemplo).

1. el óvulo claro

1. Preparación de material de planta
   Nota: El protocolo descrito aquí es un ejemplo de cómo hacer crecer plantas sanas; otras maneras de crecer plantas sanas también trabajan.
   1. Añade 100 a un tubo de 1,5 mL y luego añadir 1 mL de hipoclorito de sodio 1.5% (15 mL de 10% de cloro con 85 mL de agua de la mezcla) para esterilizar las semillas durante 5 minutos invertir el tubo varias veces para asegurar que las semillas y la solución bien mezcladas para esterilizar las superficie semillas completamente.
   2. Forzar las semillas en la parte inferior del tubo de centrifugación durante 30 s a 1.200 x g, eliminar el sobrenadante y lavar las semillas con agua destilada cuatro veces en un banco para eliminar el hipoclorito residual.
   3. Añadir a 1 L de agua ultrapura 4,4 g de mezcla sal basal Murashige y Skoog (MS) y 10 g de sacarosa. Revolver la mezcla para disolver las sales y la sacarosa. Ajustar la solución a pH 5.8 con 1 M de KOH, añadir 3 g de agente gelificante, como Phytagel, a la solución de sacarosa de MS y para esterilizar la solución a 121 ° C durante 15 min hacer MS medio.
   4. Vierta 30 mL de medio MS en una placa de cultivo de 12 cm para generar placas de medio MS.
   5. Coloque las semillas estériles en la placa MS. Transferir la placa a una cámara de crecimiento y mantenga la placa bajo condiciones de día largo (22 ° C por 16 h en la luz y 18 ° C durante 8 h en la oscuridad) después de la estratificación de la semilla (3 días a 4 ° C en la oscuridad).
   6. Después de 8 días de crecimiento, transferir las plantas al suelo (mezcla rica en nutrientes suelo y vermiculita en una proporción 1:1) en una bandeja, cubrir la bandeja con una tapa blanca, transparente por 5 días evitar pérdida de agua y deje un espacio para evitar la vitrificación de las plantas.
   7. Tomar la tapa de la bandeja y cultivar las plantas en una cámara independiente bajo condiciones de día largo (ver 1.1.5). Encender la luz en 6:00 y fuera a 22:00. Después de 20 días de crecimiento en la cámara de cabina, las plantas habrán floreció y produjo silicuas.
   8. Marca de tallos de brotes de la flor con un hilo en la posición de la semilla en la inflorescencia en 20:00 (no utilice la primera a la tercera flor; las silicuas generados a partir de estos capullos generalmente desarrollan algunas semillas abortadas, y esto puede alterar la proporción de normales a anormales óvulos). Definir el inicio de la polinización el óvulo como cuando el brote marcado se abre en flor en 8:00 la mañana siguiente.
2. Preparación de solución de Hoyer
   1. Añadir a un tubo de 50 mL 24 g de hidrato de cloral y envuelva el tubo completamente con papel de aluminio (no son estables bajo luz soluciones de hidrato de cloral).
   2. A continuación, añadir 9 mL de agua ultrapura y 3 mL de glicerol a la solución anterior y agitar el tubo para disolver el hidrato de cloral. Para hacer solución de Hoyer, dejar que el tubo soporte de la noche a temperatura ambiente para eliminar cualquier burbuja.
3. Separación y separación del óvulo
   1. Coloque un pedazo de cinta adhesiva de doble cara a un portaobjeto de microscopio. Coloque una silicua crecido para el número deseado de días después de la polinización (DAP) de la diapositiva con la pseudoseptum perpendicular a la superficie; Esto hará fácil dividir los carpelos (figuras 1A y 1B).
   2. Dividir los carpelos en ambos lados de la pseudoseptum con una aguja de jeringa y coloque los dos carpelos disecados a la diapositiva para que los óvulos en la silicua son visibles bajo un estereoscopio (figuras 1C y 1D).
   3. Dispensar de 70 μl de solución de Hoyer en el portaobjetos de cristal y luego humedecer la punta de un par de pinzas de punta fina con solución de Hoyer por inmersión. Usando el estereoscopio, mover los óvulos en la solución de Hoyer en el portaobjetos con las pinzas para limpiar los embriones. Se aplica un cubreobjetos a la diapositiva suavemente para evitar la generación de burbujas.
   4. Colocar la corredera acabada en una caja en un cuarto oscuro de 2-12 h (cuanto más madura un óvulo es, cuanto más tiempo se necesitará) a temperatura ambiente. Embriones en la etapa de 2/4-cell (DAP de 1-2) pueden observarse microscópicamente después de 2 h, mientras que los embriones entre el octante y estadios globulares (DAP 3) se observan después de 4 h. Embriones más maduros (4-8 UTA) pueden observarse después de 12 h.
   5. Examinar los óvulos hayan borrado usando la función DIC de un microscopio. Coloque los embriones en un campo de baja potencia (10 X) y luego cambiar a un campo de alta potencia (objetivo de inmersión del aceite del X 100) para observar el patrón celular en los embriones desarrollados.
   6. Examinar los embriones en diferentes etapas de desarrollo.

2. Caracterización de patrones de embrión e identidad de la célula a través de la observación de la expresión de la proteína de marcador

1. Preparación de materiales de planta
   1. Clonar el promotor y la secuencia del marcador gene u hormona respuesta elemento de codificación y luego fusionarlo con una proteína fluorescente (como GFP); a continuación, inserte el construir el vector binario (por ejemplo, pCambia1300). Aquí, el elemento de respuesta a auxinas DR5 se presenta como un ejemplo¹⁰.
   2. Introducir el plásmido resultante del DR5-GFP en las plantas de tipo silvestre por tumefaciens de la agrobacteria-mediado transformación¹¹. Seleccione las plantas de T1 utilizando placas de medio de MS con Higromicina (50 mg/mL de licor de madre, diluido 1:1, 000). Las plantas transgénicas se exhiben largas raíces y generar dos hojas de la roseta después de 8 días de crecimiento bajo las condiciones descritas en 1.1.5.
   3. Transferir las plantas transgénicas a tierra y cultivarlos como se indica en 1.1.6 y 1.1.7.
   4. Recoger las semillas de la T2 de las líneas T1 independiente. Sembrar las semillas en las placas de EM-Higromicina, seleccionar las plantas portadoras de una copia de la inserción del DR5-GFP (la proporción de plantas resistentes a las plantas sensibles será aproximadamente 3:1) y transferencia al suelo.
   5. Cultivar las plantas de T2 como se indica en 1.1.6 y 1.1.7.
   6. Recoger las semillas de la T3 de las plantas de T2. Sembrar las semillas en las placas de EM-Higromicina, seleccionar las plantas transgénicas homocigóticas (todas las plantas de una sola línea muestran resistencia Higromicina) y transferir al suelo.
   7. Marque los botones florales de las plantas homocigóticas de T3 como se indica en 1.1.8.
2. Observación de señal GFP
   1. Mezclar 3 mL de glicerol con 47 mL de agua ultrapura para generar una solución de glicerol 6%.
   2. Adhiera un pedazo de cinta adhesiva de doble cara a un portaobjetos de vidrio y fijar una silicua como se indica en 1.3.1.
   3. Dividir los carpelos en ambos lados de la pseudoseptum con una aguja de jeringa y coloque los dos carpelos disecados en el portaobjetos bajo un estereoscopio como se indica en 1.3.2.
   4. Dispensar 30 μl de 6% de glicerol en el portaobjetos de cristal y colocar todos los óvulos de los carpelos disecados en la solución con unas pinzas de punta fina. Colocar suavemente un cubreobjetos sobre el portaobjetos.
   5. Como la capa de semilla y endospermo en cada óvulo pueden impedir la observación de las señales de la GFP en el embrión, extraer el embrión el óvulo. Puntee la diapositiva rápidamente y suavemente a extraer el embrión desde el óvulo (más madura un óvulo es, menos fuerza se debe aplicar a la diapositiva).
   6. Examinar el portaobjetos usando microscopía de láser confocal de la fluorescencia de GFP. Encontrar los embriones aislados en un campo de baja potencia (10 X) y registrar su ubicación, luego cambiar a un campo de alta potencia (objetivo de inmersión del aceite del X 100) para observar la expresión DR5-GFP en los embriones mediante el establecimiento de la fuente de luz de excitación de 488 nm para la detección de la señal de la GFP.
   7. Detectar la expresión de GFP en los embriones para seleccionar la línea T3 adecuada para su posterior análisis.

3. Caracterización de la formación embrionaria en un mutante letal embrión mediante separación del óvulo y marcador proteína observación: Naa10 como ejemplo

1. Dibujo del embrión en plantas mutantes naa10
   1. Preparar los materiales de planta como se indica en 1.1.1-1.1.7.
   2. Identificar la naa10^{+ / −} plantas por PCR utilizando cebadores específicos del gen⁵y marca luego los capullos de la naa10^{+ / −} plantas como se indica en 1.1.8.
   3. Realizar la separación del óvulo y la examinación microscópica del naa10^{+ / −} embriones como se indica en 1.2 y 1.3.
2. Análisis de la proteína del marcador naa10 embriones
   1. Obtener convenientes líneas transgénicas DR5-GFP utilizando el procedimiento descrito en 2.1-2.2.
   2. Cruzar una línea transgénica homocigótica de DR5-GFP con un naa10^{+ / −} planta para obtener naa10^{+ / −} plantas que son homocigóticas para el marcador de la fluorescencia de GFP en la generación F2 (identificada por PCR de genes específicos) caracterizar naa10^{+ / −5} y observe la señal GFP bajo el microscopio utilizando una línea homocigótica del DR5-GFP .
   3. Marcar los botones florales de naa10^{+ / −} plantas que son homocigóticas para DR5-GFP como se indica en 2.1.7.
   4. La búsqueda de la señal de la GFP en naa10 los embriones que son homocigotos para DR5-GFP como se indica en 2.2.

Resultados

El método descrito en este documento puede utilizarse para observar la embriogénesis directamente bajo un microscopio, anotar la especificación de identidad celular durante la embriogénesis con marcadores específicos y caracterizar el papel de un gen en particular durante la embriogénesis.

Resultados representativos a partir del análisis de patrones (de la etapa de cigoto alargada a la etapa madura del bastón) en el tipo...

Discusión

Óvulo es un método útil para detectar la división celular y la evaluación de morfología durante la embriogénesis en Arabidopsis; usando esta técnica, embriones pueden ser observados directamente bajo DIC microscopía^5,12. El paso crítico para la remoción del óvulo es paso 1.3.4. El tiempo requerido para la remoción del óvulo en el paso 1.3.4 es variable. Embriones en la etapa de 2/4-cell pueden observarse claramente después de 2 h en soluci...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chloral Hydrate	Sigma	15307
Murashige and Skoog Basal Medium	Sigma	M5519
Phytagel	Sigma	P8169
Hygromycin	Roche	10843555001
Growth chamber	Percival	CU36L5
Fluorescence microscope	Zeiss Oberkochen	Zeiss Image M2	camera: AxioCam 506 color
Confocal Laser Scanning Microscopy	Zeiss Oberkochen	Zeiss LSM 5	filters: BP 495 - 555 nm
Stereoscope	Zeiss Oberkochen	Axio Zoom V16	camera: AxioCam MRc5
nutrient-rich soil	KLASMANN, Germany
50-mL tube	Corning Inc.
1.5-mL tube	Corning Inc.
10% sodium hypochlorite solution			Domestic analytical reagent
sucrose			Domestic analytical reagent
KOH			Domestic analytical reagent
glycerol			Domestic analytical reagent
culture dish			Domestic supplies
vermiculite			Domestic supplies
glass slide			Domestic supplies
syringe needle			Domestic supplies
fine-tipped tweezers			Domestic supplies
super clean bench			Domestic equipment