تقييم انخفاض الذاكرة المكانية في نموذج الماوس من إصابات الدماغ الصدمة باستخدام متاهة فقي المياه شعاعي

Summary

هنا نقدم بروتوكول لاختبار الماوس محددة من الإدراك الذي لا يتطلب السباحة. ويمكن استخدام هذا الاختبار لتمييز بنجاح الفئران إصابة الدماغ الناجم عن تأثير القشرية التي تسيطر عليها من الضوابط صورية.

Abstract

وعلى الرغم من الزيادة الأخيرة في استخدام نماذج الفأر في البحث العلمي، إلا أن الباحثين يواصلون استخدام المهام المعرفية التي صممت أصلا وتم التحقق من صحتها لاستخدام الفئران. وقد تبين اختبار متاهة المياه شعاعي (روت) من الذاكرة المكانية (المصممة خصيصا للفئران والتي لا تتطلب السباحة) سابقا للتمييز بنجاح بين الفئران تبي التي تسيطر عليها تأثير القشرية والضوابط التي تسيطر عليها. وهنا يقدم بروتوكول مفصل لهذه المهمة. المتاهة روت تستفيد من الميل الطبيعي للفئران لتجنب المناطق المفتوحة لصالح تعانق جانبي جهاز (ثيغموتاكسيس). تصطف جدران المتاهة مع تسعة فتحات الهروب وضعت فوق أرضية الجهاز، ويتم تدريب الفئران لاستخدام الإشارات البصرية لتحديد موقع حفرة الهروب الذي يؤدي للخروج من المتاهة. يتم تعبئة متاهة مع شبر واحد من الماء البارد، كافية لتحفيز الهروب ولكن ليس عميقا بما يكفي لتتطلب أن السباحة الفأر. تستغرق فترة الاستحواذ أربعة تدريب فقطأيام، مع اختبار الاحتفاظ الذاكرة في اليوم الخامس واختبار الذاكرة على المدى الطويل في يوم 12. تشير النتائج الواردة هنا إلى أن متاهة روت هو بديل ممكن للاختبارات المعتمدة على الفئران، والسباحة المعرفية القائمة على السباحة في تقييم المكاني العجز في الذاكرة في نماذج الماوس من تبي.

Introduction

ضعف الذاكرة هي من بين الأعراض الأكثر شيوعا التي أبلغ عنها المرضى بعد إصابات الدماغ الصدمة (تبي) ^{1 ، 2} . ولذلك فإن التحديد الدقيق والتقييم لعجز الذاكرة المماثل في النماذج الحيوانية من تبي، ضروريان لفهمنا لهذا الشرط وإدارته. هنا، نقدم بروتوكول لاختبار الذاكرة المكانية في نموذج الماوس من تبي باستخدام متاهة المياه شعاعي (روت). وقد عرض هذا الجهاز في السابق لتقييم العجز المعرفي في نماذج الماوس من تأثير القشرية التي تسيطر عليها (تسي) التي يسببها تبي ³ ، ويمثل بديلا محتملا للاختبارات المصادقة على الفئران، والسباحة من الإدراك.

وقد أدى التنوع المتنامي وتوافر نماذج الماوس المعدلة وراثيا إلى زيادة في الآونة الأخيرة في استخدام الفئران على الفئران في البحث العلمي ⁴ . وعلى الرغم من هذا التحول، يواصل الباحثون الاعتماد على السلوكية أوالمهام المعرفية التي صممت أصلا والتحقق من صحتها لاستخدام الفئران. الاختبارات الأكثر شيوعا المستخدمة حاليا لتقييم الإدراك في الفئران، موريس المياه المتاهة (موم) ومتاهة بارنز دائرية، صممت خصيصا للاستفادة من السلوكيات الغريزية الموجودة في الفئران ^{5 ، 6} . وبالنظر إلى الاختلافات الوراثية، العصبية، والمعرفية التي توجد بين هذين النوعين ⁴ ، فإنه ليس من المستغرب أن الفئران على نحو مستمر أداء أقل على هذه المهام ^{7 ، 8} .

الاختلافات التي تعتمد على الأنواع في القدرة على الاختبار هي ذات أهمية خاصة في الاختبارات المعرفية القائمة على السباحة، مثل موم. في حين أن الفئران والفئران على حد سواء السباحين بارعة، وقد حدد الباحثون العديد من سلالات الماوس التي أداء سيئة بشكل ملحوظ على المهام المعرفية على أساس السباحة ^{9 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13} . حتى في الحيوانات من نوع البرية، الفئران عموما تتفوق على الفئران ^{7 ، 8} . في حين أن هذا يمكن أن يفسر على أنه فرق نوع معين في الذاكرة المكانية، اختبار المتابعة مماثلة باستخدام متاهة الأرض الجافة كشفت أي اختلافات تعتمد على الأنواع في الأداء المعرفي ⁸ . وهناك عدد من العوامل التي لا علاقة لها بالإدراك يمكن أن تمثل هذه النتيجة، بما في ذلك الاختلافات التي تعتمد على الأنواع في إما القدرة على السباحة أو استراتيجية البحث. في الواقع، تحليل عامل استراتيجيات البحث الماوس محددة في موم تبين أن العوامل غير المعرفية (على وجه الخصوص، ثيغوموتاكسيس والسلبية [ أي ، العائمة]) قد تلعب دورا أكثر أهمية في أداء موم من التعلم المكاني ¹⁴ .

هنا، ونحن نبرهن على استخدام اختبار المعرفي مصممة للاستفادة من فيالسلوك الغريني للفئران، والتي لا تتطلب السباحة، لقياس ضعف الذاكرة المكانية في نموذج الماوس من تسي التي يسببها تبي. في حين تم تصور متاهة روت ( الشكل 1 A-B ) باعتباره هجين رواية من متوم و بارنز المتاهة الدائرية، تم تصميمه خصيصا للاستفادة من السلوك ثيغموتاكتيك غريزية للفئران ^{15 ، 16} . يتكون الجهاز من 32 بوصة قطرها الصلب المجلفن الحوض الذي تسعة بالملل الثقوب خروج متباعدة بالتساوي. وتتركز الثقوب 2-1 / 4 بوصة فوق أرضية الحوض وحجمها لتناسب عادة المتاحة 1-1 / 2 بوصة عبس دوف سبغ × سج محولات فخ. ثمانية من المخارج توج من الخارج وعمى عمق 1 بوصة مع سدادات مطاطية. يتم توصيل التاسع من قبل 90 درجة أكريلونيتريل بوتادين الستايرين (عبس) الكوع إلى مربع من البلاستيك مبهمة من الماوس الذي يمكن إزالتها بسهولة بعد الاختبار. على مدار أفترة اكتساب قصيرة، يتم تدريب الماوس لاستخدام الإشارات البصرية فريدة من نوعها بطانة المتاهة لتحديد موقع هذا المربع الهروب. خلال الاختبار، يتم تعبئة متاهة مع شبر واحد من الماء البارد (12-14 درجة مئوية)، بما فيه الكفاية عافية بما فيه الكفاية لتعزيز الهروب، ولكن ليس عميقا بما فيه الكفاية أن الفأر هو مطلوب للسباحة.

متاهة روت يمثل منخفضة التكلفة، وبدائل صيانة منخفضة ل موم، وقد استخدمت بنجاح في الفئران القديمة و المعدلة وراثيا ^{15 ، 17 ، 18 ، 19} ، و تسي التي يسببها نماذج الماوس من تبي ³ . بروتوكول المبينة هنا يمثل طريقة بسيطة وفعالة لقياس ضعف الذاكرة المكانية التي لا تتطلب التدريب قبل الإصابة، ويمكن تعديلها بسهولة لتتناسب مع الاحتياجات الخاصة لمختبر البحوث.

Protocol

وقد أجريت جميع الإجراءات والتعامل مع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان الصادرة عن المعاهد الوطنية للصحة ولجنة رعاية الحيوان واستخدام جامعة واشنطن.

1. الجراحة

1. تخدير الماوس في 5٪ إيسوفلوران في مربع التعريفي حتى فاقد الوعي. تأكيد التخدير من خلال انخفاض في معدل التنفس وغياب منعكس الانسحاب التالية أخمص القدمين قرصة.
2. الحفاظ على التخدير عن طريق مخروط الأنف في 2-2.5٪ طوال الجراحة. مراقبة معدل التنفس طوال الجراحة لضمان الماوس لا يزال فاقد الوعي.
3. ضع الماوس عرضة على وسادة التدفئة ووضع الماوس في الجهاز المجسم باستخدام أشرطة الأذن، وضمان أن الرأس هو آمن ومسطح.
4. إزالة الشعر من فروة الرأس باستخدام كريم إزالة الشعر. شطف فروة الرأس جيدا مع المالحة.
5. تنظيف الموقع الجراحي مع اليود بالتناوب وغسل الايثانول 70٪.
6. Administeرا حقن تحت الجلد من يدوكائين و بوبيفاكين (1 ملغ / كلغ) في فروة الرأس.
7. مع مقص جراحي، وجعل شق خط الوسط طولية، وسحب الجلد للكشف عن الجمجمة.
8. باستخدام 5 ملم رأى تفرين تشكيل حج القحف فوق القشرة الجبهي الجداري الأيسر مع مركز نقطة في 2.5 مم وراء بريجما و 2.5 مم اليسار من خط الوسط. إزالة بعناية دائرة العظام لفضح الدماغ.
9. تعيين جهاز المؤثر إلى سرعة 6 م / ث و 200 مس مسكن الوقت.
10. ضع جهاز المؤثر حتى يلمس طرف التأثير المحدب 3 مم سطح الدماغ برفق عند 2.5 مم خلف بريجما و 2.55 مم من خط الوسط. اسحب طرف األثر، وأقل بمقدار 1 مم) عمق األثر (. عندما تكون جاهزة، وإطلاق النار على الجهاز، وتوليد التأثير المطلوب.
11. تغطية حج القحف مع قرص البولي بروبلين العقيمة ترسيخ إلى ديرما مع لاصقة الأنسجة، وخياطة شق مغلقة.
12. إزالة الماوس من التخدير، وإعطاء حقن إب من بوبرالإنورفين (0.5 ملغم / كغم).
13. السماح للماوس لاستعادة في قفص نظيفة، تحسنت من قبل وسادة التدفئة. وينبغي رصد الماوس لعلامات الألم أو الضيق على مدى 24 ساعة القادمة.
    ملاحظة: يجب أن تتلقى الضوابط شام معاملة مماثلة على النحو الوارد أعلاه، مع الخطوات 1.8-1.9 حذفت.

2. شعاعي المياه فقي المتاهة البناء

1. تتحمل 9 فتحات الخروج، كبيرة بما فيه الكفاية لاستيعاب 1-1 / 2 بوصة عبس دوف سبغ x سج محولات فخ، على فترات متساوية حول محيط من 32 بوصة قطرها الصلب المجلفن الحوض. مركز هذه الثقوب خروج تقريبا 2-1 / 4 بوصة فوق أرضية الحوض.
2. تناسب 1-1 / 2 بوصة عبس دوف سبغ × سج فخ محول في كل من فتحات الخروج، وتأمين مع المكسرات حلقة شملت.
3. مع سدادات مطاطية، وغطاء ثمانية من مخارج التسعة من الخارج من الجهاز. والخروج النهائي، غير المختطف سيكون بمثابة طريق الهروب. ولا يهم ما هو الخروج الذي تم تعيينه على أنه طريق الهروب.
4. إرفاق 90 درجة عبسالكوع إلى النهاية الخارجية للخروج المتبقية. و 90 درجة الانحناء يعمل على منع موضوعات الاختبار من تحديد بصريا الطريق الهروب الصحيح من داخل المتاهة.
5. قم ببناء صندوق الهروب من أي صندوق مبهم قادر على التعقيم وحوالي 30 سم × 15 سم × 15 سم. قطع حفرة على جانب مربع، مباشرة فوق الأرض، كبيرة بما فيه الكفاية لاستيعاب 90 درجة الكوع عبس.
6. إرفاق مربع الهروب إلى الطرف الطرفي من الكوع 90 درجة عبس.
7. رفع قليلا مربع الهروب (أقل من بوصة واحدة) فوق سطح الأرض. هذا يسمح غرفة واسعة لسادة التدفئة الكهربائية، أو غيرها من مصدر التدفئة، ليتم وضعها تحت مربع الهروب.
8. طباعة وصفح ما لا يقل عن 5 فريدة من نوعها، البصرية الإشارات. استخدام بسيطة، صور التباين العالي التي يمكن تمييزها بسهولة من داخل الجهاز. يوصى بالأشكال المقطعية بالأبيض والأسود (مثلث، مربع، دائرة).
9. باستخدام المغناطيس، والتمسك الإشارات البصرية إلى الجدران الداخلية للأدوات. يجب أن تكون العظة متساوية تقريبا المسافة بعيدا، حول محيط الجهاز.

3. شعاعي المياه فقي بروتوكول متاهة

ملاحظة: اختبار المياه المتاهة يجب أن تبدأ إلا بعد أن تلتئم الموقع الجراحي (ما يقرب من أسبوع واحد بعد الجراحة).

1. التحضير للاختبار.
   1. السماح الفئران لتأقلم إلى غرفة الاختبار لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل بدء الاختبار.
   2. تعقيم الجهاز باستخدام رذاذ الإيثانول 70٪.
   3. ملء الجهاز مع ما يقرب من 1 بوصة من الماء البارد (12-14 درجة مئوية).
   4. وضع وسادة التدفئة الكهربائية، أو مصدر التدفئة الأخرى، تحت مربع الهروب مباشرة. إبقاء مربع الهروب الظلام والحار طوال مدة الاختبار.
   5. ضع مصدر ضوء ساطع على الجهاز.
      ملاحظة: في حالة استخدام مصباح قد يكون مرئيا للحيوانات البحثية من الجهاز نفسه، الحرص على أن يتم وضع المصباح في نفس بوسيتيون كل يوم. المصباح نفسه قد يمثل جديلة بصرية أخرى للفئران لاستخدامها لتحديد موقع مربع الهروب، وتحريكه بشكل كبير من يوم إلى يوم قد تعقيد النتائج.
2. بروتوكول الاختبار
   1. إزالة الماوس من قفصه بلطف من الذيل، ومكان في وسط الجهاز.
   2. حالما يكون الحيوان في الجهاز، تبدأ توقيت.
   3. مرة واحدة وقد وجد الحيوان المخرج الصحيح، وقد حددت / دخلت مربع الهروب، وتوقف توقيت وتسجيل عدد الثواني المطلوبة للعثور على المسار الصحيح.
   4. إذا كان الحيوان يحاول أن يصعد إلى حفرة إنهاء ولا يعيد عفويا المتاهة بعد 10 ثانية، وتوجيه الحيوان مرة أخرى في وسط المتاهة باليد.
   5. إذا فشل الحيوان في العثور على المسار الصحيح إلى مربع الهروب في غضون 3 دقائق (180 ثانية)، يسجل المحاكمة كما فشل وتسجيل 180 ثانية. توجيه بعناية الحيوان نحو المسار الصحيح باليد.
   6. السماحالماوس للبقاء في مربع الهروب لمدة 1 دقيقة، الراحة بين المحاكمة.
   7. مرة واحدة قد مرت راحة 1 دقيقة، وإزالة الحيوان من مربع الهروب والعودة إلى قفص المنزل.
   8. تعقيم تماما مربع الهروب والمخارج مع رش 70٪ من الإيثانول لمنع الماوس من استخدام العظة حاسة الشم لتحديد موقع الطريق الهروب الصحيح. يجب ألا تستغرق هذه الخطوة أكثر من بضع ثوان.
   9. عودة الماوس إلى المتاهة للمحاكمة المقبلة.
   10. كرر الخطوات 3.2.1-3.2.9 حتى اكتمال الماوس ما مجموعه ثلاث تجارب، وكان إما تقع أو تم ادت الى صندوق الهروب ثلاث مرات.
   11. بعد النهائي 1 دقيقة الراحة، والعودة الماوس إلى قفص المنزل.
   12. استنزاف واستبدال المياه في الجهاز بين الحيوانات لضمان درجة حرارة ثابتة طوال الاختبار.
   13. كرر الخطوات 3.2.1-3.2.12 لكل الماوس لفحصها.
   14. في اليوم التالي، خطوات إعداد تكرار 3.2.1-3.2.5. توخى عناية خاصة لضمان بقاء الإشارات البصريةفي مواقف ثابتة بين أيام الاختبار.
   15. اختبار الحيوانات باستخدام بروتوكول الاختبار اليومي أعلاه لمدة ثلاث تجارب يوميا لمدة أربعة أيام (فترة التدريب)، مع الاختبار النهائي ثلاث تجارب لاحتجاز الذاكرة في اليوم الخامس. ويمكن إعطاء اختبار سادس ثلاث تجارب (الاحتفاظ طويل الأمد الذاكرة) في يوم اثني عشر.
   16. لا تقم بإجراء أي اختبارات بين أيام الاختبار خمسة واثني عشر.
3. تحليل
   1. إذا فشل الماوس لإكمال المتاهة في أقل من 180 ثانية خلال أي فترة يومين ( أي ما مجموعه 6 تجارب متتالية كل سجل في 180 ق)، والنظر في الماوس غير كافية الدافع وراء ظروف الاختبار، وإزالة من التحليل.
   2. حساب متوسط ​​الكمون لاستكمال المتاهة لكل موضوع من خلال تاريخ الاختبار عن طريق المتوسط ​​في ثلاث محاكمات يومية لذلك اليوم.
   3. الحصول على الاختلافات مجموعة في الاحتفاظ بالذاكرة باستخدام اختبارات تي القياسية لمقارنة المجموعات في اختبار اليوم الخامس وتاريخ اختبار الذاكرة على المدى الطويل. إذا ميتم مقارنة خام من مجموعتين، في اتجاه واحد أنوفا تليها تحليل ما بعد المخصصة المناسبة (مثل اختبار توكي) لمتابعة أي أهمية الحصول عليها ينبغي أن تستخدم بدلا من ذلك.
   4. الحصول على فروق المجموعة في فترة الاستحواذ (أيام 1-4) عن طريق تحليل قياس متكرر من التباين.

النتائج

تم استخدام متاهة روت ( الشكل 1 ) للتحقيق في العجز تعتمد على الذاكرة المكانية إصابة في الفئران تعيين عشوائيا لتلقي إما التي تسيطر عليها القشرية التي يسببها تبي أو جراحة صورية. تم إنشاء الإصابة باستخدام تأثير القشرية اللولبي يحركها مع ?...

Discussion

بروتوكول متاهة روت المقدمة هنا يميز بنجاح بين تسي التي يسببها الفئران تبي وضوابط صورية، ويمثل بديلا، مرتكزة على الماوس، بديل ل موم و بارنز المتاهة دائرية. في حين أن النتائج المبلغ عنها هنا تتحدث فقط إلى استخدام متاهة روت في نموذج الفأر تبي، وقد تم استخدام هذا الجهاز ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 Gal. Hot Dipped Steel Round Tub	Home Depot	Internet #206638142	Needed: 1
1-1/2 in. ABS DWV SPG x SJ Trap Adapter	Home Depot	Internet #100344703, Store SKU #188956	Needed: 9
1-3/4 in. x 1-7/16 in. Black Rubber Stopper	Home Depot	Internet #100114974 Store SKU #755844	Needed: 8
1-1/2 in. ABS DWV 90 Degree Hub x Hub Elbow	Home Depot	Internet #100346663 Store SKU #188603	Needed: 1
HDX 10 Gal. Storage Tote	Home Depot	Internet #202523587 Store SKU #258804 Store SO SKU #258804	Needed: 1
Impact One Stereotaxic Impactor for CCI	Leica Biosystems	39463920	Needed: 1
Vernier Stereotaxic w/ Manual Fine Drive Stereotaxic Instrument for Small Animals	Leica Biosystems	39463001	Needed: 1