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要約

このプロトコルは、合成と性質、組織学的解析および検出に続いてアルツハイマー病モデルを確立する大人のゼブラフィッシュでアミロイド毒性を生成する単量体のアミロイド β42 ペプチドの注入について説明します。集計。

要約

アルツハイマー病 (AD) は毒性アミロイド-β42 の積み重ねで (Aβ42) ペプチドはシナプス変性、炎症、神経細胞の死につながる神経変性疾患を衰弱させると学習障害。人間は、神経幹細胞/前駆細胞 (NSPCs) および減らされた神経の増殖能力の障害のため一部広告の場合失われた神経細胞を再生できません。したがって、効率的な再生治療は、増殖を高める必要がありますもと NSPCs。 ゼブラフィッシュ (動脈分布) の神経因性の能力は再生の有機体、設計できるかを基本的な分子プログラムを学ぶことができます。広告に取り組むために治療のアプローチ。このため、ゼブラフィッシュの広告のようなモデルの生成が必要でした。私たちの方法論を使用して、組織の透過能力を持つ大人ゼブラフィッシュ脳に Aβ42 ペプチドの合成誘導体を導入し、病の病理と再生の応答を分析できます。既存のメソッドまたは動物モデル上の利点は、ゼブラフィッシュはどの脊椎動物の脳を自然に再生成でき、したがって内因性の NSPCs より良い人間神経変性疾患の治療に役立つ私たちを教えることができます。したがって、大人ゼブラフィッシュ脳にアミロイド毒性モデルは神経科学と臨床医学の分野で研究のための新しい道を開く可能性があります。また、このメソッドの単純な実行は、コスト効果の高い、効率的な実験的評価できます。本稿では、合成とゼブラフィッシュ脳への Aβ42 ペプチドの注入をについて説明します。

概要

広告は、ニューロンの損失によって特徴付けられる慢性の進行性疾患で大脳皮質1,2,3,4、5のシナプスします。広告の古典的な神経病理学的特徴アミロイドペプチドの成膜であり、原線維変化の形成のもつれ (Nft)6。老人斑、アミロイド斑とも呼ばれますは、脳実質5β プリーツ構造を形成するアミロイド β (a β) ペプチドで構成されます。AD 患者における Aβ42 の蓄積には、病気の進行の早期かつ重要な役割があります。広告は、シナプスの機能障害、障害の可塑性と神経細胞の損失7,8,9,10につながるイベントの連鎖をトリガーします。

魚類ゼブラフィッシュ成体脳研究幹細胞の可塑性11,12,13,14,15,の調節に優れたモデルとして16,17,18,19、20広告21,22,23 を含む中枢神経系 (CNS) におけるさまざまな病気 ,24。利用可能な実験方法19,20,25,26,27,28,29,の広大な配列のため30,31, これらの研究は有益であり、実現可能です。ゼブラフィッシュ中枢神経系13,15,32,33,34,35,36,37を補充することが 38, 神経細胞の損失19,39,40,41,42,43後、活性化分子のプログラムを使用しての一部 44。したがって、ゼブラフィッシュ神経変性疾患モデルの確立は、脊椎動物の脳の再生能力と幹細胞生物学に関する新規質問に対処を助けることができます。

最近では、合成 Aβ42 ペプチド (表 1)39を注入することによって成人脳のアミロイド毒性モデルを開発しました。この注射原因神経変性疾患表現型 (例えば, 細胞死、ミクログリア活性化、シナプス変性および記憶障害)、人間の脳の病理を彷彿を惹起するため、ゼブラフィッシュを使用ことができますを示すゼブラフィッシュ脳の神経変性、ペプチドを免疫組織化学的染色と大人ゼブラフィッシュ中枢神経系がすることができます再生の分子機構検出できる Aβ42 には、39が識別されます。このプロトコルを示す cerebroventricular (CVMI) の注入法27,39,45,46を用いたゼブラフィッシュ脳にアミロイド ペプチドの注入アミロイド沈着 (図 1) を模倣します。CVMI では、β シート構造として射出時に集約し、毒性を発揮するペプチドを提供する斬新な方法を提供します。ペプチドは、心室全体の吻尾軸45沿線をターゲット、脳全体均等に配布されます。さらに、このメソッドは、大人ゼブラフィッシュ脳アミロイドの包有物の NSPCs の形態学的および分子応答を解析できます。このような研究は私たち哺乳類で成功脳修復のため、洞察を提供します。本手法は、失われたニューロンと機能回復の補充を誘導する広告のような症状の後再生が成功応答の必要な分子機構を理解する使用できます。

プロトコル

この議定書、EU ガイドラインによって提案された標準的な手順 (2010/63) と生物学および薬 (EuFishBioMed) でカールスルーエ研究所の技術 (キット) の魚モデルのヨーロッパの社会。後、ここに記載されているすべてのメソッド (Landesdirektion ドレスデン; 文書番号 TVV-52/2015 年) 倫理委員会によって承認されました

。

1 です Aβ42 ペプチド作製

  1. 合成ペプチド (表 1 参照) 標準的な 9-fluorenylmethoxycarbonyl (fmoc 保護) 化学を用いた 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-。自動固相ペプチド合成 52 結合試薬として tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU)。合成スケールは 100 µmol です
    2. 。
  2. は、(積載量 0.2 モル/g の) 固相として 500 mg fmoc 保護保護樹脂の自動ペプチド合成装置をロードします。溶存 fmoc 保護保護アミノ酸濃度 0.5 M を読み込む必要なボリュームとそれぞれのシンセサイザーの計算
    。 注: 計算が 2 回と 5 回過剰樹脂 47 各ビルディング ブロックの各 fmoc 保護保護アミノ酸の結合を有効にするのに作られています
    3. 。
  3. は、dimethlyformamide (DMF) のペプチド合成のための必須の試薬を溶解します。たとえば、非反応したアミノ基をキャップに 0.48 M、45 %v/v N メチルモルホリン (NMM) (ベース) と 5 %v/v 無水酢酸 (キャップの混合物) の濃度で HBTU、アクティベーターを準備します
    4. 。
  4. 切断はトリフルオロ酢酸 (TFA) から成る作りたて胸の谷間混合撹拌装置を使用して固体のサポートを継続的に混合することによって樹脂からすべてのペプチド: Triisopropylsilane(TIS): 水: ジチオトレイトール (DTT) 90 (v/v): 5 (v/v): 2.5(v/v): 2.5 (m/v)、4 h の 100 µmol の合成スケールの 10 mL を使用します
    5. 。
  5. 100 mL 冷たいジエチル エーテルを胸の谷間の混合物を追加することによって裂かれた製品の沈殿物します。孔径 0.45 μ m のポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) フィルターおよび 20 mL 冷たいジエチル エーテルで洗浄を含むろ過装置を通過します
    6. 。
  6. フィルター ペーパーからフィルター処理されたペプチドを収集し、ディゾルブ 100 mg 5 mL で沈殿したペプチドの脱イオン蒸留水: 1:1 でアセトニ トリル
    7. 。
  7. 逆相高速液体クロマトグラフィー (HPLC) ビード サイズ 10 μ m の多孔質ポリスチレン ジビニル ベンゼン列装備セミ分取 HPLC のを介して浄化。
    1. は予熱して列および 50 ° c 加熱装置列を使用して管理します。5% から 100% 溶剤 B 4 mL/分で 25 分以上にグラデーションを適用することにより、自動化された分数のコレクターを使用してすべての主要な画分を収集
      注意: 溶剤 A、0.1% 水と溶剤 B で TFA は 0.1% アセトニ トリル 52 TFA
      2. 。
    2. 220 でクロマト グラムを監視 nm、適切なピークを収集し、分析 LC さんを使用して
  8. 確認分析をリバースで純度相の超高圧液体クロマトグラフィー (高精度) 220 nm UV 検出器を用いた分析の C18 カラム (ビード サイズ 1.7 μ m) を通して試料を通過しながら監視することによって。質量分析法によるペプチド製品を確認します
    。 注: 高精度は、エレクトロ スプレー イオン化質量分析法 (MS) とタンデム四重極検出器に結合されています
    9. 。
  9. では、丸底フラスコで目的のペプチドの正しい端数を凍乾ふわふわ粉によう 0.052 mbar の真空を適用することによって。-80 ° c-78 ° C 店で無期限に保持される凍結単位に真空ポンプをカップルします
    10. 。
  10. アセトニ トリル混合物の 1 mM のストック溶液を調製する凍結乾燥のペプチドを使用して: DMF: 1 で分析グレード水: 実験のための 1:1。ペプチドは、このソリューションでは集約されていないと、少なくとも 6 ヶ月間このソリューションを格納できます
    11. 。

2。注入混合物の調製

  1. 希釈凍結乾燥ペプチドのリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (137 mM NaCl、KCl、2.7 mM 10 mM ナ 2 HPO 4、2 mM KH 2 PO 4、pH 7.4) を準備します
    2. 。
  2. は、PBS で 20 μ M の最終的な集中にペプチドを溶解します。このソリューションの新鮮なを準備します。よく混合し、注入まで氷の上保存します。ソリューションでの凝集を防ぐために 30 分を超えないようにします
    3. 。

3。麻酔

  1. 準備麻酔薬、循環から定期的な魚水に 0.1% アミノ安息香酸エチル m アミロー スパン (MESAB) の原液システム。0.0025% (v/v) の最終的な集中に anaesthetization ソリューションを準備します
    2. 。
  2. システム水の 5 リットルのコンテナー輸送にタンクから魚の数を削除します
    3. 。
  3. 半分埋めるプラスチック シャーレ (90 mm) 40 mL 麻酔薬と。注射のためこのお皿を使っています
    4. 。
  4. まで蓋の動きが停止している麻酔薬で魚をインキュベートします
    5. 。

4。Cerebroventricular マイクロインジェクション

  1. 噴射装置の準備
    1. 準備ガラス注入毛細血管針引き手を使用して、次のパラメーターで: 加熱サイクル、537 のサイクル、250; 速度の引き1.5 s;時間、80 さん
    2. 25 psi に圧力源の圧力設定をもたらすします
      3. 。
    3. マイクロインジェクター パラメーターを下記に設定: ホールド 20 psi の圧力; 圧力を取り出し 10 psi; 期間値 2.5 ゲート値 100 さん
    4. は、注射液がガラス管をロードします。インジェクション ホルダーにガラス管を挿入します。45 ° 噴射角度を調整します
      。 注: 参照 27 , 46 で説明されているように詳細なプロトコルが発見ことができます
      5. 。
  2. (ステップ 3.3) のように anaesthetization ソリューションで新しいペトリ皿に場所 1 つの魚いっぱい
    3. 。
  3. 鉗子、注射用オリエントで魚を保持します
    4. 。
  4. は、2 つの外側のプレートが交わる視蓋に頭蓋骨の 30 G 針の先端を使ってスリットを生成します。脳組織に先端を挿入しないでください、これが原因で出血や損傷。 27 , 45 , 46 詳細を参照を参照してください
    5. 。
  5. スリットにガラス管を挿入します。
    1. は、針の先端だけを使用し、頭蓋骨を 1 mm 以上に浸透しません。魚を押さえておくし、切開サイトを通じてガラスキャピラリ先端を挿入します
      2. 。
    2. は、ガラスに向けて 45 ° の角度で終脳管の先端を合わせます。ソリューションの 1 μ L を注入します。注射後すぐに液体分散します
      3. 。

5。回復

  1. 魚は、それが回復するまで輸送コンテナーに戻る場所。最適な水質を確保するため定期的に循環の魚の水にコンテナーを接続します
    。 注: 回復通常 1 分を取る必要があります。(これは実験者によって最適化が必要) 短時間麻酔で魚を保管しなければならない時間がかかっている場合
    2. 。

6。ティッシュの準備と押します

  1. 魚を犠牲にする前に、必要な期間待機します
    。 注: これは実験の質問に依存します。アミロイドの沈着は注射後 1 日も早く見ることができる
    2. 。
  2. 倫理的な規則に応じて適切なメソッドを使用して魚を犠牲に (例えば、0.1 M MESAB で魚を扱う).
  3. 背側では、先の尖った鉗子を使用して視蓋の上の頭蓋骨を開いてカットし、解剖頭だけ後ろにメスの胸びれ
    4. 。
  4. 修正 2% パラホルムアルデヒド (PFA) を使用してヘッド一晩でプラスチック製のチューブで当たり PFA の 4 ° c. の使用 3 mL ネジ蓋で
    。 注意: 適切な個人用保護具を着用は、PFA を処理するときです
    5. 。
  5. に対する凍害保護作用と脱灰、0.1 M で三度頭を洗うためリン酸バッファー (pH 7.4) 20 %sucrose/20% エチレンジアミン (EDTA) ソリューションにそれらを転送し、4 で一晩インキュベート ° C
  6. 樹脂の断面にティッシュを埋め込むことでドライアイス (ブロックを固定するのには約 3-5 分) 組織学プラスチック金型 gelatin/20% 7.5% ショ糖液でヘッドを固定します。-80 ° c のサンプルを格納または (cryosectioning) の次の手順に進みます
    7. 。
  7. として記述されている 28 , 42 クライオスタットを用いた 12 μ m 厚い凍結切片にヘッドをセクションします。スライド ガラスに直接凍結切片を転送し、長期的な使用のための-20 ° C で保存します
    8. 。

7。免疫組織化学染色と顕微鏡

注: 加湿チャンバー内でインキュベーションのすべての手順を実行します。すべての洗浄手順は、各 10 分

。
  1. 乾燥室温で 30 分間のセクション。解凍後、PBS で 2 回、PBSTx セクションを洗う (0.03% と PBS トリトン X 100).
  2. で 4 ° C 一晩一次抗体 (抗 Aβ42 抗体; PBSTx の 1: 500 希釈) と加温の翌日、洗って一度 PBS と 2 回 PBSTx です。
    3. 。
  3. DAPI と共に二次抗体 (蛍光結合検出、1: 500 希釈) とセクションを孵化させなさい (1 μ g/mL) 室温で 2 時間 PBSTx で
    4. 。
  4. PBSTx で 3 回洗う。最終洗浄後 100 μ L 70% グリセロールを使用して coverslip のスライドをマウントします
    5. 。
  5. (たとえば、488 励起範囲で 20 X PL APO エヌ 0.7 客観的かつ標準的な緑フィルター共焦点顕微鏡を用いた取得蛍光画像 図 2) 39.

結果

合成ペプチドを浄化するために使用された高速液体クロマトグラフィーと質量分析法は、精製したアミロイド β ペプチドの特徴に使用されています。A β ペプチドの分離を改善するために 50 ° C に加熱した HPLC カラムとすべての画分を採取しました。正しく合成ペプチドを識別するには、すべての画分の質量分析を行った。高精度のクロマト グラムは、化合物の純度...

ディスカッション

アミロイド ペプチドは、変異またはさまざまなタグを含めるに変更できます。例えば、スクランブル アミロイド ペプチドを生成することができますとペプチドの N 末端ペプチド最後の蛍光タグでラベルまたはキャリア ペプチド39が付いたできます。同様に、このプロトコルでは、キャリアのペプチドは、細胞浸透性ペプチド TR 深い輸送貨物に有効性のために脳組織

開示事項

著者がある何も開示するには

謝辞

この作品は、DZNE とヘルムホルツ協会 (VH-NG-1021)、CRTD、によって支持されたドレスデン工科大学 (FZ 111、043_261518) と DFG (KI1524/6) (c. k.);ライプニッツ学術連合 (SAW-2011 IPF-2) と BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) で、(Y.Z.)。我々 も感謝したいウルリケ ・ ホフマン ペプチド合成用とナンディニ アショーカ、Prayag Murawala エリー田中については手順を撮影中。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Fmoc-protected amino acidsIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS)
N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU)IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)RL-1030Activator
OxymaIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)RL-1180Racemization supressor
N,N-DiisopropylethylamineIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)SOL-003Base
DimethylformamideIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)SOL-004Solvent
N-MethylmorpholineThermo Fisher (Kandel) GmbH, GermanyA12158Base
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT)Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA)157260 ALDRICHActivator
PiperidineMERCK KGaA (Darmstadt, Germany)822299Fmoc deprotection reagent
Dichlormethane (DCM)MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)106050Solvent
Formic acid (FA)MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)100264Buffer component for HPLC
Trifluoroacetic acid (TFA)MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)808260Clevage Mixture reagent
Triisopropylsilane(TIS)MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)233781 ALDRICHClevage Mixture reagent
Acetonitrile (for UPLC/LCMS)Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH34967-1LSolvent
Acetonitrile (for HPLC)VWR International Ltd, England83639.320Solvent
DiethyletherVWR International Ltd, England23811.326Solvent for peptide precipitation
Dithiotritol (DTT)VWR International Ltd, England0281-25GClevage Mixture reagent
TentaGel S RAM Fmoc rink amide resinRapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany)S30023Solid phase for SPPS
Peptide synthesis 5 ml syringes with included filtersIntavis AG (Cologne, Germany)34.274Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase
Polytetrafluoroethylene (PTFE) filterSartorius Stedtim (Aubagne, France)11806-50-NFilteration of precipitated peptides
Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filterCarl Roth GmbH + Co. KG KarlsruheKC78.1Pre-filteration for HPLC
Peptide SynthesizerIntavis, Cologne, GermanyResPep SLAutomated solid-phase peptide synthesizer
Water Alliance HPLCWaters, Milford Massachusetts, USAWaters 2998, Waters e2695Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC)
PolymerX, bead size 10μm, 250x10 mmPhenomenex Ltd. Germany00G-4328-N0Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column
Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filterEMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USALCPAK0001Water purification system
Filtration UnitSartorius Stedtim (Aubagne, France)16307Filtration unit for peptide precipitation
UPLC Aquity with UV DetectorWaters, Milford Massachusetts, USAM09UPA 664MAnalytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50x2.1 mmWaters, Milford Massachusetts, USA186002350Analytical C18 column
ACQUITY TQ DetectorWaters, Milford Massachusetts, USAQBB908Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany16706, 101542Lyophilizer with vaccum pump
Paradigm plate readerBeckman Coulter
MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate)Sigma-AldrichA5040
Petri dishesSarstedt821.472
Phosphate-buffered salineLife Technologies, GIBCO10010-056
NeedleBecton-Dickinson305178
Dissecting microscopeOlympus, Leica, ZeissVaries with the manufacturer
Dumont TweezersWorld Precision Instruments501985
Gillies Dissecting ForcepsWorld Precision Instruments501265
Glass injection capillariesWorld Precision InstrumentsTWF10
PicoNozzleWorld Precision Instruments5430-12
Pneumatic PicoPumpWorld Precision InstrumentsSYS-PV820
Ring illuminator; Ring Light GuideParkland ScientificILL-RLG
CryostatLeicaCM1950

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