Valutare l'alterazione della memoria spaziale in un modello di topi di lesioni traumatiche del cervello usando un labirinto radiale

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per una prova specifica del topo di cognizione che non richiede nuoto. Questo test può essere utilizzato per distinguere con successo i topi traumatici e lesioni cerebrali indotte da impatto corticale controllato dai controlli di sangue.

Abstract

Nonostante il recente aumento dell'uso dei modelli di topi nella ricerca scientifica, i ricercatori continuano ad utilizzare compiti cognitivi originariamente progettati e convalidati per l'uso del ratto. Il test di labirinto Radial Water Tread (RWT) della memoria spaziale (progettato appositamente per i topi e che non richiede nuoto) è stato dimostrato in precedenza per distinguere con successo tra i topi TBI controllati dall'impatto corticale e i controlli di sangue. Qui viene presentato un protocollo dettagliato per questa attività. Il labirinto RWT capitalizza sulla tendenza naturale dei topi per evitare aree aperte a favore di abbracciare i lati di un apparato (thigmotaxis). Le pareti del labirinto sono fiancheggiate da nove fori di fuga posizionati al di sopra del pavimento dell'apparecchio, e i topi sono addestrati per usare le indicazioni visive per individuare il foro di fuga che porta dal labirinto. Il labirinto è pieno di un centimetro di acqua fredda, sufficiente a motivare la fuga, ma non abbastanza profonda per richiedere che il nuoto del nuoto. Il periodo di acquisizione richiede solo quattro addestramentiGiorni con un test di ritenzione della memoria nel giorno 5 e un test di memoria a lungo termine il giorno 12. I risultati qui riportati suggeriscono che il labirinto RWT è un'alternativa fattibile ai test cognitivi basati sul nuoto convalidati da ratto nella valutazione dello spazio Deficit di memoria nei modelli del mouse di TBI.

Introduzione

Le alterazioni della memoria sono tra i sintomi più comuni riportati dai pazienti in seguito alla lesione traumatica del cervello (TBI) ^{1 , 2} . L'identificazione e la valutazione accurata di analoghi deficit di memoria nei modelli animali di TBI sono quindi essenziali per la nostra comprensione di questa condizione e la sua gestione. Qui presentiamo un protocollo per testare la memoria spaziale in un modello di mouse di TBI usando un labirinto Radial Water Tread (RWT). Questo apparato è stato precedentemente mostrato per valutare i deficit cognitivi nei modelli di topo di TBI ³ indotti da impatto corticale controllato (CCI) e rappresenta un'alternativa potenziale a prove sperimentali di cognizione convalidate dal ratto.

La crescente diversità e disponibilità di modelli di topi transgenici ha portato ad un recente incremento dell'uso di topi nei ratti nella ricerca scientifica ⁴ . Nonostante questo turno, i ricercatori continuano a contare su un comportamento aI compiti cognitivi originariamente progettati e convalidati per l'uso del ratto. I test più comuni attualmente utilizzati per valutare la conoscenza nei topi, il labirinto acquatico di Morris (MWM) e il labirinto circolare di Barnes, sono stati appositamente progettati per capitalizzare i comportamenti istintuali trovati nei ratti ^{5 , 6} . Considerando le differenze genetiche, neuroetologiche e cognitive che esistono tra queste due specie ⁴ , non è sorprendente che i topi siano costantemente sottoperformati a questi compiti ^{7 , 8} .

Le differenze dipendenti dalle specie nell'abilità di test sono particolarmente interessanti nei test cognitivi basati sul nuoto, come il MWM. Mentre entrambi i ratti e i topi sono nuotatori esperti, i ricercatori hanno identificato diversi ceppi di topi che eseguono notevolmente male i compiti cognitivi basati sul nuoto ^{9 , 10 , 11 , 12 , 13} . Anche in animali selvatici, i ratti generalmente superano i topi ^{7 , 8} . Mentre questo potrebbe essere interpretato come una differenza specifica della specie nella memoria spaziale, analisi di follow-up utilizzando un labirinto a terra secca non hanno rilevato differenze dipendenti dalla specie nelle prestazioni cognitive ⁸ . Un certo numero di fattori non correlati alla cognizione potrebbero rappresentare questa constatazione, comprese le differenze dipendenti dalla specie sia nella capacità di nuoto che nella strategia di ricerca. Infatti, l'analisi fattoriale delle strategie di ricerca specifiche del mouse nel MWM mostra che i fattori non-conoscitivi (in particolare, la thigomotaxis e la passività [ cioè , galleggianti]) possono svolgere un ruolo più significativo nelle prestazioni MWM rispetto all'apprendimento spaziale ¹⁴ .

Qui dimostriamo l'uso di una prova cognitiva progettata per capitalizzare l'inComportamento conciso di topi e che non necessita di nuoto, per misurare la disfunzione di memoria spaziale in un modello di topi del CCI indotto da TBI. Mentre il labirinto RWT ( Figura 1 A-B ) è stato concepito come un nuovo ibrido del labirinto circolare MWM e Barnes, è stato specificamente progettato per sfruttare il comportamento thigmotactic istintivo ai topi ^{15 , 16} . L'apparecchio è costituito da una vasca d'acciaio zincata da 32 pollici in cui sono stati forati nove fori di uscita uniformemente distanziati. I fori sono centrati di 2-1 / 4 pollici al di sopra del pavimento della vasca e sono dimensionati per adattarsi ad adattatori trapani ABS DWV SPG x SJ da 1-1 / 2 pollici. Otto delle uscite sono coperte dall'esterno e cieco ad una profondità di 1 pollice con gli arresti di gomma. Il nono è collegato da un gomito a 90 gradi acrilonitrile butadiene stirene (ABS) ad una scatola di plastica opaca da cui il mouse può essere facilmente rimosso dopo la prova. Nel corso di unBreve periodo di acquisizione, il mouse è addestrato per utilizzare le indicazioni visive uniche che fiancheggiano il labirinto per individuare questa scatola di fuga. Durante i test, il labirinto è riempito con un pollice di acqua fredda (12-14 ° C), abbastanza avversivo da promuovere la fuga, ma non abbastanza profondo che il mouse è necessario per nuotare.

Il labirinto di RWT rappresenta un'alternativa a basso costo e basso mantenimento del MWM ed è stato utilizzato con successo nei modelli di topi invecchiati e transgenici dei modelli ^{15 , 17 , 18 , 19} e CCI indotti da TBI ³ . Il protocollo qui descritto rappresenta un metodo semplice ed efficace per misurare la compromissione della memoria spaziale che non richiede alcuna formazione pre-lesioni e potrebbe essere facilmente modificata in base alle particolari esigenze di un laboratorio di ricerca.

Protocollo

Tutte le procedure e la manipolazione degli animali sono state condotte in conformità con le linee guida per la cura degli animali rilasciate dall'Istituto Nazionale di Salute e dall'Università di Washington Animal Care and Use Committee.

1. Chirurgia

1. Anestetizza il topo al 5% di isoflurano in una scatola di induzione fino all'inconscio. Confermare l'anestesia con una riduzione del tasso di respirazione e l'assenza di un riflesso di ritiro dopo toe-pinch.
2. Mantenere l'anestesia attraverso il cono al naso a 2-2,5% durante l'intervento chirurgico. Monitorare il tasso di respirazione durante l'intervento chirurgico per assicurare che il topo rimanga inconscio.
3. Posizionare il mouse in predisposizione su un tappetino di riscaldamento e posizionare il mouse nel dispositivo stereotassico utilizzando le barre degli orli, assicurandosi che la testa sia sicura e piatta.
4. Togliere i capelli dal cuoio capelluto utilizzando la crema di rimozione dei capelli. Sciacquare bene il cuoio capelluto con salina.
5. Pulire il sito chirurgico con un iodio alternato e un lavaggio al 70% di etanolo.
6. AdministeIniezione sottocutanea di Lidocaine e Bupivacaine (1 mg / kg) al cuoio capelluto.
7. Con forbici chirurgiche, eseguire un'incisione midline longitudinale e ritirare la pelle per rivelare il cranio.
8. Utilizzando una sega a trefine da 5 mm preformare una craniotomia sopra la corteccia frontoparietale sinistra con punto centrale a 2,5 mm dietro bregma e 2,5 mm a sinistra della linea mediana. Rimuovere con cautela il cerchio dell'osso per esporre il cervello.
9. Impostare il dispositivo di impatto a una velocità di 6 m / s e 200 ms di tempo di sosta.
10. Posizionare il dispositivo dell'impulso finché la punta di impatto convessa da 3 mm non tocca leggermente la superficie del cervello a 2,5 mm dietro il bregma e 2,55 mm a sinistra della linea mediana. Togliere la punta di impatto e abbassare di 1 mm (profondità d'impatto). Quando è pronto spegnere il dispositivo, generando l'impatto desiderato.
11. Coprire la craniotomia con un disco sterile di polipropilene cementato a derma con adesivo tissutale e suturare l'incisione chiusa.
12. Togliere il mouse dall'anestesia e dare l'IP di iniezione di BuprEnorfina (0,5 mg / kg).
13. Lasciare riposare il mouse in una gabbia pulita, riscaldata da un tappetino di riscaldamento. Il mouse deve essere monitorato per segni di dolore o disturbo nei prossimi 24 h.
    NOTA: i controlli Sham devono ricevere il trattamento identico come sopra, con i passaggi 1.8-1.9 omessi.

2. Costruzione di labirinto radiale del mattone dell'acqua

1. Foro 9 buchi di uscita, abbastanza grandi per ospitare gli adattatori di trapano ABS DWV SPG x SJ da 1-1 / 2 pollici, a intervalli uguali intorno alla circonferenza di una tubazione in acciaio zincato di 32 pollici. Centrare questi fori di uscita circa 2-1 / 4 pollici sopra il pavimento della vasca.
2. Montare un adattatore per trappola ABS DWV SPG x SJ da 1-1 / 2 pollici in ciascuno dei fori di uscita e fissarlo con i dadi ad anello inclusi.
3. Con tappi in gomma, il tappo otto delle nove uscite dall'esterno dell'apparecchio. L'uscita finale e non scoperta servirà come via di fuga. Non importa quale uscita sia designata come via di fuga.
4. Fissare un ABS da 90 °Gomito verso l'estremità esterna dell'uscita rimanente. La curva a 90 ° serve a impedire ai soggetti di prova di determinare visivamente la corretta via di fuga dall'interno del labirinto.
5. Costruire la scatola di scarico da qualsiasi scatola opaca in grado di essere sanificata e di circa 30 cm x 15 cm x 15 cm. Tagliare un foro sul lato della scatola, direttamente sopra il pavimento, abbastanza grande per ospitare un gomito ABS da 90 °.
6. Fissare la scatola di fuga all'estremità terminale del gomito ABS da 90 °.
7. Alzare leggermente la scatola di fuga (meno di un pollice) sopra la superficie del pavimento. Ciò consente di alloggiare ampi spazi per un pannello di riscaldamento elettrico o un'altra sorgente di riscaldamento da posizionare sotto la scatola di fuga.
8. Stampare e laminare almeno 5 segnali visivi unici. Utilizzare immagini semplici e ad alto contrasto che possono essere facilmente individuate dall'apparecchio. Si raccomandano forme di clipart in bianco e nero (triangolo, quadrato, cerchio).
9. Usando i magneti, aderire i segni visivi alle pareti interne delapparato. I segnali dovrebbero essere approssimativamente uguali a distanza, attorno alla circonferenza dell'apparecchio.

3. Radial Water Label Label

NOTA: Il test di labirinto dell'acqua dovrebbe iniziare solo dopo che il sito chirurgico è stato guarito (circa una settimana dopo l'intervento chirurgico).

1. Preparazione per il test.
   1. Consentire ai topi di acclimatarsi nella sala di prova per almeno 30 minuti prima di iniziare i test.
   2. Sanitizzare l'apparecchio utilizzando un spray al 70% di etanolo.
   3. Riempire l'apparecchio con circa 1 pollice di acqua fredda (12-14 ° C).
   4. Mettere un tappetino elettrico o un'altra sorgente di riscaldamento direttamente sotto la scatola di fuga. Tenere la scatola di fuga scura e calda per tutta la durata del test.
   5. Posizionare una sorgente luminosa luminosa sopra l'apparecchio.
      NOTA: Se si utilizza una lampada che potrebbe essere visibile per la ricerca degli animali dall'apparato stesso, fare attenzione a accertarsi che la lampada sia posta nello stessoOgni giorno. La lampada stessa potrebbe rappresentare un'altra segnalazione visiva per i topi da utilizzare per individuare la scatola di fuga e spostandola drasticamente di giorno in giorno potrebbe complicare i risultati.
2. Protocollo di prova
   1. Rimuovere il mouse dalla sua gabbia dolcemente dalla coda e collocare al centro dell'apparecchio.
   2. Appena l'animale è dentro l'apparecchio, comincia il timing.
   3. Una volta che l'animale ha trovato l'uscita corretta e ha trovato / entrato nella casella di fuga, interrompere la temporizzazione e registrare il numero di secondi richiesti per trovare il percorso corretto.
   4. Se l'animale tenta di salire in un foro di terminazione e non spontaneamente rientrare nel labirinto dopo 10 secondi, guidare l'animale indietro nel centro del labirinto a mano.
   5. Se l'animale non riesce a trovare il percorso corretto nella scatola di fuga entro 3 minuti (180 s), segnala la prova come fallimento e registra come 180 s. Guidare con cura l'animale verso il corretto percorso a mano.
   6. Consenti ilMouse per rimanere nella scatola di fuga per un minuto, inter-trial riposo.
   7. Una volta che il riposo di 1 min è passato, rimuovere l'animale dalla scatola di fuga e tornare alla sua gabbia.
   8. Dissaldare accuratamente la scatola di uscita e uscire con un spray al 70% di etanolo per impedire al mouse di utilizzare segnali olfattivi per individuare il corretto tracciato di fuga. Questo passaggio non dovrebbe richiedere più di pochi secondi.
   9. Rimettere il mouse al labirinto per il prossimo processo.
   10. Ripetere i passaggi 3.2.1-3.2.9 fino a che il mouse non ha completato un totale di tre prove, ed è stato posizionato o è stato portato alla casella di fuga per tre volte.
   11. Dopo il riposo finale di 1 minuto, rimettere il mouse sulla sua gabbia.
   12. Scolare e sostituire l'acqua nell'apparecchio tra gli animali per garantire una temperatura uniforme durante i test.
   13. Ripetere i passaggi 3.2.1-3.2.12 per ogni mouse da testare.
   14. Il giorno successivo, ripetere le fasi di preparazione 3.2.1-3.2.5. Prestare particolare attenzione nel garantire che i segnali visivi rimanganoIn posizioni costanti tra i giorni di prova.
   15. Testate gli animali utilizzando il precedente protocollo di sperimentazione quotidiana per tre prove al giorno per quattro giorni (periodo di allenamento), con un ultimo test a tre prove per la conservazione della memoria il quinto giorno. Un sesto test triplice (lunga durata di memoria) può essere dato il giorno dodici.
   16. Non effettuare alcuna prova tra i cinque ei dodici giorni di prova.
3. Analisi
   1. Se un mouse non riesce a completare il labirinto in meno di 180 secondi durante un periodo di due giorni ( cioè un totale di 6 prove consecutive, tutte segnate a 180 s), considerare il mouse insufficientemente motivato dalle condizioni di prova e rimuovere dall'analisi.
   2. Calcola la latenza media per completare il labirinto per ciascun soggetto di data di prova, misurando le tre prove quotidiane per quel giorno.
   3. Ottenere le differenze di gruppo nella memoria di memoria usando t-test standard per confrontare i gruppi alla prova del quinto giorno e alla data di prova della memoria a lungo termine. Se mRispetto a due gruppi sono stati confrontati, invece, l'ANOVA a senso unico seguita da un'adeguata analisi post-hoc (come il test di Tukey) per seguire qualsiasi significato ottenuto.
   4. Ottieni differenze di gruppo nel periodo di acquisizione (giorni 1-4) mediante analisi ripetuta di varianza.

Risultati

Il labirinto RWT ( Figura 1 ) è stato utilizzato per indagare i deficit di memoria spaziale dipendenti da lesioni nei topi assegnati in modo casuale per ricevere o controlli controllati a effetto corticale TBI o sham. La lesione è stata generata utilizzando un impatto corticale guidato da solenoide con una punta convessa da 3 mm ei seguenti parametri di lesione: velocità di attacco 6 m / s, profondità di penetrazione di 1 mm e tempo di contatto di 200 ms...

Discussione

Il protocollo di labirinto RWT presentato qui segna con successo la distinzione tra i topi TBI indotti da CCI e i controlli di sham e rappresenta un'alternativa alternativa possibile al mouse al MWM e al labirinto circolare di Barnes. Mentre i risultati riportati qui parlano solo dell'uso del labirinto RWT in un modello di topi TBI, questo apparecchio è stato utilizzato con successo nei modelli invecchiati e transgenici in cui la non conformità causata da stress derivante da prove basate sul nuoto effettuate u...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 Gal. Hot Dipped Steel Round Tub	Home Depot	Internet #206638142	Needed: 1
1-1/2 in. ABS DWV SPG x SJ Trap Adapter	Home Depot	Internet #100344703, Store SKU #188956	Needed: 9
1-3/4 in. x 1-7/16 in. Black Rubber Stopper	Home Depot	Internet #100114974 Store SKU #755844	Needed: 8
1-1/2 in. ABS DWV 90 Degree Hub x Hub Elbow	Home Depot	Internet #100346663 Store SKU #188603	Needed: 1
HDX 10 Gal. Storage Tote	Home Depot	Internet #202523587 Store SKU #258804 Store SO SKU #258804	Needed: 1
Impact One Stereotaxic Impactor for CCI	Leica Biosystems	39463920	Needed: 1
Vernier Stereotaxic w/ Manual Fine Drive Stereotaxic Instrument for Small Animals	Leica Biosystems	39463001	Needed: 1