半径方向水迷路迷路を用いた外傷性脳損傷のマウスモデルにおける空間記憶障害の評価

要約

ここでは、泳ぎを必要としないマウス特異的認知試験のプロトコールを紹介します。この試験は、制御された皮質衝撃誘発性外傷性脳損傷マウスを擬似対照から首尾よく区別するために使用することができる。

要約

科学研究におけるマウスモデルの使用の最近の増加にもかかわらず、研究者はもともと設計され、ラットの使用のために検証された認知課題を使用し続けている。制御された皮質衝撃誘発TBIマウスと擬似コントロールとの間を首尾よく区別するために、空間的記憶のラジアルウォータートレッド（RWT）迷路試験（マウスのために特別に設計され、泳ぎを必要としない）が以前に示されている。ここでは、このタスクの詳細なプロトコルを示します。 RWT迷路は、マウスの自然な傾向を利用して、開口部を避けて装置の側部をつかむことに好都合である（脈動性）。迷路の壁には、装置の床の上に配置された9つの逃げ穴が並んでおり、迷路から引き出された逃げ穴を見つけるために視覚的手がかりを使用するようにマウスを訓練する。迷路は、エスケープを促すのに十分な1インチの冷水で満たされているが、マウスが泳ぐのに十分な深さではない。取得期間はわずか4回です5日目の記憶保持試験および12日目の長期記憶試験を行った。ここに報告された結果は、RWT迷路が、ラットで検証された水泳ベースの認知試験の実現可能な代替物であることを示唆しているTBIのマウスモデルにおける記憶障害。

概要

記憶障害は、外傷性脳損傷^{（TBI）1、2}次の患者で報告された最も一般的な症状の一つです。したがって、TBIの動物モデルにおける類似の記憶障害の正確な同定および評価は、この状態およびその管理についての我々の理解にとって不可欠である。ここでは、Radial Water Tread（RWT）迷路を用いて、TBIのマウスモデルにおける空間的記憶を試験するためのプロトコールを提示する。この装置は、対照皮質インパクト（CCI）誘発TBI ^3のマウスモデルにおける認知障害を評価することが以前に示されており、ラットが認定した水泳ベースの認識試験の代替案となる可能性がある。

トランスジェニックマウスモデルの多様性と利用可能性の高まりは、ラットに比べてマウスの使用が最近増加している⁴ 。この変化にもかかわらず、研究者は行動に依存し続ける最初に設計され、ラットの使用のために検証された認知課題である。現在、マウスでの認知を評価するために使用される最も一般的なテストは、モリス水迷路（MWM）とバーンズ円形迷路は、特にラット^5、6で見つかった本能的な行動を活用するように設計されました。これら2種の⁴の間に存在し、遺伝的neuroethological、および認知の違いを考えると、それは驚くべきことではないというのマウスこれらのタスク^7、8に一貫アンダーパフォーム。

試験能力における種の差異は、特に水泳に基づくMWMのような認知試験に関連する。ラットとマウスの両方が堪能スイマーですが、研究者たちは^、水泳ベースの認知タスク^9、10に格段にパフォーマンスが低下するいくつかのマウス系統を同定しています ^{11、12、13。}でも、野生型動物では、ラットは、一般的に、マウス^7、8を上回ります。これは、空間的記憶の種特異的な差異として解釈される可能性があるが、乾いた陸地の迷路を用いた類似のフォローアップ試験は、種の依存性の認知能力の差異を明らかにしなかった⁸ 。水泳能力または検索戦略のいずれかの種に依存する差異を含む認知とは無関係の多くの要因がこの発見を説明し得る。実際、MWMにおけるマウス特異的探索戦略の因子分析は、非認知的要因（特に、チゴモザキシおよび受動性（ すなわち 、浮動））が空間学習よりもMWM性能においてより重要な役割を果たす可能性があることを示している¹⁴ 。

ここで、我々は、認知テストの使用を実証する。CCI誘発性TBIのマウスモデルにおける空間的記憶障害を測定するために、マウスの静的挙動および泳ぎを必要としない、 RWT迷路（ 図1 のA-B）は、MWMおよびバーンズ円形迷路の新規なハイブリッドとして考案されたが、それは、具体的には、マウス^15、16に本能thigmotactic挙動を活用するように設計されました。この装置は、9つの等間隔の出口孔が穿孔された32インチの亜鉛メッキされたスチール槽からなる。穴は浴槽の床上2〜1/4インチの中心にあり、一般的に利用可能な1-1 / 2インチABS DWV SPG x SJトラップアダプターに適合するようにサイズが決められています。 8つの出口は外側からキャップされ、ゴム栓で1インチの深さに盲検される。 9番目のものは90°のアクリロニトリルブタジエンスチレン（ABS）エルボーで不透明なプラスチックボックスに接続されています。このプラスチックボックスから、試験後マウスを簡単に取り外すことができます。また、マウスは、このエスケープボックスの位置を突き止めるために迷路に並ぶユニークな視覚的手がかりを使用するように訓練されている。試験中、迷路は冷水（12〜14℃）で満たされ、エスケープを促進するのに十分なほど不快であるが、マウスが泳ぐのに十分な深さではない。

RWT迷路は、MWMを低コスト、低メンテナンスの代替を表し^{、19、18、}老齢マウスおよびトランスジェニックマウス^15、17で正常に使用され、TBI ³のCCI誘発性マウスモデルされています。ここで概説したプロトコルは、傷害前訓練を必要としない空間記憶障害を測定するための簡単で効果的な方法であり、研究室の特定のニーズに合わせて簡単に修正することができます。

プロトコル

すべての手順および動物の取り扱いは、国立衛生研究所およびワシントン大学動物保護および使用委員会によって発行された動物ケアガイドラインに従って行われた。

1.手術

1. 意識がなくなるまで、誘導ボックス内の5％イソフルランでマウスを麻酔する。呼吸速度の低下とトウピンチ後の逃避反射がないことで麻酔を確認する。
2. 手術中、ノーズコーンを介して2-2.5％の麻酔を維持する。マウスが無意識のままでいることを保証するために、手術中に呼吸速度を監視する。
3. マウスを暖房パッドの上に置いて、イヤーバーを使用して定位固定装置にマウスを置き、ヘッドがしっかりと平らになっていることを確認します。
4. 脱毛クリームを使用して頭皮から髪を取り除く。頭皮を生理食塩水で完全にすすぐ。
5. 交互のヨウ素と70％エタノールで洗浄して外科部位を洗浄する。
6. 管理者頭皮にリドカインおよびブピバカイン（1mg / kg）を皮下注射した。
7. 外科用はさみで、縦方向の正中線切開を行い、皮膚を収縮させて頭蓋骨を露出させる。
8. 5mmのトレフィン鋸を使用して、左前頭前頭皮質上の開頭術を行い、ブレグマの後2.5mmおよび中線の2.5mmの中心点を有する。慎重に脳の輪を取り除いて脳を露出させます。
9. 衝撃装置を6m / sの速度および200msの滞留時間に設定する。
10. 3 mmの凸状のインパクト先端が脳の表面にわずかに接触するまでインパクター装置を配置します。ブレグマの2.5 mm後ろと2.55 mmの正中線から手前にします。インパクトチップを後退させ、1mm下げる（インパクトの深さ）。準備が整ったら、デバイスを発射し、必要な衝撃を与えます。
11. 組織接着剤で真皮に接着した滅菌ポリプロピレンディスクで開頭術を行い、閉鎖した縫合糸を縫合する。
12. 麻酔からマウスをはずし、BuprのIP注入を行うエノルフィン（0.5mg / kg）。
13. マウスを清潔なケージで回復させ、加熱パッドで温めます。マウスは、24時間以内に痛みや苦痛の兆候がないか監視する必要があります。
    注：偽のコントロールは、上記のように、1.8-1.9のステップを省略して同じ治療を受けなければならない。

2.ラジアルウォータートレッド迷路の建設

1. 1-1 / 2インチのABS DWV SPG x SJトラップアダプターを収容するのに十分な大きさの穴9の出口穴が、32インチの亜鉛メッキ鋼管の周囲に等間隔であります。これらの出口穴を浴槽の床の約2〜1/4インチの中心に合わせます。
2. 各出口穴に1-1 / 2インチABS DWV SPG x SJトラップアダプターを取り付け、付属のリングナットで固定します。
3. ゴム栓では、9つのうち8つが装置の外部から出ている。最後のキャップのない出口がエスケープルートとして機能します。どの出口がエスケープルートとして指定されているかは関係ありません。
4. 90°のABSを取り付けるエルボーを残りの出口の外側の端に取り付けます。 90°の湾曲は、試験被験者が迷路の内側から正しい脱出ルートを視覚的に決定するのを防ぐのに役立つ。
5. 消毒することができ、およそ30cm×15cm×15cmのサイズの不透明箱からエスケープボックスを構築する。 90°ABSエルボーを収容するのに十分な大きさの床の真上にある箱の側面に穴を切ってください。
6. エスケープボックスを90°ABSエルボの終端に取り付けます。
7. フロアの表面の上にエスケープボックス（1インチ未満）をわずかに持ち上げます。これにより、電気加熱パッドまたは他の加熱源のための十分な空間をエスケープボックスの下に配置することができます。
8. 少なくとも5つのユニークで視覚的な手がかりを印刷してラミネートします。装置内から容易に識別できる単純で高コントラストの画像を使用する。黒と白のクリップアートの形（三角、四角、円）をお勧めします。
9. マグネットを使用して、視覚的手がかりを装置。手がかりは、装置の円周に沿ってほぼ等間隔に離れていなければならない。

3.ラジアルウォータートレッドメイズプロトコル

注：水迷路試験は、手術部位が治癒した後にのみ開始する（手術後約1週間）。

1. テストの準備。
   1. 試験開始前に少なくとも30分間マウスを試験室に順応させる。
   2. 70％エタノールスプレーを使用して装置を殺菌する。
   3. 約1インチの冷たい（12〜14℃）水で装置を満たす。
   4. エスケープボックスの真下に電気加熱パッドまたはその他の加熱源を置きます。エスケープボックスは、テストの間中暗く暖かい状態に保ちます。
   5. 明るい光源を装置の上に置きます。
      注：装置自体から動物を研究するために見えるかもしれないランプを使用している場合は、ランプが同じ場所に置かれていることを確認してください毎日の会場。ランプ自体は、マウスがエスケープボックスの位置を突き止めるために使用するもう1つの視覚的な手がかりを表し、結果を複雑にする可能性があります。
2. 試験プロトコル
   1. マウスをそのケージから尾でゆっくりと取り出し、装置の中央に置く。
   2. 動物が装置内に入るとすぐに、タイミングを開始します。
   3. 動物が正しい出口を見つけ、エスケープボックスを見つけた/入力したら、タイミングを停止し、正しい経路を見つけるために必要な秒数を記録します。
   4. 動物が終結孔に登場しようとし、10秒後に自発的に迷路に戻らない場合は、手で迷路の中心に動物を戻してください。
   5. 動物がエスケープボックスへの正しい経路を3分（180秒）以内に見つけられなかった場合は、試行に失敗としてスコアを付け、180秒として記録する。手で正しい経路に向かって動物を慎重に誘導してください。
   6. 許可するマウスをエスケープボックスに入れて1分間、試行錯誤してください。
   7. 1分の休憩が終わったら、エスケープボックスから動物を取り出し、ホームケージに戻します。
   8. エスケープボックスを徹底的に浄化し、70％エタノールスプレーで出て、マウスが正しい逃避経路を見つけるために嗅覚の手がかりを使用しないようにします。この手順は数秒を要しません。
   9. 次の試行のために迷路にマウスを戻します。
   10. マウスが合計3回の試行を完了し、エスケープボックスに3回置かれるか、またはエスケープボックスに3回導かれるまで、ステップ3.2.1-3.2.9を繰り返します。
   11. 最後の1分間の休息の後、マウスをそのホームケージに戻す。
   12. 動物の間で装置内の水を排水して交換し、試験中一貫した温度を確保する。
   13. テストするマウスごとに手順3.2.1-3.2.12を繰り返します。
   14. 翌日、準備ステップ3.2.1-3.2.5を繰り返します。視覚的手掛かりが残っていることを確認する際には特に注意してください試験日の間に一貫した位置に置く。
   15. 上記の毎日の試験プロトコールを用いて動物を1日3回、4日間（訓練期間）、最後の3日間の試験で5日目の記憶保持を試験する。 6回目の3試行テスト（長期記憶保持）は12日目に行うことができます。
   16. テスト日数が5〜12日の間にテストを実行しないでください。
3. 分析
   1. マウスが180日以内に迷路を完成しなかった場合（ すなわち、合計6回の試行がすべて180秒で合計された）、試験条件によってマウスが十分に動機付けられていないと考え、分析から除外する。
   2. その日の毎日3回の試行を平均して、各被験者の迷路を完成させる平均潜時を計算します。
   3. 5日間の試験および長期記憶試験日に標準的なt検定を用いてグループを比較するために、記憶保持におけるグループの差異を得る。 m2つのグループよりも多くのグループが比較されている場合は、得られた有意性をフォローアップするための適切なポストホック分析（Tukey検定など）に続いて一方向ANOVAを使用する必要があります。
   4. 分散の反復測定分析を経由して取得期間（1-4日）で群差を取得します。

結果

RWT迷路（ 図1 ）を用いて、制御された皮質衝撃誘発TBIまたは偽手術のいずれかを受けるようにランダムに割り当てられたマウスの傷害依存性空間記憶障害を調べた。傷害は、3mmの凸状先端を有するソレノイド駆動の皮質衝撃および6m / sの打撃速度、1mmの浸透深度、および200msの接触時間を用いて生成された。マウスは、手術後35日目から認知試?...

ディスカッション

ここに示されたRWT迷路プロトコルは、CCI誘発TBIマウスと擬似対照を首尾よく区別し、MWMおよびBarnes環状迷路の代わりに実行可能なマウス中心の代用品である。ここで報告された結果は、TBIマウスモデルにおいてRWT迷路の使用にのみ話すながら、この装置は、MWM非現実的^15、17を使用して製造されたスイム基づく試験から得られた違反を応力によって?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 Gal. Hot Dipped Steel Round Tub	Home Depot	Internet #206638142	Needed: 1
1-1/2 in. ABS DWV SPG x SJ Trap Adapter	Home Depot	Internet #100344703, Store SKU #188956	Needed: 9
1-3/4 in. x 1-7/16 in. Black Rubber Stopper	Home Depot	Internet #100114974 Store SKU #755844	Needed: 8
1-1/2 in. ABS DWV 90 Degree Hub x Hub Elbow	Home Depot	Internet #100346663 Store SKU #188603	Needed: 1
HDX 10 Gal. Storage Tote	Home Depot	Internet #202523587 Store SKU #258804 Store SO SKU #258804	Needed: 1
Impact One Stereotaxic Impactor for CCI	Leica Biosystems	39463920	Needed: 1
Vernier Stereotaxic w/ Manual Fine Drive Stereotaxic Instrument for Small Animals	Leica Biosystems	39463001	Needed: 1