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  • matériels
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  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole décrit la synthèse, la caractérisation et injection de peptides de monomère amyloïde-β42 pour générer les toxicité amyloïde dans adult poisson zèbre à établir un modèle de la maladie d’Alzheimer, suivi d’analyses histologiques et détection de agrégations.

Résumé

La maladie d’Alzheimer (ma) est une maladie neurodégénérative quelle accumulation d’amyloïde toxique-β42 des peptides (Aβ42) mène à la dégénérescence synaptique, l’inflammation, la mort neuronale débilitante et déficits d’apprentissage. Les humains ne peut pas régénérer les neurones perdus dans le cas de l’AD en partie en raison de la capacité de prolifération réduite des cellules souches/progénitrices neurales (NSPC) et réduit la neurogenèse. Par conséquent, thérapies régénératives efficaces devraient également accroître la prolifération et neurogène de NSPC. Zebrafish (Danio rerio) est un organisme régénératrice, et nous pouvons apprendre les programmes moléculaires fondamentales avec laquelle nous pourrions concevoir approches thérapeutiques pour lutter contre les AD. Pour cette raison, la génération d’un modèle AD-comme chez le poisson zèbre était nécessaire. En utilisant notre méthodologie, nous pouvons introduire synthétiques dérivés du peptide Aβ42 avec capacité de pénétration tissulaire dans le cerveau adulte poisson-zèbre et analyser la pathologie de la maladie et la réponse régénératrice. L’avantage sur les méthodes existantes ou des modèles animaux est que ce poisson zèbre peut nous apprendre comment un cerveau vertébré peut régénérer naturellement et ainsi nous aider à traiter les maladies neurodégénératives humaines mieux en ciblant les NSPC endogène. Par conséquent, le modèle amyloïde-toxicité dans le cerveau du poisson-zèbre adulte peut ouvrir de nouvelles avenues pour la recherche dans le domaine des neurosciences et de la médecine clinique. En outre, l’exécution simple de cette méthode permet d’évaluation expérimentale rentable et efficace. Ce manuscrit décrit la synthèse et l’injection de peptides Aβ42 dans le cerveau du poisson-zèbre.

Introduction

AD est une maladie chronique caractérisée par la perte des neurones et de synapses dans le cortex cérébral1,2,3,4,5. Les caractéristiques neuropathologiques de la maladie classiques de publicité sont les dépôts de peptides amyloïdes et formation de la neurofibrillaire embrouillent (NFTs)6. Les plaques séniles, également connu sous le nom de plaques amyloïdes, sont composés de peptides amyloïdes-β (Aβ) qui forment des structures β-plissées dans le parenchyme de cerveau5. L’accumulation de Aβ42 dans Alzheimer joue un rôle critique et début dans la progression de la maladie. AD déclenche une cascade d’événements conduisant à la dysfonction synaptique, plasticité avec facultés affaiblies et perte neuronale7,8,9,10.

Le cerveau adulte des téléostéens poisson zèbre sert un excellent modèle pour étudier la régulation de la plasticité des cellules souches11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20 et diverses maladies dans le système nerveux central (CNS), y compris AD21,22,23 ,,24. Grâce à une vaste gamme de méthodes expérimentales disponibles19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, ces études sont informatifs et réalisable. Poisson zèbre peut reconstituer le CNS13,15,32,33,34,35,36,37, 38, en partie à l’aide de programmes moléculaires activés après la perte neuronale19,39,40,41,42,43, 44. Par conséquent, établissant un modèle de maladie neurodégénérative chez le poisson zèbre peut aider à poser des questions nouvelles concernant la biologie régénératrice de capacité et de cellules souches dans les cerveaux vertébrés.

Récemment, nous avons développé un modèle de toxicité amyloïde dans le cerveau du poisson-zèbre adulte en injectant synthétique Aβ42 peptides (tableau 1)39. Cette injection causé des phénotypes de neurodégénérescence réminiscent de la pathologie du cerveau humain (p. ex., la mort cellulaire, activation microgliale, dégénérescence synaptique et les déficits de mémoire), indiquant que poisson zèbre peut être utilisée pour susciter neurodégénérescence dans le cerveau du poisson-zèbre, Aβ42 peptides peuvent être détectées avec salissures immunohistochimiques et mécanismes moléculaires de la régénération chez le poisson zèbre adulte, que CNS peut être identifié39. Dans ce protocole, nous démontrons l’injection de synthétiques peptides amyloïdes dans le cerveau de poisson-zèbre à l’aide d’un cérébroventriculaire injection (CVMI) méthode27,39,45,46 pour imiter le dépôt amyloïde (Figure 1). CVMI propose une nouvelle façon d’offrir les peptides, qui agrègent à injection en tant que structures feuillet β et exercer une toxicité. Les peptides sont réparties uniformément dans tout le cerveau, en ciblant la zone ventriculaire le long de l' axe rostro-caudal ensemble45. En outre, cette méthode permet pour analyser la réponse morphologique et moléculaire de la NSPC dans le cerveau adulte poisson zèbre suite des inclusions amyloïdes. Ces études nous donnera un aperçu de la réparation du cerveau réussie chez les mammifères. Notre méthode peut être utilisée pour comprendre le mécanisme moléculaire nécessaire d’une réponse de régénération réussie après AD-comme des symptômes d’induire la reconstitution des neurones perdus et la récupération fonctionnelle.

Protocole

ce protocole est une procédure standard proposée par les orientations de l’UE (2010/63) et la société européenne pour les modèles de poissons en biologie et en médecine (EuFishBioMed) à Karlsruhe Institut de technologie (KIT). Toutes les méthodes décrites après ici ont été approuvés par la commission d’éthique (Landesdirektion Dresden ; le numéro TVV-52/2015).

1. préparation du Peptide Aβ42

  1. synthétiser des peptides (voir tableau 1) en utilisant la chimie standard 9-fluorénylméthoxycarbonyle (Fmoc) avec 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU) comme le réactif de couplage sur un synthétiseur de peptide de phase solide automatisé 52. L’ampleur de la synthèse est 100 µmol.
  2. Charger le synthétiseur de peptide automatisé avec 500 mg de la résine Fmoc-protégés comme la phase solide (capacité de chargement de 0,2 mmol/g). Charger les dissous Fmoc-protégé des acides aminés à une concentration de 0,5 M dans le volume nécessaire et calculé pour le synthétiseur respectif.
    Remarque : Les calculs sont effectués pour permettre l’accouplement de chaque acide aminé Fmoc-protégé deux fois avec un excès de 5 fois de chaque bloc de construction à la résine 47.
  3. Dissoudre les réactifs nécessaires pour la synthèse de peptide dans dimethlyformamide (DMF). Par exemple, préparer l’activateur, HBTU, à une concentration de 0,48 M, 45 % v/v N-méthylmorpholine (NMM) (la base) et 5 % v/v Anhydride acétique (le mélange de plafonnement) de plafonner les groupes aminés non-réagi.
  4. S’attacher tous les peptides de la résine en mélangeant constamment l’appui solide à l’aide d’un agitateur dans un mélange de clivage fraîchement préparé constitué d’acide trifluoroacétique (TFA) : Triisopropylsilane(TIS) : l’eau : le dithiothréitol (DTT) à 90 (v/v) : 5 (v/v) : 2.5 (v/v) : 2,5 (m/v), pour 4 h. utiliser 10 mL de la grille de synthèse de 100 µmol.
  5. Précipiter le produit clivé en ajoutant le mélange de clivage à l’éther diéthylique glacée 100 mL. Passer par une unité de filtration contenant un filtre de polytétrafluoroéthylène (PTFE) avec une taille de pores de 0,45 µm et laver avec de l’éther diéthylique glacée de 20 mL.
  6. Recueillir le peptide filtré de papier-filtre et dissoudre 100 mg de précipité peptide dans 5 mL d’eau désionisée distillée : acétonitrile au 1:1.
  7. Purifier par chromatographie liquide à haute pression phase inverse (CLHP) sur une HPLC semi-préparative équipé d’une colonne poreux polystyrène divinylbenzène de perle taille 10 µm.
    1. Préchauffer la colonne et maintenir à 50 ° C à l’aide d’une colonne de dispositif de chauffage. Collecter toutes les principales fractions à l’aide d’un collecteur de fraction automatisé en appliquant un dégradé de 5 % à 100 % de solvant B pendant 25 min à 4 mL/min.
      NOTE : A solvant est 0,1 % TFA dans l’eau et solvant B est 0,1 % TFA dans l’acétonitrile 52.
    2. Surveiller le chromatogramme à 220 nm, recueillir les sommets appropriés et d’analyser à l’aide de la LC-Mme
  8. Confirmer la pureté par analyse inverse la phase ultra-haute pression Liquid Chromatography (UPLC) à 220 nm en surveillant avec un détecteur UV en passant de l’échantillon à travers une colonne analytique de C18 (perle taille 1,7 µm). Confirmer le produit de peptide par spectrométrie de masse.
    Remarque : L’UPLC est couplée à une spectrométrie de masse d’ionisation par électrospray (ESI-MS) et le détecteur quadripolaire Tandem.
  9. Lyophiliser les fractions correctes du peptide désiré dans un ballon à fond rond, en appliquant un vide de 0,052 mbar, à une poudre pelucheuse. Coupler la pompe à vide sur une unité de congélation maintenue indéfiniment à-78 ° C. conserver à-80 ° C,.
  10. Utiliser le peptide lyophilisé pour préparer une solution de 1 mM dans un mélange d’acétonitrile : DMF : eau de pureté analytique au 1:1:1 pour les expériences. Cette solution peut être conservée pendant au moins 6 mois, comme les peptides ne s’agrègent pas dans cette solution.

2. Préparation de la bouillie d’Injection

  1. préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (137 mM NaCl, KCl, 2,7 mM 10 mM Na 2 HPO 4 mM 2 KH 2 PO 4, pH 7,4) pour diluer les peptides lyophilisés.
  2. Dissoudre le peptide à une concentration finale de 20 µM dans du PBS. Préparer cette solution douce. Bien mélanger et conserver sur la glace jusqu'à l’injection. Ne dépassez pas 30 min pour empêcher l’agrégation dans solution.

3. Anesthésie

système de
  1. préparer la solution mère des anesthésiques, 0,1 %-m-aminobenzoate d’éthyle méthanesulfonate d’éthyle (MESAB), dans l’eau poissons régulier de la circulation. Préparer la solution d’anesthésie à une concentration finale de 0,0025 % (v/v).
  2. Enlever le nombre désiré de poissons à leurs chars dans un conteneur de transport avec 5 L d’eau du système de.
  3. Demi-remplissez un plastique boîte de Pétri (90 mm) avec les anesthésiques de 40 mL. Utilisez ce plat pour les injections.
  4. Incuber les poissons dans les anesthésiques, jusqu'à ce que le mouvement operculaire a cessé.

4. Microinjection cérébroventriculaire

  1. préparation des appareils d’injection de
    1. préparer le verre capillaires de l’injection à l’aide d’un extracteur de l’aiguille avec les paramètres suivants : chauffage, cycle, 537 cycle, 250 ou vitesse, traction 1,5 s ; temps, Mme 80
    2. faire le réglage de la pression sur la source de pression 25psi.
    3. Définir les paramètres de microinjector à ce qui suit : cale 20 lb/po2 de pression, pression d’éjection 10 lb/po2 ; période valeur 2,5 ; gating valeur 100 m
    4. Charger le capillaire de verre avec la solution injectable. Insérez le capillaire de verre dans le support de microinjection. Régler l’angle d’injection à 45°.
      NOTE : Des protocoles plus détaillés peuvent être trouvés comme décrit dans références 27 , 46.
  2. Une poissons Place dans une autre boite de Petri rempli de la solution d’anesthésie (comme à l’étape 3.3).
  3. Tenir le poisson avec la pince et l’orient pour injection.
  4. Génèrent une fente à l’aide de la pointe d’une aiguille de 30 G dans le crâne sur le tectum optique où les deux plaques latérales se rencontrent. Ne pas insérer l’embout dans le tissu cérébral, cela causerait des saignements et des dommages. Voir références 27 , 45 , 46 pour plus de détails.
  5. Insérer le capillaire de verre dans le slit.
    1. Utiliser seulement la pointe de l’aiguille et ne pénètrent pas plus de 1 mm à travers le crâne. Garder tenant le poisson et introduire l’embout du verre capillaire à travers l’incision de.
    2. Orienter l’extrémité du verre capillaire vers le télencéphale à un angle de 45°. Injecter 1 µL de la solution. Le liquide se disperse immédiatement après l’injection.

5. Récupération

  1. replacer le poisson dans un conteneur de transport jusqu'à ce qu’il récupère. Raccorder le réservoir à l’eau de poisson circulant régulièrement pour assurer une qualité optimale de l’eau.
    NOTE : La reprise devrait normalement prendre 1 min. Si elle prend plus de temps, les poissons doivent être conservées sous les anesthésiques pendant une période plus courte (cela doit être optimisée par l’expérimentateur).

6. Préparation du tissu et sectionnement

  1. attendre un certain temps avant de sacrifier le poisson désiré.
    Remarque : Cela dépend de la question expérimentale. Les dépôts amyloïdes sont visibles dès le 1 jour après l’injection.
  2. Sacrifier le poisson à l’aide de la méthode appropriée selon les règlements éthiques (p. ex., traiter le poisson avec 0,1 M MESAB).
  3. Fend le crâne au-dessus de tectum optique à l’aide d’instrument pointu sur la face dorsale et disséquer la tête juste derrière les nageoires pectorales à l’aide d’un scalpel.
  4. Fixer les têtes à l’aide de 2 % de paraformaldéhyde (PFA) durant la nuit à 4 ° C. utiliser 3 mL de PFA par habitant dans un tube en plastique avec un couvercle à vis.
    ATTENTION : Porter l’équipement de protection individuelle approprié lorsque vous manipulez les PFA.
  5. Pour cryoprotection, décalcification, nettoyer les têtes de trois fois au 0,1 M tampon Phosphate (pH 7,4), puis transférez-les dans la solution d’EDTA (EDTA) sucrose/20% 20 % et incuber une nuit à 4 ° C.
  6. Pour incorporer le tissu en sectionnant la résine, congeler les têtes dans une solution de sucrose 7,5 % gelatin/20% dans des moules en plastique histologie sur la glace sèche (environ 3-5 min de geler un bloc). Stocker les échantillons à-80 ° C ou passez à l’étape suivante (cryosectioning).
  7. De l’article les têtes dans cryosections épais de 12 µm à l’aide d’un cryostat comme décrit 28 , 42. Transférer les cryosections directement sur lames de verre et conserver à-20 ° C pour une utilisation à long terme.

7. Microscopie et coloration immunohistochimique

Remarque : effectuez toutes les étapes d’incubation dans une chambre humidifiée. Et, toutes les étapes de lavage sont pour chaque 10 min.

  1. Sécher les sections pendant 30 min à température ambiante. Après décongélation, laver les sections deux fois dans du PBS et une fois dans PBSTx (PBS avec 0,03 % Triton-X-100).
  2. Incuber avec l’anticorps primaire (anticorps anti-Aβ42 ; dilution 1/500 en PBSTx) à 4 ° C pendant la nuit. suite de jour, laver une fois dans du PBS et deux fois dans PBSTx.
  3. Incuber les sections avec l’anticorps secondaire (détection de fluorescence couplés, dilution de 1/500) ainsi que de DAPI (1 μg/mL) en PBSTx pendant 2 h à température ambiante.
  4. Laver trois fois à PBSTx. Après le lavage final, monter les lames avec un lamelle couvre-objet à l’aide de glycérol de 70 % 100 μL.
  5. Acquérir les images fluorescents à l’aide d’un microscope confocal (par exemple avec l’objectif 20 X PL APO N.A. 0,7 avec 488 gamme d’excitation et d’un filtre vert standard ; la figure 2) 39.

Résultats

HPLC servait à purifier le peptide synthétisé et spectrométrie de masse a été utilisée pour caractériser les peptides purifié β-amyloïde. La colonne HPLC a été chauffée à 50 ° C afin d’améliorer la séparation des peptides bêta-amyloïdes, et toutes les fractions ont été recueillies. Pour identifier le peptide synthétisé correctement, analyse de spectrométrie de masse a été réalisée pour toutes les fractions. Le chromatogramme UPLC montre la pureté du compos?...

Discussion

Les peptides amyloïdes peuvent être modifiés pour inclure les variations de séquence ou les différentes balises. Par exemple, un peptide bêta-amyloïde brouillé peut être généré, et les peptides peuvent être marqués avec des étiquettes fluorescentes à la N-terminale de la fin de peptide ou transporteur peptides39le tag. De même, dans le présent protocole, le peptide de transporteur est la pénétration cellulaire peptide TR en raison de son efficacité pour transport marchandise p...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le DZNE et l’Association Helmholtz (VH-NG-1021), CRDT, TU Dresden (FZ-111, 043_261518) et Dia (KI1524/6) (C.K.) ; et par la Communauté Leibniz (scie-2011-gif-2) et le BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). Nous tenons également à remercier Ulrike Hofmann pour la synthèse de peptide et à Nandini Asokan et Prayag Murawala Elly Tanaka pour aide pendant le tournage de la procédure.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Fmoc-protected amino acidsIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS)
N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU)IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)RL-1030Activator
OxymaIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)RL-1180Racemization supressor
N,N-DiisopropylethylamineIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)SOL-003Base
DimethylformamideIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)SOL-004Solvent
N-MethylmorpholineThermo Fisher (Kandel) GmbH, GermanyA12158Base
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT)Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA)157260 ALDRICHActivator
PiperidineMERCK KGaA (Darmstadt, Germany)822299Fmoc deprotection reagent
Dichlormethane (DCM)MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)106050Solvent
Formic acid (FA)MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)100264Buffer component for HPLC
Trifluoroacetic acid (TFA)MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)808260Clevage Mixture reagent
Triisopropylsilane(TIS)MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)233781 ALDRICHClevage Mixture reagent
Acetonitrile (for UPLC/LCMS)Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH34967-1LSolvent
Acetonitrile (for HPLC)VWR International Ltd, England83639.320Solvent
DiethyletherVWR International Ltd, England23811.326Solvent for peptide precipitation
Dithiotritol (DTT)VWR International Ltd, England0281-25GClevage Mixture reagent
TentaGel S RAM Fmoc rink amide resinRapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany)S30023Solid phase for SPPS
Peptide synthesis 5 ml syringes with included filtersIntavis AG (Cologne, Germany)34.274Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase
Polytetrafluoroethylene (PTFE) filterSartorius Stedtim (Aubagne, France)11806-50-NFilteration of precipitated peptides
Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filterCarl Roth GmbH + Co. KG KarlsruheKC78.1Pre-filteration for HPLC
Peptide SynthesizerIntavis, Cologne, GermanyResPep SLAutomated solid-phase peptide synthesizer
Water Alliance HPLCWaters, Milford Massachusetts, USAWaters 2998, Waters e2695Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC)
PolymerX, bead size 10μm, 250x10 mmPhenomenex Ltd. Germany00G-4328-N0Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column
Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filterEMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USALCPAK0001Water purification system
Filtration UnitSartorius Stedtim (Aubagne, France)16307Filtration unit for peptide precipitation
UPLC Aquity with UV DetectorWaters, Milford Massachusetts, USAM09UPA 664MAnalytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50x2.1 mmWaters, Milford Massachusetts, USA186002350Analytical C18 column
ACQUITY TQ DetectorWaters, Milford Massachusetts, USAQBB908Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany16706, 101542Lyophilizer with vaccum pump
Paradigm plate readerBeckman Coulter
MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate)Sigma-AldrichA5040
Petri dishesSarstedt821.472
Phosphate-buffered salineLife Technologies, GIBCO10010-056
NeedleBecton-Dickinson305178
Dissecting microscopeOlympus, Leica, ZeissVaries with the manufacturer
Dumont TweezersWorld Precision Instruments501985
Gillies Dissecting ForcepsWorld Precision Instruments501265
Glass injection capillariesWorld Precision InstrumentsTWF10
PicoNozzleWorld Precision Instruments5430-12
Pneumatic PicoPumpWorld Precision InstrumentsSYS-PV820
Ring illuminator; Ring Light GuideParkland ScientificILL-RLG
CryostatLeicaCM1950

Références

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