방사형 워터 트레드 미로를 이용한 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 공간 기억 장애의 평가

요약

여기서 우리는 수영을 필요로하지 않는 마우스 특유의인지 검사 프로토콜을 제시합니다. 이 테스트는 통제 된 피질 충격 유발 외상성 뇌 손상 마우스와 가짜 컨트롤을 성공적으로 구별하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

최근 과학 연구에서 마우스 모델을 사용하는 증가에도 불구하고 연구원들은 원래 의도적으로 설계된 쥐 사용을 위해 검증 된인지 작업을 계속 사용합니다. 공간 기억의 방사형 워터 트레드 (RWT) 미로 테스트 (마우스를 위해 특별히 설계되었으며 수영을 필요로하지 않음)는 이전에 피질 충격 유발 TBI 마우스와 가짜 컨트롤을 성공적으로 구별하는 것으로 나타났습니다. 여기,이 작업을위한 상세한 프로토콜이 제시됩니다. RWT 미로는 쥐가 자연적으로 쥐를 잡아 당겨서 장치의 측면을 포옹하는 것을 방지하기위한 자연스러운 경향을 이용합니다 (thigmotaxis). 미로의 벽에는 장치의 바닥 위에 9 개의 탈출구가 있으며, 마우스는 시각적 신호를 사용하여 미로 밖으로 이어지는 탈출 구멍을 찾도록 훈련됩니다. 미로는 차가운 물로 채워져 도망 치기에 충분하지만 쥐가 수영을 할만큼 충분히 깊지는 않습니다. 획득 기간은 네 번의 교육 만 필요합니다.5 일간의 기억력 검사와 12 일째의 장기간 기억력 검사를 실시했다. 여기에보고 된 결과는 RWT 미로가 쥐가 검증 한 수영 기반인지 검사의 대안으로 공간적 평가 TBI 마우스 모델의 기억력 결핍.

서문

메모리 손상은 외상성 뇌 손상 (TBI) ^{1, 2} 다음 환자에 의해보고 된 가장 흔한 증상 중입니다. 그러므로 TBI의 동물 모델에서의 유사한 기억 상실의 정확한 확인과 평가는이 상태와 그 관리에 대한 우리의 이해에 필수적입니다. 여기서는 Radial Water Tread (RWT) 미로를 사용하여 TBI의 마우스 모델에서 공간 메모리를 테스트하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이 장치는 이전에 통제 된 피질 충격 (CCI) 유발 TBI ³ 의 마우스 모델에서인지 적 결손을 평가하는 것으로 나타 났으며, 쥐가 검증 한 수영 기반의인지 검사 대안이 될 수 있습니다.

트랜스 제닉 마우스 모델의 다양성과 유용성이 증대됨에 따라 과학 연구 ⁴ 에서 쥐를 이용한 마우스 사용이 최근 증가했다. 이러한 변화에도 불구하고 연구자들은 행동 주의적원래 설계되고 쥐 사용을 위해 검증 된인지 작업. 현재 마우스의인지 기능을 평가하기 위해 사용되는 가장 일반적인 시험은 모리스 물 미로 (MWM) 및 반스 원형 미로는, 구체적으로는 래트 ^{5,도 6에서} 발견 본능적 동작을 활용할 수 있도록 설계되었다. 이 두 종 ⁴ 사이에 존재하는 유전 neuroethological,인지의 차이를 고려하면, 놀랍지 생쥐 이러한 작업 ^{7, 8에} 지속적으로 업종 지수 상승률.

시험 능력의 종에 따른 차이는 특히 MWM과 같은 수영 기반인지 시험에 관한 것이다. 쥐와 쥐 모두 수영에 능숙한 반면, 연구자들은 수영에 기반한인지 능력이 ^{9 , 10 ,} 11 ^{, 12 , 13} . 야생형 동물에서도 쥐가 일반적으로 쥐보다 우월합니다 ^{7 , 8} . 이것은 공간 기억의 종별 차이로 해석 될 수 있지만, 마른 육지 미로를 사용한 유사한 후속 테스트는인지 성능에 종에 따른 차이가 없음을 보여주었습니다 ⁸ . 수영 능력이나 검색 전략의 종에 따른 차이를 포함하여인지와 무관 한 여러 요인이이 발견을 설명 할 수 있습니다. 실제로, MWM 마우스 특정 검색 전략의 요인 분석은 비인 지적 요소 (특히, thigomotaxis과 수동성이 [즉, 부동]) 공간 학습 ^(14)보다 MWM 성능이 더 중요한 역할을 할 수 있음을 보여준다.

여기에서 우리는 다음을 활용하기 위해 고안된인지 테스트의 사용을 보여줍니다.CCI 유도 된 TBI의 마우스 모델에서 공간 기억 장애를 측정하기 위해 생쥐의 진통 작용 및 수영을 필요로하지 않는 실험. RWT 미로 (도 1 A-B)를 MWM 반스 원형 미로 새로운 하이브리드로 이루어진 것으로되지만, 구체적으로 마우스 ^{(15, 16)에} 본능적 thigmotactic 동작을 이용할 수 있도록 설계되었다. 장치는 9 개의 균등하게 이격 된 출구 구멍이 뚫려있는 32 인치 직경의 아연 도금 강철 욕조로 구성됩니다. 구멍은 욕조의 바닥에서 2 ~ 1cm 중심에 있으며 일반적으로 사용 가능한 1-1 / 2 인치 ABS DWV SPG x SJ 트랩 어댑터에 맞게 크기가 지정됩니다. 8 개의 출입구는 바깥 쪽에서 뚜껑을 덮어 고무 마개로 1 인치 깊이까지 눈을 멀게합니다. 아홉 번째는 90 ° 아크릴로 니트릴 부타디엔 스티렌 (ABS) 엘보우로 불투명 한 플라스틱 상자에 연결되어 있으며 테스트 후 마우스를 쉽게 제거 할 수 있습니다. 과정 동안짧은 획득 기간 동안, 마우스는이 이스케이프 상자를 찾기 위해 미로를 감싸는 독특한 시각적 신호를 사용하도록 훈련되었습니다. 시험하는 동안, 미로는 충분히 차가워지는 물 (12-14 ° C)으로 채워지 며, 탈출을 촉진 할만큼 충분히 혐오감을 나타내지 만, 마우스가 수영 할만큼 충분히 깊지는 않습니다.

RWT 미로는 MWM에 대한 저비용, 낮은 유지 보수 대안이며, TBI ^3의 노화 및 형질 전환 생쥐 ^{15 , 17 , 18 , 19} 및 CCI 유도 마우스 모델에서 성공적으로 사용되었습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 사전 손상 교육을 필요로하지 않는 공간 기억 장애 측정을위한 간단하고 효과적인 방법을 나타내며 연구 실험실의 특정 요구에 맞게 쉽게 수정할 수 있습니다.

프로토콜

모든 절차와 동물 취급은 국립 보건원 (National Institutes of Health)과 워싱톤 동물 보호 및 사용위원회 (The University of Washington Animal Care and Use Committee)가 발행 한 동물 관리 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 수술

1. 무의식 때까지 유도 상자에 5 % isoflurane에서 마우스를 마취. 호흡 속도의 감소와 발가락 핀치에 따른 후퇴 반사의 부재로 마취를 확인하십시오.
2. 수술을 통해 2-2.5 %의 코 콘을 통해 마취를 유지하십시오. 마우스가 의식을 잃지 않도록 외과 수술 중 호흡률을 모니터링하십시오.
3. 마우스를 가열 패드에 놓고 귀마개를 사용하여 정위 장치에 마우스를 놓고 머리가 단단하고 평평한 지 확인하십시오.
4. 제모 크림을 사용하여 두피에서 모발을 제거하십시오. 식염수로 두피를 완전히 헹굽니다.
5. 교대 요오드와 70 % 에탄올 세척으로 수술 부위를 닦으십시오.
6. 행정관두피에서 Lidocaine과 Bupivacaine (1 mg / kg)을 피하 주사 하였다.
7. 외과 용 가위로 종아리 중앙선 절개를하고 피부를 수축시켜 두개골을 드러내십시오.
8. 5 mm 트라 파인 톱을 사용하여 좌측 frontoparietal cortex 위에 craniotomy를 시행하여 bregma 뒤 2.5 mm와 정중선 2.5 mm의 중심점을 얻습니다. 조심스럽게 뼈의 원을 제거하여 뇌를 노출시킵니다.
9. 임팩터 장치를 6 m / s 및 200 ms 드웰 시간으로 설정하십시오.
10. 3 mm 볼록 충격 팁이 브레그마 뒤 2.5 mm 및 정중선에서 2.55 mm 떨어진 지점에서 뇌 표면에 살짝 닿을 때까지 임팩터 장치를 배치하십시오. 충격 팁을 후퇴시키고 1 mm (충격 깊이) 낮추십시오. 준비가되면 장치를 발사하여 원하는 효과를냅니다.
11. 조직 접착제로 derma에 cemented 멸균 폴리 프로필렌 디스크로 craniotomy을 커버하고, 봉합 절개를 닫힙니다.
12. 마취에서 마우스를 제거하고 Bupr의 IP 주입(0.5 mg / kg).
13. 마우스를 열 패드로 따뜻하게하여 깨끗한 케이지에서 회복시킵니다. 마우스는 다음 24 시간 동안 통증이나 고통의 징후를 모니터링해야합니다.
    참고 : 위장 대조군은 1.8-1.9 단계가 생략 된 위와 동일한 치료를 받아야합니다.

2. 방사형 워터 트레드 미로 건설

1. 1-1 / 2 인치 ABS DWV SPG x SJ 트랩 어댑터를 수용 할 수있을만큼 큰 32 개의 출구 아울렛 구멍을 32 인치 직경 아연 도금 강철 통의 둘레에 등 간격으로 배치하십시오. 이 배출구 구멍을 욕조 바닥에서 대략 2-1 / 4 인치 가운데에 놓습니다.
2. 각 출구 구멍에 1-1 / 2 인치 ABS DWV SPG x SJ 트랩 어댑터를 끼 우고 포함 된 링 너트로 고정하십시오.
3. 고무 마개를 사용하면 9 개의 캡 중 8 개를 장치 외부에서 배출 할 수 있습니다. 마지막으로 끝나지 않은 출구가 탈출 경로 역할을합니다. 어떤 탈출구가 탈출구로 지정되었는지는 중요하지 않습니다.
4. 90 ° ABS 부착엘보우를 나머지 출구의 바깥 쪽 끝에 붙이십시오. 90 ° 벤드는 시험 대상이 미로 내부에서 올바른 탈출 경로를 시각적으로 결정하는 것을 방지합니다.
5. 위생 처리가 가능한 약 30cm x 15cm x 15cm 크기의 불투명 한 상자에서 이스케이프 상자를 만듭니다. 90 ° ABS 엘보우를 수용 할 수있을만큼 큰 바닥 바로 위의 상자 측면에 구멍을 뚫습니다.
6. 탈출 박스를 90 ° ABS 엘보의 종단에 부착하십시오.
7. 바닥 표면 위의 이스케이프 상자 (1 인치 미만)를 약간 올립니다. 이렇게하면 전기 가열 패드 또는 기타 가열 원을위한 충분한 공간을 이스케이프 상자 아래에 둘 수 있습니다.
8. 최소한 5 가지의 독특한 시각적 단서를 인쇄하고 라미네이트하십시오. 장치 내부에서 쉽게 식별 할 수있는 단순하고 고 대비 인 이미지를 사용하십시오. 흑백 클립 아트 모양 (삼각형, 사각형, 원형)을 사용하는 것이 좋습니다.
9. 자석을 사용하여 시각적 단서를기구. 단서는 장치의 둘레를 중심으로 대략 동일한 거리만큼 떨어져야합니다.

3. 레이디 얼 워터 트레드 미로 프로토콜

참고 : 물 미로 테스트는 수술 부위가 치유 된 후에 만 ​​시작해야합니다 (수술 후 약 1 주일).

1. 테스트 준비.
   1. 시험 시작 전 최소 30 분 동안 마우스를 시험 실에 익숙하게하십시오.
   2. 70 % 에탄올 스프레이를 사용하여 장치를 살균하십시오.
   3. 약 1 인치 (12-14 ° C)의 차가운 물로 장치를 채 웁니다.
   4. 전기 가열 패드 또는 기타 열원을 탈출구 상자 바로 밑에 놓습니다. 테스트 기간 동안 도망 상자를 어둡고 따뜻하게 유지하십시오.
   5. 장치 위에 밝은 광원을 배치하십시오.
      참고 : 장치 자체에서 동물을 조사 할 때 볼 수있는 램프를 사용하는 경우 램프가 동일한 위치에 놓 이도록주의하십시오매일 육성. 램프 자체는 마우스가 이스케이프 상자를 찾는 데 사용하는 또 다른 시각적 단서를 나타낼 수 있으며 매일 마우스를 대폭 이동하면 결과가 복잡해질 수 있습니다.
2. 테스트 프로토콜
   1. 마우스를 케이지에서 부드럽게 꼬리 부분을 제거하고 장치의 중앙에 놓습니다.
   2. 동물이 장비에 들어가 자마자 타이밍을 시작하십시오.
   3. 동물이 올바른 출구를 발견하고 이스케이프 상자를 찾거나 입력했으면 타이밍을 멈추고 정확한 경로를 찾는 데 필요한 초 수를 기록하십시오.
   4. 동물이 종결 구멍에 오르려고 시도하고 10 초 후에 자연스럽게 미로를 다시 입력하지 않으면 동물을 손으로 미로의 중심으로 다시 유도하십시오.
   5. 동물이 3 분 (180 초) 내에 탈출구 상자로의 올바른 경로를 찾지 못하면 재판을 실패로 점수를 매기고 180 초로 기록하십시오. 동물을 올바른 경로로 조심스럽게 인도하십시오.
   6. 허용마우스를 탈출 상자에 넣고 1 분 동안 시험 삼아 휴식을 취하십시오.
   7. 1 분 휴식이 완료되면 탈출 상자에서 동물을 제거하고 홈 케이지로 돌아갑니다.
   8. 철저히 탈출 상자를 위생 처리하고 마우스가 후각 신호를 사용하여 올바른 탈출 경로를 찾지 못하도록 70 % 에탄올 스프레이로 배출합니다. 이 단계는 몇 초가 걸리지 않아야합니다.
   9. 다음 재판을 위해 마우스를 미로로 돌립니다.
   10. 마우스가 총 3 회의 시도를 완료하고 탈출구 상자에 3 번 위치하거나 유도 될 때까지 단계 3.2.1-3.2.9를 반복하십시오.
   11. 마지막 1 분 휴식 후 마우스를 홈 케이지로 가져갑니다.
   12. 테스트 과정에서 온도가 일정하게 유지되도록 동물의 배수관을 배수하고 교체하십시오.
   13. 테스트 할 각 마우스에 대해 3.2.1-3.2.12 단계를 반복하십시오.
   14. 다음날, 준비 단계 3.2.1-3.2.5를 반복하십시오. 시각적 단서가 남아 있도록 특별한주의를 기울이십시오.테스트 일 사이의 일관된 위치에.
   15. 위의 매일 테스트 프로토콜을 사용하여 동물을 하루 4 일 동안 3 번 (훈련 기간) 테스트하고, 5 일째의 메모리 보존을위한 마지막 3 가지 시도 테스트를 사용하여 동물을 테스트하십시오. 여섯 번째 세 가지 시험 (장기 기억 유지)은 일 12 일에 주어질 수 있습니다.
   16. 5 일에서 12 일 사이에 테스트를 수행하지 마십시오.
3. 분석
   1. 마우스가 2 일 동안 180 초 이내에 미로를 완료하지 못하면 ( 즉, 총 6 번의 시도가 모두 180 초로 기록됨), 마우스가 테스트 조건에 의해 동기 부여가 불충분하다고 간주하고 분석에서 제거하십시오.
   2. 해당 일에 대한 3 회의 일일 시험을 평균하여 시험 날짜별로 각 과목에 대한 미로를 완료하는 평균 대기 시간을 계산합니다.
   3. 다섯 번째 날 테스트와 장기간 메모리 테스트 날짜에 그룹을 비교하기 위해 표준 t- 테스트를 사용하여 메모리 보존의 그룹 차이를 얻습니다. m두 그룹보다 더 많은 양을 비교하고 있다면, 얻은 중요성에 대해 후속 조치를 취하는 적절한 사후 분석 (예 : Tukey 's test)이 뒤따른 일원 분산 분석을 사용해야합니다.
   4. 반복 된 분산 분석을 통해 수집 기간 (1-4 일)에 그룹 차이를 얻습니다.

결과

RWT 미로 ( 그림 1 )는 통제 된 피질 충격 유발 TBI 또는 가짜 수술 중 하나를 받기 위해 무작위로 할당 된 생쥐의 상해 의존 공간 기억 장애를 조사하기 위해 사용되었습니다. 상해는 3 mm 볼록한 팁과 6 m / s 타격 속도, 1 mm 관통 깊이 및 200 ms 접촉 시간과 같은 손상 매개 변수를 사용하여 솔레노이드 구동 피질 충격을 사용하여 생성되었습니다. 쥐는 수술...

토론

여기에 제시된 RWT 미로 프로토콜은 CCI 유도 TBI 마우스와 가짜 컨트롤을 성공적으로 구별하며, MWM 및 Barnes 원형 미로의 대안으로 실현 가능한 마우스 중심의 솔루션입니다. 여기에보고 된 결과는 TBI 마우스 모델에서 RWT 미로만을 사용하는 것으로 나타 났지만,이 장치는 MWM을 사용하여 만든 스트레스 유발 불응 법으로 인한 스트레스 유발 불 준수가 비 효과적 인 노화 및 형질 전환 모델에서 성공적...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 Gal. Hot Dipped Steel Round Tub	Home Depot	Internet #206638142	Needed: 1
1-1/2 in. ABS DWV SPG x SJ Trap Adapter	Home Depot	Internet #100344703, Store SKU #188956	Needed: 9
1-3/4 in. x 1-7/16 in. Black Rubber Stopper	Home Depot	Internet #100114974 Store SKU #755844	Needed: 8
1-1/2 in. ABS DWV 90 Degree Hub x Hub Elbow	Home Depot	Internet #100346663 Store SKU #188603	Needed: 1
HDX 10 Gal. Storage Tote	Home Depot	Internet #202523587 Store SKU #258804 Store SO SKU #258804	Needed: 1
Impact One Stereotaxic Impactor for CCI	Leica Biosystems	39463920	Needed: 1
Vernier Stereotaxic w/ Manual Fine Drive Stereotaxic Instrument for Small Animals	Leica Biosystems	39463001	Needed: 1