Évaluation de la déficience de la mémoire spatiale dans un modèle de souris de lésions cérébrales traumatiques à l'aide d'un labyrinthe radial de la marche d'eau

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour un test de cognition spécifique à la souris qui ne nécessite pas de nage. Ce test peut être utilisé pour distinguer avec succès les souris traumatiques traumatiques provoquées par l'impact cortical contrôlé par des témoins simulés.

Résumé

Malgré l'augmentation récente de l'utilisation des modèles de souris dans la recherche scientifique, les chercheurs continuent à utiliser des tâches cognitives qui ont été initialement conçues et validées pour l'utilisation des rats. Le test de labyrinthe de la mémoire spatiale (spécialement conçu pour les souris et ne nécessitant pas de baignade) a été démontré précédemment pour distinguer avec succès les souris TBI induites par impact cortical contrôlées et les contrôles simulés. Ici, un protocole détaillé pour cette tâche est présenté. Le labyrinthe RWT capitalise sur la tendance naturelle des souris à éviter les zones ouvertes en faveur de l'étreinte des côtés d'un appareil (thigmotaxis). Les murs du labyrinthe sont bordés de neuf trous d'évacuation placés au-dessus du sol de l'appareil, et les souris sont entraînées à utiliser des repères visuels pour localiser le trou d'évacuation qui sort du labyrinthe. Le labyrinthe est rempli d'un pouce d'eau froide, suffisant pour motiver l'évasion mais pas assez profond pour exiger que la souris nage. La période d'acquisition ne prend que quatre formationsJours, avec un test de rétention de mémoire au jour cinq et un test de mémoire à long terme au jour 12. Les résultats rapportés ici suggèrent que le labyrinthe de RWT est une alternative possible aux tests cognitifs validés par le rat et basés sur la natation dans l'évaluation de l'espace Déficits de mémoire dans les modèles souris de TBI.

Introduction

Les troubles de la mémoire sont parmi les symptômes les plus courants signalés par les patients après une lésion cérébrale traumatique (TCE) ^{1 , 2} . L'identification et l'évaluation exactes des déficits de mémoire analogues dans les modèles animaux de TBI sont donc essentielles à notre compréhension de cette condition et de sa gestion. Ici, nous présentons un protocole pour tester la mémoire spatiale dans un modèle de souris de TBI en utilisant un labyrinthe de roulement à eau radiante (RWT). Cet appareil a précédemment évalué les déficits cognitifs dans les modèles de souris du TBI ³ induit par l'impact cortical contrôlé (CCI) et représente une alternative potentielle aux tests de cognition validés par le rat et basés sur la nage.

La diversité croissante et la disponibilité de modèles de souris transgéniques a entraîné une augmentation récente de l'utilisation de souris sur des rats dans la recherche scientifique ⁴ . Malgré ce changement, les chercheurs continuent à compter sur un comportementNd tâches cognitives initialement conçues et validées pour l'utilisation des rats. Les tests les plus courants actuellement utilisés pour évaluer la cognition chez la souris, le Morris Water Maze (MWM) et le labyrinthe circulaire de Barnes ont été spécifiquement conçus pour capitaliser sur les comportements instinctifs trouvés chez les rats ^{5 , 6} . Compte tenu des différences génétiques, neuroethologiques et cognitives qui existent entre ces deux espèces ⁴ , il n'est pas surprenant que les souris continuent régulièrement à se baser sur ces tâches ^{7 , 8} .

Les différences dépendantes de l'espèce dans les capacités de test sont particulièrement préoccupantes dans les tests cognitifs basés sur la natation, tels que le MWM. Alors que les rats et les souris sont des nageurs compétents, les chercheurs ont identifié plusieurs souches de souris qui se comportent remarquablement mal sur les tâches cognitives basées sur la natation ^{9 , 10 , 11 , 12 , 13} . Même chez les animaux de type sauvage, les rats dépassent généralement les souris ^{7 , 8} . Bien que cela puisse être interprété comme une différence spécifique de l'espèce dans la mémoire spatiale, des tests de suivi analogues utilisant un labyrinthe à terre sèche n'ont révélé aucune différence dépendante des espèces dans les performances cognitives ⁸ . Un certain nombre de facteurs non liés à la cognition pourraient expliquer cette découverte, y compris les différences dépendantes de l'espèce dans la capacité de nage ou la stratégie de recherche. En effet, l'analyse factorielle des stratégies de recherche spécifiques à la souris dans le MWM montre que les facteurs non cognitifs (en particulier, la thigomotaxis et la passivité [ c'est -à- dire flottants]) peuvent jouer un rôle plus important dans la performance MWM que l'apprentissage spatial ¹⁴ .

Ici, nous démontrons l'utilisation d'un test cognitif conçu pour capitaliser sur leComportement stuctif de la souris, et qui ne nécessite pas de nage, pour mesurer l'altération de la mémoire spatiale dans un modèle de souris de TBI induite par CCI. Bien que le labyrinthe de RWT (figure 1 A-B) a été conçu en tant que nouvel hybride du labyrinthe circulaire MWM et Barnes, il a été spécialement conçu pour tirer parti du comportement pulsionnel thigmotactisme à des souris ^{15, 16.} L'appareil se compose d'un tube en acier galvanisé de 32 pouces de diamètre dans lequel neuf trous de sortie régulièrement espacés ont été ennuyés. Les trous sont centrés à 2-1 / 4 pouces au-dessus du plancher de la baignoire et sont dimensionnés pour s'adapter aux adaptateurs antiparasites ABS DWV SPG x SJ de 1-1 / 2 pouces couramment disponibles. Huit des sorties sont coiffées de l'extérieur et aveuglées jusqu'à une profondeur de 1 pouce avec des bouchons en caoutchouc. Le neuvième est relié par un coude en styrène à styrène (ABS) à 90 ° d'acrylonitrile à une boîte en plastique opaque dont la souris peut être facilement retirée après test. Au cours d'unBrève période d'acquisition, la souris est formée pour utiliser les repères visuels uniques qui bordent le labyrinthe pour localiser cette boîte d'évacuation. Au cours du test, le labyrinthe est rempli d'un pouce d'eau froide (12-14 ° C), suffisamment aversif pour favoriser l'évasion, mais pas assez profond pour que la souris soit obligée de nager.

Le labyrinthe RWT représente une alternative peu coûteuse et à faible entretien au MWM, et a été utilisé avec succès chez les souris âgées et transgéniques ^{15 , 17 , 18 , 19} et les modèles de souris induites par CCI de TBI ³ . Le protocole décrit ici représente une méthode simple et efficace pour mesurer l'altération de la mémoire spatiale nécessitant une formation préalable à la blessure et pourrait être facilement modifiée en fonction des besoins particuliers d'un laboratoire de recherche.

Protocole

Toutes les procédures et la manipulation des animaux ont été menées conformément aux directives sur les soins des animaux délivrées par les National Institutes of Health et par le Comité de l'élevage et de l'utilisation des animaux de l'Université de Washington.

1. Chirurgie

1. Anesthésier la souris à 5% d'isoflurane dans une boîte d'induction jusqu'à l'inconscience. Confirmer l'anesthésie par une réduction de la fréquence respiratoire et l'absence d'un réflexe de retrait après le pincement.
2. Maintenir l'anesthésie par le cône du nez à 2-2,5% tout au long de la chirurgie. Surveillez le taux de respiration tout au long de la chirurgie pour vous assurer que la souris reste inconsciente.
3. Placez la prothèse de la souris sur un coussin chauffant et placez la souris dans l'appareil stéréotaxique à l'aide de barres d'oreille, en vous assurant que la tête est bien fixée et à plat.
4. Retirer les cheveux du cuir chevelu à l'aide de crème anti-épilation. Rincer soigneusement le cuir chevelu avec de la solution saline.
5. Nettoyez le site chirurgical avec un iode en alternance et un lavage à 70% d'éthanol.
6. AdministrateurInjection sous-cutanée de Lidocaïne et de Bupivacaïne (1 mg / kg) au cuir chevelu.
7. Avec des ciseaux chirurgicaux, effectuez une incision longitudinale longitudinale et rétractez la peau pour révéler le crâne.
8. En utilisant une préforme de scie tridée de 5 mm, une craniotomie sur le cortex frontoparietal gauche avec un point central à 2,5 mm derrière bregma et 2,5 mm à gauche de la ligne médiane. Retirez soigneusement le cercle des os pour exposer le cerveau.
9. Réglez le dispositif de frappe à une vitesse de 6 m / s et 200 ms.
10. Placez le dispositif de frappe jusqu'à ce que la pointe d'impact convexe de 3 mm touche légèrement la surface du cerveau à 2,5 mm derrière le bregma et 2,55 mm à gauche de la ligne médiane. Rétracter la pointe d'impact et abaisser de 1 mm (profondeur d'impact). Lorsque vous êtes prêt, éteins le périphérique, générant l'impact désiré.
11. Couvrir la craniotomie avec un disque de polypropylène stérile cimenté au derma avec un adhésif tissulaire et suturer l'incision fermée.
12. Retirez la souris de l'anesthésie et donnez une injection IP de BuprL'énorphine (0,5 mg / kg).
13. Permettre à la souris de récupérer dans une cage propre, réchauffée par un coussin chauffant. La souris doit être surveillée pour détecter des signes de douleur ou de détresse au cours des 24 h suivantes.
    REMARQUE: Les contrôles Sham devraient recevoir un traitement identique comme ci-dessus, les étapes 1.8-1.9 étant omises.

2. Construction de labyrinthe de la marche à eau radiante

1. Les trous de sortie d'alésage 9, assez grands pour accueillir des adaptateurs de trappe ABS DWV SPG x SJ de 1-1 / 2 pouces, à intervalles égaux autour de la circonférence d'un tube en acier galvanisé de 32 pouces de diamètre. Centrez ces trous de sortie à environ 2-1 / 4 pouces au-dessus du plancher de la baignoire.
2. Installez un adaptateur de traction ABS DWV SPG x SJ de 1-1 / 2 pouces dans chacun des trous de sortie et fixez-le avec les écrous torsadés inclus.
3. Avec des bouchons en caoutchouc, capuchon huit des neuf sorties de l'extérieur de l'appareil. La sortie définitive, non pliée, servira de voie d'évacuation. Peu importe quelle sortie est désignée comme voie d'évacuation.
4. Fixez un ABS 90 °Coude à l'extrémité extérieure de la sortie restante. Le virage à 90 ° permet d'empêcher les sujets de test de déterminer visuellement la bonne voie d'évacuation à l'intérieur du labyrinthe.
5. Construire la boîte d'échappement à partir d'une boîte opaque capable d'être désinfectée et d'une taille approximative de 30 cm x 15 cm x 15 cm. Couper un trou sur le côté de la boîte, directement au-dessus du sol, assez grand pour accueillir un coude ABS 90 °.
6. Fixez la boîte d'évacuation à l'extrémité terminale du coude ABS 90 °.
7. Élevez légèrement la boîte d'évacuation (moins d'un pouce) au-dessus de la surface du sol. Cela permet d'installer une caisse chauffante électrique, ou une autre source de chauffage, dans le cadre de la boîte d'évacuation.
8. Imprimez et stratifiez au moins 5 repères visuels uniques. Utilisez des images simples et à haute contraste qui peuvent être facilement discernées à l'intérieur de l'appareil. Des formes de clipart en noir et blanc (triangle, carré, cercle) sont recommandées.
9. En utilisant des aimants, adhérer les repères visuels aux parois intérieures de laappareil. Les cotes devraient être à peu près égales à distance, autour de la circonférence de l'appareil.

3. Protocole de labyrinthe à l'eau radiante

REMARQUE: Les essais sur le labyrinthe d'eau ne devraient commencer qu'après avoir guéri (environ une semaine après la chirurgie).

1. Préparation aux tests.
   1. Laissez les souris s'acclimater dans la salle d'essai pendant au moins 30 minutes avant de commencer les tests.
   2. Désinfecter l'appareil en utilisant un jet d'éthanol à 70%.
   3. Remplissez l'appareil avec environ 1 pouce d'eau froide (12-14 ° C).
   4. Placez un coussin chauffant électrique, ou une autre source de chauffage, directement sous la boîte d'évacuation. Gardez la boîte d'évacuation sombre et chaude tout au long de la durée de l'essai.
   5. Placez une source lumineuse lumineuse sur l'appareil.
      REMARQUE: Si vous utilisez une lampe qui pourrait être visible pour rechercher des animaux de l'appareil lui-même, veillez à ce que la lampe soit placée dans le même poChaque jour. La lampe elle-même pourrait représenter une autre indication visuelle pour les souris à utiliser pour localiser la boîte d'échappement, et le déplacer de façon drasculaire du jour au jour pourrait compliquer les résultats.
2. Protocole de test
   1. Retirez la souris de sa cage doucement par la queue et placez-la au centre de l'appareil.
   2. Dès que l'animal est entré dans l'appareil, commencez le temps.
   3. Une fois que l'animal a trouvé la sortie correcte, et a situé / entré dans la boîte d'échappement, arrête le temps et enregistre le nombre de secondes requis pour trouver le chemin correct.
   4. Si l'animal tente de grimper dans un trou de terminaison et ne rentre pas spontanément dans le labyrinthe après 10 s, guidez l'animal dans le centre du labyrinthe à la main.
   5. Si l'animal ne parvient pas à trouver le chemin correct de la boîte d'échappement en moins de 3 min (180 s), notez l'essai en tant que défaillance et enregistrez 180 s. Guidez soigneusement l'animal vers le bon chemin à la main.
   6. Autoriser leSouris pour rester dans la boîte d'évacuation pendant 1 min, repos inter-essai.
   7. Une fois le repos de 1 min passé, retirez l'animal de la boîte d'évacuation et retournez dans sa cage de maison.
   8. Bien désinfecter la boîte d'échappement et sortir avec un jet d'éthanol à 70% pour empêcher la souris d'utiliser des indices olfactifs pour localiser la voie d'évacuation correcte. Cette étape ne doit pas dépasser quelques secondes.
   9. Retournez la souris au labyrinthe pour l'essai suivant.
   10. Répétez les étapes 3.2.1-3.2.9 jusqu'à ce que la souris ait terminé un total de trois essais et qu'elle soit localisée ou a été conduite à la boîte d'échappement trois fois.
   11. Après le 1 min de repos final, remettez la souris dans sa cage à domicile.
   12. Égoutter et remplacer l'eau dans l'appareil entre les animaux afin d'assurer une température constante tout au long des essais.
   13. Répétez les étapes 3.2.1-3.2.12 pour chaque souris à tester.
   14. Le lendemain, répétez les étapes de préparation 3.2.1-3.2.5. Veillez à ce que les signaux visuels demeurentDans des positions cohérentes entre les jours de test.
   15. Testez les animaux en utilisant le protocole de test quotidien ci-dessus pour trois essais par jour pendant quatre jours (période de formation), avec un test final de trois essais pour la rétention de mémoire au cinquième jour. Un sixième test de trois essais (rétention de la mémoire à long terme) peut être donné le jour douze.
   16. Ne effectuez aucun test entre les jours de test cinq et douze.
3. Une analyse
   1. Si une souris ne parvient pas à compléter le labyrinthe en moins de 180 s pendant une période de deux jours ( c.-à-d. Un total de 6 essais consécutifs tous marqués à 180 s), considérez la souris insuffisamment motivée par les conditions d'essai et supprimez de l'analyse.
   2. Calculez la latence moyenne pour compléter le labyrinthe pour chaque sujet à la date de test en faisant la moyenne de ses trois essais quotidiens pour ce jour.
   3. Obtenez des différences de groupe dans la rétention de mémoire en utilisant des tests T standard pour comparer les groupes au test du cinquième jour et à la date de test de la mémoire à long terme. Si mPlus que deux groupes sont comparés, l'ANOVA à sens unique suivie d'une analyse post-hoc appropriée (comme le test de Tukey) pour donner suite à toute signification obtenue devrait être utilisé à la place.
   4. Obtenir des différences de groupe dans la période d'acquisition (jours 1-4) par analyse de variance de mesure répétée.

Résultats

Le labyrinthe RWT ( Figure 1 ) a été utilisé pour enquêter sur les déficits de mémoire spatiale dépendant de la lésion chez des souris assignées de manière aléatoire pour recevoir soit une TBI contrôlée par impact cortical contrôlé, soit une chirurgie simulée. La blessure a été générée à l'aide d'un impact cortical à solénoïde avec une pointe convexe de 3 mm et les paramètres de blessure suivants: vitesse de frappe de 6 m / ...

Discussion

Le protocole de labyrinthe RWT présenté ici distingue avec succès les souris TBI induites par CCI et les contrôles simulés, et représente une alternative viable, axée sur la souris, au lézard circulaire MWM et Barnes. Alors que les résultats rapportés ici ne parlent que de l'utilisation du labyrinthe RWT dans un modèle de souris TBI, cet appareil a été utilisé avec succès dans des modèles âgés et transgéniques où la non-conformité induite par le stress résultant d'essais basés sur la nage ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 Gal. Hot Dipped Steel Round Tub	Home Depot	Internet #206638142	Needed: 1
1-1/2 in. ABS DWV SPG x SJ Trap Adapter	Home Depot	Internet #100344703, Store SKU #188956	Needed: 9
1-3/4 in. x 1-7/16 in. Black Rubber Stopper	Home Depot	Internet #100114974 Store SKU #755844	Needed: 8
1-1/2 in. ABS DWV 90 Degree Hub x Hub Elbow	Home Depot	Internet #100346663 Store SKU #188603	Needed: 1
HDX 10 Gal. Storage Tote	Home Depot	Internet #202523587 Store SKU #258804 Store SO SKU #258804	Needed: 1
Impact One Stereotaxic Impactor for CCI	Leica Biosystems	39463920	Needed: 1
Vernier Stereotaxic w/ Manual Fine Drive Stereotaxic Instrument for Small Animals	Leica Biosystems	39463001	Needed: 1