النمذجة سمية اميلويد-β42 ونيوروديجينيريشن في المخ الزرد الكبار

Prabesh Bhattarai; Alvin Kuriakose Thomas; Mehmet Ilyas Cosacak; Christos Papadimitriou; Violeta Mashkaryan; Yixin Zhang; Caghan Kizil

doi:10.3791/56014

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

ويصف هذا البروتوكول التوليف، وتوصيف، وحقن من الببتيدات β42 اميلويد أحادي لتوليد سمية اميلويد في الزرد الكبار وضع نموذج مرض الزهايمر، تليها تحليلات غذائها والكشف عن التجميعات.

Abstract

مرض الزهايمر (ميلادي) هو المنهكة المرض الأعصاب التي تراكم السامة اميلويد-β42 الببتيدات (Aβ42) يؤدي إلى انحطاط متشابك، التهاب، موت الخلايا العصبية، وتعلم العجز. البشر لا يمكن تجديد الخلايا العصبية المفقودة في حالة الإعلان جزئيا بسبب ضعف القدرات التكاثري للخلايا الجذعية العصبية/السلف (نسبكس) والخلايا تخفيض. ولذلك، ينبغي أيضا أن يعزز كفاءة العلاجات التجدد الانتشار وقدرة العصبية نسبكس. الزرد (دانيو rerio) كائن التجدد، ويمكننا أن نتعلم البرامج الجزيئية الأساسية التي يمكن أن نصمم النهج العلاجي للتصدي للإعلانات. ولهذا السبب، من الضروري توليد نموذج مثل الإعلان في الزرد. استخدام منهجيتنا، يمكننا إدخال المشتقات الاصطناعية من الببتيد Aβ42 مع القدرة على اختراق أنسجة الدماغ الزرد الكبار، وتحليلها باثولوجيا المرض والاستجابة التجدد. ميزة على الطرق القائمة أو نماذج حيوانية الزرد تلك يمكن أن تعلمنا كيف يمكن بطبيعة الحال تجديد دماغ فقاريات، ومما يساعدنا على علاج أمراض الأعصاب البشرية أفضل من خلال استهداف نسبكس الذاتية. ولذلك، طراز اميلويد-سمية في الدماغ الزرد الكبار قد فتح آفاقاً جديدة للبحث في مجال علم الأعصاب والطب السريري. بالإضافة إلى ذلك، يسمح تنفيذ هذا الأسلوب بسيطة لتقييم تجريبية فعالة من حيث التكلفة والكفاءة. ويصف هذه المخطوطة التوليف وحقن من الببتيدات Aβ42 في الدماغ الزرد.

Introduction

الإعلان هو مرض مزمن تدريجي تتسم بفقدان الخلايا العصبية وسينابسيس في قشرة الدماغ¹^،²^،³^،^،من⁴⁵. بصمات لاثيل الكلاسيكي للإعلان هي ترسب الببتيدات اميلويد والتشابك تشكيل نيوروفيبريلاري (NFTs)⁶. خرف لويحات، يعرف أيضا باسم لويحات اميلويد، تتألف من الببتيدات اميلويد-بيتا (Aβ) التي تشكل هياكل الطيات بيتا في الدماغ حمة⁵. تراكم Aβ42 في المرضى الإعلانية دور مبكر وحاسم في تطور المرض. إعلان يطلق سلسلة أحداث التي أدت إلى خلل متشابك اللدونة البصر وفقدان الخلايا العصبية⁷^،⁸^،^،من⁹¹⁰.

الدماغ الكبار من الزرد تيليوست بمثابة نموذجا ممتازا لدراسة تنظيم الخلايا الجذعية اللدونة¹¹^،^،من¹²¹³^،^،من¹⁴¹⁵^، ¹⁶^،^،من¹⁷¹⁸^،^،من¹⁹²⁰ والأمراض المختلفة في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، بما في ذلك الإعلان²¹^،²²^،²³ ^،²⁴. ونظرا لمجموعة واسعة من الأساليب التجريبية المتاحة¹⁹^،^،من²⁰²⁵^،²⁶^،²⁷^،^،من²⁸²⁹^، ³⁰ ^, ³¹، من هذه الدراسات مفيدة ومجدية. ويمكن تجديد الزرد الجهاز العصبي المركزي¹³^،¹⁵^،³²^،^،من³³³⁴^،³⁵^،³⁶^،³⁷^، ³⁸، في جزء منه باستخدام البرامج الجزيئية تفعيلها بعد فقدان الخلايا العصبية¹⁹^،³⁹^،^،من⁴⁰⁴¹^،^،من⁴²⁴³^، ⁴⁴. ولذلك يمكن أن يساعد وضع نموذج مرض الأعصاب في الزرد عنوان رواية أسئلة بشأن التجدد البيولوجيا القدرة، والخلايا الجذعية في أدمغة الفقاريات.

في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير نموذج سمية اميلويد في الدماغ الزرد الكبار عن طريق حقن الاصطناعية Aβ42 الببتيدات (الجدول 1)³⁹. تسبب هذه الحقن تعمل نيوروديجينيريشن يذكرنا بأمراض المخ البشري (مثلموت الخلية، التنشيط ميكروجليال، وانحطاط متشابك والعجز في الذاكرة)، مما يشير إلى أن الزرد يمكن استخدامها للحصول على نيوروديجينيريشن في المخ الزرد، حددت Aβ42 يمكن اكتشاف الببتيدات مع ستاينينجس المناعي، والآليات الجزيئية للتجدد في الزرد البالغين يمكن أن يكون الجهاز العصبي المركزي³⁹. في هذا البروتوكول، ونظهر حقن الببتيدات اميلويد الاصطناعية في الدماغ الزرد استخدام سيريبروفينتريكولار حقن (كفمي) أسلوب²⁷^،³⁹^،^،من⁴⁵⁴⁶ لتقليد ترسب اميلويد (الشكل 1). كفمي يوفر طريقة جديدة لإيصال الببتيدات، تجميع عند الحقن كهياكل β-ورقة وممارسة السمية. الببتيدات توزع بالتساوي في جميع أنحاء الدماغ، واستهداف منطقة البطين على طول محور rostro والذيلية كامل⁴⁵. بالإضافة إلى ذلك، يسمح هذا الأسلوب لتحليل استجابة الجزيئية والمورفولوجية نسبكس في المخ الزرد الكبار عقب تضمينات اميلويد. هذه الدراسات سوف يتيح لنا نظرة ثاقبة لإصلاح الدماغ الناجح في الثدييات. يمكن استخدام لدينا طريقة لفهم إليه استجابة التجديد الناجح الجزيئية الضرورية بعد الإعلان تشبه أعراض للحث على تجديد الخلايا العصبية المفقودة واستعادة الوظيفية.

Protocol

هذا البروتوكول إجراء موحد اقترح المبادئ التوجيهية للاتحاد الأوروبي (2010/63) و "الجمعية الأوروبية" "نماذج الأسماك" في علم الأحياء والطب (يوفيشبيوميد) في كارلسروه معهد للتكنولوجيا (مجموعة). جميع الأساليب الموصوفة هنا بعد موافقة لجنة الأخلاقيات (درسدن لانديسديريكشن؛ والوثيقة رقم تفف-52/2015)-

1. إعداد الببتيد Aβ42

Synthesize الببتيدات (انظر الجدول 1) باستخدام الكيمياء قياسي 9-فلورينيلميثوكسيكاربونيل (معتدلاً) مع 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- تيتراميثيلورونويومهيكسافلورفوسفاتي (هبتو) ككاشف اقتران المعني المزج الآلي المرحلة الصلبة ببتيد ⁵². وكان نطاق التوليف 100 µmol-
المزج الآلي الببتيد مع 500 ملغ الراتنج المحمية معتدلاً في المرحلة الصلبة (تحميل قدرة 0.2 ميللي مول/غرام). تحميل المذاب الأحماض الأمينية المحمية معتدلاً بتركيز 0.5 متر في الحجم المطلوب ومحسوبة لمركب كل منهما.
ملاحظة: الحسابات مصنوعة لتمكين اقتران كل من الأحماض الأمينية المحمية معتدلاً مرتين مع فائض 5 مرات في كل كتلة راتنج ⁴⁷.
حل الكواشف اللازمة لتوليف الببتيد في ديميثليفورماميدي (DMF). على سبيل المثال، إعداد المنشط، هبتو، بتركيز 0.48 م، 45% v/v ميثيلمورفوليني ن (نم) (القاعدة)، و 5% v/v "أنهيدريد الخل" (خليط متوجا) كاب المجموعات الأمينية غير رد.
تهزم جميع الببتيدات من الراتنج بالاختلاط باستمرار دعم متين استخدام المحرض في خليط انقسام طازجة تتكون من حامض Trifluoroacetic (تفا): Triisopropylsilane(TIS): المياه: ديثيوثريتول (DTT) في 90 (v/v): 5 (v/v): 2.5 (v/v): 2.5 (m/v)، ل 4 h. استخدام 10 مل لتوليف جدول 100 µmol-
يعجل المنتج ملصوق بإضافة خليط الانقسام إلى 100 مل المثلج إثيل الاثير. تمرير من خلال وحدة ترشيح التي تحتوي على عامل تصفية تترافلوروايثيلين (PTFE) مع حجم مسام ميكرومتر 0.45 والغسيل مع مل 20 المثلج إثيل الاثير.
جمع الببتيد التي تمت تصفيتها من ورق الترشيح وتذوب 100 مغ من سرع من الببتيد في 5 مل منزوع الماء المقطر: الاسيتو الانيتريل 1:1.
نق عن طريق عكس المرحلة اللوني السائل عالي الضغط ([هبلك]) على [هبلك] شبه محضرة مزودة بعمود ديفينيلبينزيني البوليستيرين مسامية من حبة حجم 10 ميكرون.
1. قبل الحرارة العمود والحفاظ على الأقل 50 درجة مئوية باستخدام عمود تدفئة الجهاز. جمع جميع الكسور الرئيسية استخدام جامع كسر الآلي بتطبيق تدرج من 5% إلى 100% المذيب ب أكثر من 25 دقيقة في 4 مل/دقيقة
  ملاحظة: (أ) المذيبات هو 0.1% هو تفا في الماء والمذيبات ب 0.1% تفا في الاسيتو الانيتريل ⁵².
2. رصد chromatogram 220 نانومتر، جمع قمم مناسبة، وتحليل استخدام LC-السيدة
تأكيد النقاء بعكس التحليلي المرحلة العالية الضغط السائل اللوني (أوبلك) 220 نانومتر بالرصد مع جهاز "كشف الأشعة فوق البنفسجية" أثناء مروره العينة من خلال عمود C18 تحليلية (حبة حجم 1.7 ميكرومتر). تأكيد المنتج الببتيد بواسطة الكتلي.
ملاحظة: يقترن في أوبلك إلى اليكتروسبراي التأين الكتلي (أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد) و "كشف الرباعي جنبا إلى جنب".
ليوفيليزي الصحيح كسور الببتيد المرجوة في قارورة قاع جولة، بتطبيق فراغ من 0.052 [مبر]، على شكل مسحوق رقيق. زوجان مضخة فراغ لوحدة تجميد للاحتفاظ في مخزن ° C.-78 في-80 درجة مئوية، إلى أجل غير مسمى-
استخدام الببتيد المجففة بالتبريد لتحضير حلاً أسهم من 1 ملم في خليط من الاسيتو الانيتريل: DMF: المياه المرتبة التحليلية في 1:1:1 للتجارب. ويمكن تخزين هذا الحل لمدة 6 أشهر على الأقل، كما لا تجميع الببتيدات في هذا الحل-

2. إعداد "الخليط حقن"

إعداد المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS) (كلوريد الصوديوم، 2.7 مم بوكل، 10 مم نا ₂ هبو ₄، 2 مم خ ₂ ص ₄، ودرجة الحموضة 7.4 ملم 137) لتمييع الببتيدات المجففة بالتبريد.
حل الببتيد بتركيز نهائي من 20 ميكرومتر في برنامج تلفزيوني. إعداد هذا الحل الطازجة. يخلط جيدا وتخزينها على الجليد حتى الحقن. لا تتجاوز 30 دقيقة لمنع التراكم في الحل-

3. التخدير

تحضير الحل الأسهم من المسكنات، 0.1% إيثيل-m-أمينوبينزواتي ميثانيسولفوناتي (ميساب)، في المياه الأسماك العادية من تعميم النظام. إعداد حل التنويم بتركيز نهائي 0.0025% (v/v)-
إزالة العدد المطلوب من الأسماك من دباباتهم في حاوية نقل مع 5 لتر الماء النظام.
النصف-التعبئة بلاستيكية طبق بتري (90 ملم) مع 40 مل المسكنات. استخدم هذا الطبق لحقن.
احتضان السمك في المسكنات حتى توقف حركة أوبيركولار-

4. Microinjection سيريبروفينتريكولار

إعداد جهاز حقن
1. تحضير الزجاج حقن الشعيرات الدموية باستخدام ساحبة إبرة مع المعلمات التالية: تدفئة دورة، 537؛ سحب دورة، 250؛ والسرعة، 1.5 s; الوقت، والسيدة 80
2. جلب إعداد الضغط على مصدر الضغط إلى 25 رطل/بوصة مربعة.
3. تعيين المعلمات ميكروينجيكتور على ما يلي: إجراء ضغط 20 رطل/بوصة مربعة؛ وإخراج الضغط 10 psi؛ قيمة فترة 2.5 النابضة القيمة 100 السيدة
4. الشعرية الزجاج مع الحل الحقن. إدراج حامل microinjection الشعرية الزجاج. ضبط زاوية الحقن إلى 45°.
  ملاحظة: يمكن بروتوكولات أكثر تفصيلاً كما هو موضح في مراجع ²⁷ ^، ⁴⁶-
الأسماك مكان واحد في طبق بتري جديدة مليئة بالحل التنويم (كما هو الحال في الخطوة 3، 3)-
عقد الأسماك بالملقط والمشرق لحقن.
توليد شق استخدام تلميح إبرة ز 30 في الجمجمة عبر tectum الألياف البصرية حيث تلتقي الألواح الجانبية اثنين. لا تقم بإدراج التلميح إلى أنسجة المخ، ويسبب هذا النزيف والأضرار. انظر مراجع ²⁷ ^، ^، من ⁴⁵ ⁴⁶ تفاصيل إضافية-
إدراج الشعرية الزجاج في الشق. استخدام سوى غيض الإبرة
1. ولم تخترق أكثر من 1 مم من خلال الجمجمة. الحفاظ على الضغط الأسماك وإدراج غيض الزجاج الشعرية من خلال موقع شق.
2. توجيه غيض الزجاج الشعرية نحو تيلينسيفالون بزاوية 45 درجة. حقن 1 ميليلتر من الحل. تسارع شرط السائل فورا بعد الحقن.

5. استرداد

مكان الأسماك مرة أخرى إلى حاوية نقل حتى أنه يتعافى. توصيل الحاوية للمياه الأسماك المتداولة بشكل منتظم لضمان نوعية المياه الأمثل.
ملاحظة: ينبغي أن الانتعاش عادة 1 دقيقة. إذا كان الأمر يستغرق وقتاً أطول، الأسماك يجب أن يوضع في المسكنات لفترة أقصر (هذا يحتاج إلى أن يكون الأمثل بالمجرب).

6. إعداد الأنسجة وسيكتيونينج

الانتظار لفترة زمنية قبل التضحية بالسمك المطلوب.
ملاحظة: هذا يعتمد على مسألة تجريبية. يمكن رؤية ترسب اميلويد لها في أقرب وقت بعد حقن يوم 1-
التضحية الأسماك باستخدام الأسلوب المناسب تبعاً للقواعد الأخلاقية (مثلاً، علاج الأسماك مع 0.1 [م] مصعب)-
قص فتح الجمجمة أعلاه تكتم الألياف البصرية باستخدام فورسيب أشار في الجهة الظهرية، وتشريح الرأس فقط وراء الزعنفة الصدرية استخدام مشرط.
إصلاح رؤساء استخدام 2% بارافورمالدهيد (PFA) بين عشية وضحاها في 4 مل ° 3 استخدام جيم من منهاج عمل بيجين في الرأس في أنبوب بلاستيكي مع غطاء المسمار.
تنبيه: ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة عند التعامل مع منهاج عمل بيجين-
كريوبروتيكشن وديكالسيفيكيشن، تغسل الرؤساء ثلاث مرات في 0.1 متر العازلة الفوسفات (درجة الحموضة 7.4)، ثم تحويلها إلى حل الإيثيلين (يدتا) sucrose/20% 20% واحتضان بين عشية وضحاها في 4 ° C.
لتضمين الأنسجة إلى تقطيع الراتنج، تجميد الرؤوس في محلول السكروز gelatin/20% 7.5 ٪ في قوالب بلاستيكية علم الأنسجة على الثلج الجاف (حوالي 3-5 دقيقة لتجميد كتلة). تخزين العينات في-80 درجة مئوية، أو الاستمرار في الخطوة التالية (كريوسيكتيونينج)-
إلى الرؤساء إلى 12 ميكرومتر سميكة كريوسيكتيونس استخدام كريوستات ك وصف ²⁸ ^، ⁴². نقل كريوسيكشنز مباشرة على الشرائح الزجاجية وتخزينها في-20 درجة مئوية للاستخدام طويل الأجل-

7. تلوين المناعي والفحص المجهري

ملاحظة: جميع الخطوات حضانة في دائرة هوميديفيد. وتوجد جميع خطوات الغسيل لمدة 10 دقائق-

الجاف للفروع لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذوبان الجليد، يغسل الفروع مرتين في برنامج تلفزيوني ومرة في ببستكس (برنامج تلفزيوني مع 0.03% تريتون-X-100)-
إينكوباتي مع جسم الأولية (الأجسام المضادة-Aβ42؛ وتمييع 1: 500 في ببستكس) في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد اليوم، ويغسل مرة واحدة في برنامج تلفزيوني ومرتين في ببستكس-
احتضان الفروع مع جسم الثانوية (إلى جانب الأسفار الكشف، وتمييع 1: 500) جنبا إلى جنب مع DAPI (1 ميكروغرام/مل) في ببستكس ح 2 في درجة حرارة الغرفة-
يغسل ثلاث مرات في ببستكس. بعد الغسيل النهائي، جبل الشرائح مع ساترة استخدام 100 ميكروليتر 70% والغليسيرول.
الحصول على الصور الفلورية استخدام مجهر [كنفوكل] (على سبيل المثال مع الهدف 20 X PL APO N.A. 0.7 مع مجموعة الإثارة 488 وعامل تصفية خضراء قياسية؛ الشكل 2) ³⁹-

النتائج

[هبلك] كان يستخدم لتنقية الببتيد المركب وقد استخدمت الكتلي لتوصيف الببتيدات المنقي بيتا اميلويد. كانت ساخنة العمود [هبلك] إلى 50 درجة مئوية لتحسين فصل الببتيدات Aβ وجمعت جميع الكسور. تحديد الببتيد مركباً بشكل صحيح، أجرى التحليل الطيفي الشامل لجميع الكسور. تشروماتوجرام أوب...

Discussion

يمكن تعديل الببتيدات اميلويد لتشمل الاختلافات تسلسل أو العلامات المختلفة. على سبيل المثال، يمكن أن تتولد من ببتيد اميلويد مجمعة، ويمكن المسمى بواسطة العلامات الفلورية في ن-المحطة نهاية الببتيد الببتيدات أو معلم مع الناقل الببتيدات³⁹. وبالمثل، هو الببتيد الناقل في هذا البروت...

Disclosures

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

Acknowledgements

ودعمت هذا العمل دزني ورابطة هلمهولتز (VH-الحرس الوطني-1021)، الاتفاقية، تو درسدن (FZ-111، 043_261518)، و DFG (KI1524/6) (كورونا)؛ ومن رابطة لايبنتز (شهد-2011-الحكومي-2) والألمانية (بيوليثومورفي 03Z2E512) (Y.Z.). كما نود أن نشكر اولريكي هوفمان لتوليف الببتيد، و Asokan نانديني وبريج موراوالا تاناكا اللي للحصول على مساعدة أثناء تصوير هذا الإجراء.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fmoc-protected amino acids	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)		Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS)
N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU)	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)	RL-1030	Activator
Oxyma	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)	RL-1180	Racemization supressor
N,N-Diisopropylethylamine	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)	SOL-003	Base
Dimethylformamide	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)	SOL-004	Solvent
N-Methylmorpholine	Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany	A12158	Base
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT)	Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA)	157260 ALDRICH	Activator
Piperidine	MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)	822299	Fmoc deprotection reagent
Dichlormethane (DCM)	MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)	106050	Solvent
Formic acid (FA)	MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)	100264	Buffer component for HPLC
Trifluoroacetic acid (TFA)	MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)	808260	Clevage Mixture reagent
Triisopropylsilane(TIS)	MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)	233781 ALDRICH	Clevage Mixture reagent
Acetonitrile (for UPLC/LCMS)	Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH	34967-1L	Solvent
Acetonitrile (for HPLC)	VWR International Ltd, England	83639.320	Solvent
Diethylether	VWR International Ltd, England	23811.326	Solvent for peptide precipitation
Dithiotritol (DTT)	VWR International Ltd, England	0281-25G	Clevage Mixture reagent
TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin	Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany)	S30023	Solid phase for SPPS
Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters	Intavis AG (Cologne, Germany)	34.274	Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase
Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter	Sartorius Stedtim (Aubagne, France)	11806-50-N	Filteration of precipitated peptides
Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter	Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe	KC78.1	Pre-filteration for HPLC
Peptide Synthesizer	Intavis, Cologne, Germany	ResPep SL	Automated solid-phase peptide synthesizer
Water Alliance HPLC	Waters, Milford Massachusetts, USA	Waters 2998, Waters e2695	Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC)
PolymerX, bead size 10μm, 250x10 mm	Phenomenex Ltd. Germany	00G-4328-N0	Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column
Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter	EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA	LCPAK0001	Water purification system
Filtration Unit	Sartorius Stedtim (Aubagne, France)	16307	Filtration unit for peptide precipitation
UPLC Aquity with UV Detector	Waters, Milford Massachusetts, USA	M09UPA 664M	Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50x2.1 mm	Waters, Milford Massachusetts, USA	186002350	Analytical C18 column
ACQUITY TQ Detector	Waters, Milford Massachusetts, USA	QBB908	Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6	Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany	16706, 101542	Lyophilizer with vaccum pump
Paradigm plate reader	Beckman Coulter
MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate)	Sigma-Aldrich	A5040
Petri dishes	Sarstedt	821.472
Phosphate-buffered saline	Life Technologies, GIBCO	10010-056
Needle	Becton-Dickinson	305178
Dissecting microscope	Olympus, Leica, Zeiss	Varies with the manufacturer
Dumont Tweezers	World Precision Instruments	501985
Gillies Dissecting Forceps	World Precision Instruments	501265
Glass injection capillaries	World Precision Instruments	TWF10
PicoNozzle	World Precision Instruments	5430-12
Pneumatic PicoPump	World Precision Instruments	SYS-PV820
Ring illuminator; Ring Light Guide	Parkland Scientific	ILL-RLG
Cryostat	Leica	CM1950

References

LaFerla, F. M., Green, K. N. Animal models of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
Selkoe, D. J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev. 81 (2), 741-766 (2001).
Serpell, L. C. Alzheimer's amyloid fibrils: structure and assembly. Biochim Biophys Acta. 1502 (1), 16-30 (2000).
Beyreuther, K., Masters, C. L. Alzheimer's disease. The ins and outs of amyloid-beta. Nature. 389 (6652), 677-678 (1997).
Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120 (3), 885-890 (1984).
Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. Alzheimer's disease. Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).
Hardy, J. The amyloid hypothesis for Alzheimer's disease: a critical reappraisal. J Neurochem. 110 (4), 1129-1134 (2009).
McGowan, E., et al. Abeta42 is essential for parenchymal and vascular amyloid deposition in mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
Tincer, G., Mashkaryan, V., Bhattarai, P., Kizil, C. Neural stem/progenitor cells in Alzheimer's disease. Yale J Biol Med. 89 (1), 23-35 (2016).
Diotel, N., et al. Effects of estradiol in adult neurogenesis and brain repair in zebrafish. Horm Behav. 63 (2), 193-207 (2013).
Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223 (1-2), 131-147 (2013).
Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
Diotel, N., et al. Cxcr4 and Cxcl12 expression in radial glial cells of the brain of adult zebrafish. J Comp Neurol. 518 (24), 4855-4876 (2010).
Zupanc, G. K. Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the brain of teleost fish. J Physiol Paris. 102 (4-6), 357-373 (2008).
Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).
Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Dev Biol. 295 (1), 263-277 (2006).
Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
Santana, S., Rico, E. P., Burgos, J. S. Can zebrafish be used as animal model to study Alzheimer's disease?. Am J Neurodegener Dis. 1 (1), 32-48 (2012).
Newman, M., Verdile, G., Martins, R. N., Lardelli, M. Zebrafish as a tool in Alzheimer's disease research. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 346-352 (2010).
Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. J Clin Invest. 119 (5), 1382-1395 (2009).
Xi, Y., Noble, S., Ekker, M. Modeling neurodegeneration in zebrafish. Curr Neurol Neurosci Rep. 11 (3), 274-282 (2011).
Barbosa, J. S., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 348 (6236), 789-793 (2015).
Dray, N., et al. Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche. Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).
Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), e27395 (2011).
Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Methods Cell Biol. 100, 73-126 (2010).
Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), (2016).
Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Dis Model Mech. 5 (2), 200-209 (2012).
Fleisch, V. C., Fraser, B., Allison, W. T. Investigating regeneration and functional integration of CNS neurons: lessons from zebrafish genetics and other fish species. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 364-380 (2010).
Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).
Becker, T., et al. Readiness of zebrafish brain neurons to regenerate a spinal axon correlates with differential expression of specific cell recognition molecules. J Neurosci. 18 (15), 5789-5803 (1998).
Rothenaigner, I., et al. Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate. Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).
Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240 (9), 2221-2231 (2012).
Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
Bhattarai, P., et al. IL4/STAT6 signaling activates neural stem cell proliferation and neurogenesis upon Amyloid-β42 aggregation in adult zebrafish brain. Cell Reports. 17 (4), 941-948 (2016).
Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Kizil, C. Regeneration, Plasticity, and Induced Molecular Programs in Adult Zebrafish Brain. Biomed Res Int. , (2015).
Kizil, C., et al. The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain. Neural Dev. 7, 27 (2012).
Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Dev Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).
Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
Katz, S., et al. . Cell Rep. 17 (5), 1383-1398 (2016).
Kizil, C., et al. Efficient cargo delivery using a short cell-penetrating peptide in vertebrate brains. PLoS One. 10 (4), e0124073 (2015).
Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
Sewald, N., Jakubke, H. . Peptides: Chemistry and Biology. , (2009).
Beyer, I., et al. Solid-Phase Synthesis and Characterization of N-Terminally Elongated Abeta-3-x -Peptides. Chemistry. 22 (25), 8685-8693 (2016).
Zheng, Y., et al. Kinesin-1 inhibits the aggregation of amyloid-beta peptide as detected by fluorescence cross-correlation spectroscopy. FEBS Lett. 590 (7), 1028-1037 (2016).
Balducci, C., Forloni, G. In Vivo Application of Beta Amyloid Oligomers: a Simple Tool to Evaluate Mechanisms of Action and New Therapeutic Approaches. Curr Pharm Des. 20 (15), 2491-2505 (2013).
Schiffer, N. W., et al. Identification of anti-prion compounds as efficient inhibitors of polyglutamine protein aggregation in a zebrafish model. J Biol Chem. 282 (12), 9195-9203 (2007).
Wieduwild, R., Tsurkan, M., Chwalek, K., Murawala, P., Nowak, M., Freudenberg, U., Neinhuis, C., Werner, C., Zhang, Y. Minimal peptide motif for non-covalent peptide-heparin hydrogels. Journal of the American Chemical Society. 135 (8), 2919-2922 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

128 42 microinjection

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: