הערכת זיכרון מרחבי פגיעה במודל עכבר של פגיעה מוחית טראומטית באמצעות מבוך רדיאלי מים רדיאלי

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבדיקת עכבר ספציפית של קוגניציה שאינה דורשת שחייה. בדיקה זו יכולה לשמש כדי להבדיל בהצלחה מבוקרת קליפת המוח המושרה עכברים פגיעה מוחית טראומטית מ שולטת בושה.

Abstract

למרות הגידול האחרון בשימוש במודלים של עכברים במחקר מדעי, החוקרים ממשיכים להשתמש במשימות קוגניטיביות שתוכננו במקור ואומתו לשימוש בעכברים. מבחן המבוך של מים רדיאליים (RWT) של זיכרון מרחבי (שתוכנן במיוחד לעכברים ואינו דורש שחייה) הוכח בעבר כדי להבחין בהצלחה בין עכברי TBI הנגרמים על ידי קליפת המוח לבין פקדי הדמה. הנה, פרוטוקול מפורט עבור משימה זו מוצג. המבוך RWT מנצל את הנטייה הטבעית של עכברים כדי למנוע שטחים פתוחים לטובת חיבוק הצדדים של מכשיר (thigmotaxis). קירות המבוך מרופדים עם תשעה חורי בריחה המונחים מעל רצפת המנגנון, ועכברים מאומנים להשתמש ברמזים חזותיים כדי לאתר את בור הבריחה המוביל מהמבוך. המבוך הוא מלא סנטימטר של מים קרים, מספיק כדי להניע לברוח אבל לא עמוק מספיק כדי לדרוש כי העכבר לשחות. תקופת הרכישה דורשת רק ארבעה אימוניםימים, עם מבחן לשמירת זיכרון ביום 5 ומבחן זיכרון לטווח ארוך ביום 12. התוצאות המדווחות כאן מראים כי מבוך RWT הוא חלופה אפשרית לבדיקות קוגניטיביות מאומתות, המבוססות על שחייה, המבוססות על עכברים, בהערכת המרחב גירעונות זיכרון מודלים העכבר של TBI.

Introduction

ליקויים בזיכרון הם בין התסמינים הנפוצים ביותר המדווחים על ידי חולים בעקבות פגיעה מוחית טראומטית (TBI) ^{1 , 2} . זיהוי מדויק והערכה של גירעונות זיכרון אנלוגיים במודלים של בעלי חיים של TBI, אם כן, חיוניים להבנת מצב זה וניהולו. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבדיקת זיכרון מרחבי במודל עכבר של TBI באמצעות מבוך מים רדיאלי (RWT). מנגנון זה הוצג בעבר להעריך ליקויים קוגניטיביים בעכברי מודל השפעת קליפת מוח מבוקר (CCI) -induced ³ TBI, ומהווה חלופה פוטנציאל-תוקף חולדה, לשחות מבוססות בדיקות של קוגניציה.

המגוון הגובר והזמינות של מודלים עכבר מהונדס הוביל לעלייה האחרונה בשימוש עכברים על חולדות במחקר מדעי ⁴ . למרות השינוי הזה, החוקרים ממשיכים להסתמך על התנהגותי אNd משימות קוגניטיביות אשר תוכננו במקור ואומתו לשימוש חולדה. המבחנים הנפוצים ביותר המשמשים כיום להערכת הקוגניציה בעכברים, מבוך המים של מוריס (MWM) והמבוך המעגלי של בארנס, תוכננו במיוחד כדי לנצל את ההתנהגויות האינסטינקטואליות שנמצאו בחולדות ^{5 , 6} . בהתחשב בהבדלים גנטיים, neuroethological, וקוגניטיביות הקיימים בין שני אלה מינים ^4, אין זה מפתיע כי עכברים בעקביות תשואת חסר על משימות אלה ^{7, 8.}

הבדלים תלויי המינים ביכולת הבדיקה הם בעיקר לגבי בדיקות קוגניטיביות מבוססות שחייה, כגון MWM. בעוד שני עכברים ועכברים הם שחיינים בקיאים, החוקרים זיהו כמה זני עכברים שמבצעים בצורה גרועה בצורה גרועה במשימות קוגניטיביות מבוססות שחייה ^{9 , 10 , 11 , 12 , 13} . אפילו חיות בר wild-type, חולדות בדרך כלל בביצועיו של עכברים ^{7 , 8} . אמנם זה יכול להתפרש ההבדל המינים ספציפיים בזיכרון המרחבי, מעקב מעקב מקביל באמצעות מבוך יבש יבש לא גילה הבדלים תלויי מין בביצועים הקוגניטיביים ⁸ . מספר גורמים שאינם קשורים לקוגניציה יכולים להסביר את הממצא הזה, כולל הבדלים תלויי מין, בין ביכולת שחייה ובין באסטרטגיית חיפוש. ואכן, ניתוח גורמים של אסטרטגיות חיפוש ספציפיות לעכבר ב MWM הראה כי גורמים לא קוגניטיביים (בפרט, thigomotaxis ו פסיביות [ כלומר , צף]) עשוי לשחק תפקיד משמעותי יותר בביצועים MWM מאשר למידה מרחבית ¹⁴ .

כאן, אנו מדגימים את השימוש במבחן קוגניטיבי שנועד לנצל את ה - inהתנהגות של עכברים, אשר אינו מחייב שחייה, כדי למדוד פגיעה בזיכרון המרחבי במודל עכבר של CCI- המושרה TBI. בעוד מבוך RWT ( איור 1 A-B ) נתפס כמו היברידית הרומן של מבוך מעגלי MWM ו בארנס, זה תוכנן במיוחד כדי לנצל את התנהגות thigmotactic אינסטינקטיבית לעכברים ^{15 , 16} . המנגנון מורכב בקוטר 32 אינץ 'מגולוון פלדה פלדה שבו תשעה חורים יציאת רווח שווה כבר משועמם. החורים מרוכזים 2-1 / 4 אינץ 'מעל רצפת האמבט והם בגודל כדי להתאים בדרך כלל זמין 1-1 / 2 אינץ' ABS DWV SPG x מתאמי מלכודת SJ. שמונה מן היציאות הם capped מבחוץ ו עיוור עד לעומק של 1 אינץ 'עם פקקים גומי. התשיעי מחובר על ידי 90 ° acrylonitrile butadiene סטירן (ABS) מרפק אל תיבת פלסטיק אטומה שממנו העכבר ניתן להסיר בקלות לאחר בדיקה. במהלך אתקופת רכישה קצרה, העכבר מאומן להשתמש רמזים חזותיים ייחודי רירית מבוך כדי לאתר את תיבת לברוח. במהלך הבדיקה, המבוך הוא מלא סנטימטר של מים קרים (12-14 מעלות צלזיוס), מספיק מרתיעה מספיק כדי לקדם את הבריחה, אבל לא עמוק מספיק כי העכבר נדרש לשחות.

המבוך RWT מייצג חלופה בעלות נמוכה, תחזוקה נמוכה MWM, והוא שימש בהצלחה בעכברים מהונדסים בגילאי ^{15 , 17 , 18 , 19} ו- CCI-Induced של TBI ³ . פרוטוקול המתואר כאן מייצג שיטה פשוטה ויעילה למדידת פגיעה בזיכרון המרחבי הדורש שום הכשרה לפני הפציעה, והוא יכול להיות שונה בקלות כדי להתאים לצרכים הספציפיים של מעבדה מחקרית.

Protocol

כל ההליכים וטיפול בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות טיפול בבעלי חיים שהונפקו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות ועל ידי אוניברסיטת וושינגטון טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה.

1. ניתוח

1. להרדים את העכבר ב 5% isoflurane בתיבה אינדוקציה עד מחוסר הכרה. אישור הרדמה על ידי הפחתה של קצב הנשימה ואת היעדר רפלקס נסיגה הבאה אצבע קמצוץ.
2. לשמור על הרדמה באמצעות חרוט האף ב 2-2.5% במהלך הניתוח. לפקח על קצב הנשימה במהלך הניתוח על מנת להבטיח את העכבר נשאר מחוסר הכרה.
3. מניחים את העכבר נוטה על כרית חימום ומקם את העכבר במכשיר stereotactic באמצעות סורגים אוזן, להבטיח כי הראש מאובטח ושטוח.
4. הסרת שיער מהקרקפת באמצעות קרם להסרת שיער. שוטפים את הקרקפת ביסודיות עם מלוחים.
5. נקה את האתר כירורג עם יוד לסירוגין ו 70% אתנול לשטוף.
6. מנהלRa הזרקה תת עורית של לידוקאין ו Bupivacaine (1 מ"ג / ק"ג) על הקרקפת.
7. עם מספריים כירורגיים, לעשות חתך קו האמצע האורך, ו retract העור כדי לחשוף את הגולגולת.
8. באמצעות 5 מ"מ טריפין ראה preform craniotomy מעל קליפת המוח הקדמי השמאלי עם נקודת מרכז ב 2.5 מ"מ מאחורי ברגמה ו 2.5 מ"מ שמאל של קו האמצע. הסר בזהירות את מעגל העצם לחשוף את המוח.
9. הגדר את המכשיר impor למהירות של 6 מ '/ ש' ו 200 ms זמן מגורים.
10. מקם את מכשיר impor עד קצה 3 מ"מ קמור השפעה נוגע קלות את פני השטח של המוח ב 2.5 מ"מ מאחורי ברגמה ו 2.55 מ"מ שמאל של קו האמצע. סלקו את קצה ההשפעה, ונמוך ב -1 מ"מ (עומק ההשפעה). כאשר מוכן, אש את המכשיר, לייצר את ההשפעה הרצויה.
11. כיסוי craniotomy עם דיסק פוליפרופילן סטרילי מלט לדרמה עם דבק רקמה, תפר את החתך סגור.
12. הסר את העכבר מן הרדמה, ולתת הזרקה IP של Buprאנורפין (0.5 מ"ג לק"ג).
13. אפשר העכבר להתאושש בכלוב נקי, מחומם על ידי כרית חימום. העכבר צריך להיות פיקוח על סימנים של כאב או מצוקה על 24 שעות הבא.
    הערה: בקרות של שמם צריכות לקבל טיפול זהה כאמור, עם צעדים 1.8-1.9 מושמטים.

2. רדיאלי מים דריכה במבוך הבנייה

1. Bore 9 חורי יציאה, גדול מספיק כדי להתאים 1-1 / 2 אינץ 'ABS DWV SPG x מתאמי מלכודת SJ, במרווחים שווים סביב היקף של 32 אינץ' קוטר פלדה מגולוון. מרכז אלה חורי היציאה בערך 2-1 / 4 אינץ 'מעל רצפת האמבטיה.
2. התאימו את מתאם מלכודת ה- ABS של 1-1 / 2 אינץ 'ABS DWV SPG x SJ לתוך כל אחד מחורי היציאה, ואובטח באמצעות אגוזי הטבעת הכלולים.
3. עם פקקי גומי, מכסה שמונה מתוך תשע יציאות מהחלק החיצוני של המנגנון. היציאה הסופית, הבלתי מסומנת, תשמש כדרך הבריחה. אין זה משנה איזו יציאה מיועדת למסלול הבריחה.
4. צרף ABS 90 °המרפק לקצה החיצוני של היציאה הנותרת. העקומה של 90 ° משמשת כדי למנוע מנושאי בדיקה לקבוע באופן ויזואלי את נתיב הבריחה הנכון מתוך המבוך.
5. לבנות את תיבת לברוח מכל תיבת אטום מסוגל להיות מחוטא בערך 30 ס"מ x 15 ס"מ x 15 ס"מ בגודל. חותכים חור בצד של התיבה, ישירות מעל הרצפה, גדול מספיק כדי להתאים מרפק ABS 90 °.
6. צרף את תיבת הבריחה אל קצה המסוף של מרפק ABS 90 °.
7. הרם מעט את תיבת המילוט (פחות מאחד אינץ ') מעל פני השטח של הרצפה. זה מאפשר מקום נרחב עבור כרית חימום חשמלי, או מקור חימום אחרים, להיות ממוקם מתחת לתיבת הבריחה.
8. הדפס לרבד לפחות 5 רמזים חזותיים ייחודיים. השתמש פשוט, תמונות ניגודיות גבוהה שניתן להבחין בקלות מתוך המכשיר. מומלץ להשתמש בצורות וידאו בשחור-לבן (משולש, ריבוע, מעגל).
9. באמצעות מגנטים, לדבוק רמזים חזותיים על הקירות הפנימיים שלמַנגָנוֹן. רמזים צריכים להיות במרחק שווה בערך זה מזה, סביב היקף המנגנון.

3. מים רדיאלי Dread פרוטוקול המבוך

הערה: בדיקת מבוך המים צריכה להתחיל רק לאחר שהאתר כירורג (כשבוע לאחר הניתוח).

1. מתכונן לבדיקה.
   1. אפשר עכברים להסתגל לחדר בדיקות לפחות 30 דקות לפני תחילת הבדיקה.
   2. לסנן את המנגנון באמצעות תרסיס אתנול 70%.
   3. ממלאים את המנגנון עם בערך 1 ס"מ של מים קרים (12-14 מעלות).
   4. מניחים כרית חימום חשמלי, או מקור חימום אחר, ישירות מתחת לתיבת הבריחה. שמור את תיבת הבריחה כהה וחם לאורך כל תקופת הבדיקה.
   5. מקם מקור אור בהיר על המנגנון.
      הערה: אם אתה משתמש במנורה שעשויים להיות גלויים לבעלי חיים מחקריים מהמכשיר עצמו, הקפד לוודא שהמנורה ממוקמת באותו פוכל יום. המנורה עצמה עשויה לייצג רמז חזותי נוסף עבור העכברים להשתמש כדי לאתר את תיבת הבריחה, והעברת אותו בצורה קיצונית מיום ליום עלולה לסבך את התוצאות.
2. פרוטוקול בדיקה
   1. הסר את העכבר מן הכלוב שלה בעדינות על ידי הזנב, ומקום במרכז המכשיר.
   2. ברגע שהחיה נמצאת בתוך המנגנון, התחל תזמון.
   3. ברגע שהחיה מצאה את היציאה הנכונה, והיא ממוקמת / נכנסה לתיבת הבריחה, עצור את התזמון והקליט את מספר השניות הדרוש כדי למצוא את הנתיב הנכון.
   4. אם החיה מנסה לטפס לתוך חור מסתיים ולא לחזור באופן ספונטני במבוך אחרי 10, להנחות את החיה בחזרה למרכז המבוך ביד.
   5. אם החיה נכשל למצוא את הנתיב הנכון לתיבת הבריחה בתוך 3 דקות (180 שניות), ציון המשפט ככישלון ולהקליט כמו 180 s. בזהירות מדריך החיה לכיוון הנתיב הנכון ביד.
   6. לאפשר אתהעכבר להישאר בתיבת הבריחה למשך דקה 1, מנוחה בין המשפט.
   7. לאחר מנוחה 1 דקות עבר, להסיר את החיה מן הבריחה תיבת לחזור הכלוב הביתה שלה.
   8. ביסודיות לנקות את תיבת הבריחה ויוצא עם תרסיס אתנול 70% כדי למנוע את העכבר באמצעות רמזים חוש הריח כדי לאתר את נתיב הבריחה הנכון. שלב זה אמור להימשך לא יותר מכמה שניות.
   9. החזירו את העכבר למבוך למשפט הבא.
   10. חזור על שלבים 3.2.1-3.2.9 עד העכבר השלימה סך של שלושה ניסויים, ויש לו או נמצא או הוביל את תיבת הבריחה שלוש פעמים.
   11. לאחר מנוחה 1 דקות האחרון, להחזיר את העכבר לכלוב הביתה.
   12. מסננים ולהחליף את המים במנגנון בין בעלי חיים כדי להבטיח טמפרטורה עקבית לאורך הבדיקה.
   13. חזור על שלבים 3.2.1-3.2.12 עבור כל עכבר להיבדק.
   14. למחרת, חזור על שלבי ההכנה 3.2.1-3.2.5. קח טיפול מיוחד להבטיח כי רמזים חזותיים להישארבעמדות עקביות בין ימי בדיקות.
   15. מבחן בעלי חיים באמצעות פרוטוקול בדיקה יומי לעיל במשך שלושה ניסויים ביום במשך ארבעה ימים (תקופת האימונים), עם מבחן שלוש ניסוי הסופי לשמירת הזיכרון ביום החמישי. מבחן ששה ניסוי שישי (שימור זיכרון לטווח ארוך) יכול להינתן ביום שתים עשרה.
   16. אין לבצע בדיקות בין בדיקות ימים 5 ו 12.
3. אָנָלִיזָה
   1. אם עכבר לא מצליח להשלים את המבוך מתחת ל -180 שניות במהלך כל תקופה של יומיים ( כלומר, סך של 6 ניסויים רצופים כל הבקיע ב 180 s), לשקול את העכבר מספיק מוטיבציה על ידי תנאי הבדיקה, ולהסיר מניתוח.
   2. חישוב חביון ממוצע כדי להשלים את מבוך עבור כל נושא על ידי בדיקה תאריך על ידי ממוצע של שלושה ניסויים היומי שלהם באותו יום.
   3. השג הבדלים קבוצתיים בשימור הזיכרון באמצעות מבחני t סטנדרטיים כדי להשוות קבוצות במבחן יום החמישי ומועד בדיקת זיכרון לטווח ארוך. אם מעפרות מאשר שתי קבוצות מושווים, ANOVA חד כיווני ואחריו ניתוח פוסט-הוק מתאים (כגון מבחן Tukey) כדי לעקוב אחר כל משמעות שהושגו צריך להיות מועסק במקום.
   4. השג הבדלים קבוצתיים בתקופת הרכישה (ימים 1-4) באמצעות מדידה חוזרת ונשנית של שונות.

תוצאות

המבוך RWT ( איור 1 ) שימש כדי לחקור את הפגיעה בזיכרון הזיכרון המרחבי בעכברים שהוקצו באופן אקראי לקבל או מבוקר מבוקר TST קליפת המוח המושרה TBI או ניתוח דמה. הפציעה נוצרה באמצעות השפעה קליפת המוח עם סולנואיד עם קצה קמור 3 מ"מ ואת הפרמטרים ה?...

Discussion

פרוטוקול מבוך RWT המוצג כאן מבדיל בהצלחה בין CCI- המושרה עכברים TBI ו שולטת שולטת, ומייצג חלופה, מעשית, מרכז, העכבר למבוך מעגלי MWM ו בארנס. בעוד התוצאות המדווחות כאן לדבר רק על השימוש במבוך RWT במודל עכבר TBI, מכשיר זה שימש בהצלחה במודלים מיושנים ו מהונדס שבו מתח נגרם עקב אי-תאי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 Gal. Hot Dipped Steel Round Tub	Home Depot	Internet #206638142	Needed: 1
1-1/2 in. ABS DWV SPG x SJ Trap Adapter	Home Depot	Internet #100344703, Store SKU #188956	Needed: 9
1-3/4 in. x 1-7/16 in. Black Rubber Stopper	Home Depot	Internet #100114974 Store SKU #755844	Needed: 8
1-1/2 in. ABS DWV 90 Degree Hub x Hub Elbow	Home Depot	Internet #100346663 Store SKU #188603	Needed: 1
HDX 10 Gal. Storage Tote	Home Depot	Internet #202523587 Store SKU #258804 Store SO SKU #258804	Needed: 1
Impact One Stereotaxic Impactor for CCI	Leica Biosystems	39463920	Needed: 1
Vernier Stereotaxic w/ Manual Fine Drive Stereotaxic Instrument for Small Animals	Leica Biosystems	39463001	Needed: 1