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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo descrive la sintesi, la caratterizzazione e l'iniezione dei peptidi monomerici amiloide-β42 per la generazione di tossicità dell'amiloide in zebrafish adulto per stabilire un modello di malattia di Alzheimer, seguito da analisi istologiche e rilevazione di aggregazioni.

Abstract

Morbo di Alzheimer (annuncio) è una malattia neurodegenerative in cui accumulo di amiloide tossico-β42 (Aβ42) peptidi conduce a degenerazione sinaptica, infiammazione, morte di un neurone debilitante e deficit dell'apprendimento. Gli esseri umani non possono rigenerare i neuroni persi nel caso di annuncio in parte a causa di alterata capacità proliferativa delle cellule staminali/progenitrici neurali (NSPCs) e ridotta neurogenesi. Di conseguenza, terapie rigenerative efficiente dovrebbero anche migliorare la proliferazione e neurogena capacità di NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) è un organismo rigenerativo, e possiamo imparare i programmi base molecolari con cui potremmo progettare approcci terapeutici per affrontare AD. Per questo motivo, la generazione di un modello di annuncio-come in zebrafish era necessaria. Utilizzando la nostra metodologia, possiamo introdurre derivati sintetici di Aβ42 peptide con capacità penetrante di tessuto nel cervello adulto zebrafish e analizzare la patologia della malattia e della risposta rigenerativa. Il vantaggio sopra i metodi esistenti o modelli animali è che zebrafish può insegnarci come un cervello dei vertebrati può rigenerare naturalmente e quindi ci aiutano a curare le malattie neurodegenerative umana meglio prendendo di mira NSPCs endogeno. Pertanto, il modello di tossicità dell'amiloide stabilito nel cervello adulto zebrafish può aprire nuove strade per la ricerca nel campo delle neuroscienze e della medicina clinica. Inoltre, la semplice esecuzione di questo metodo consente conveniente ed efficiente valutazione sperimentale. Questo manoscritto descrive la sintesi e l'iniezione di Aβ42 peptidi nel cervello di zebrafish.

Introduzione

Annuncio è una malattia cronica progressiva caratterizzata dalla perdita di neuroni e sinapsi in corteccia cerebrale1,2,3,4,5. I marchi di garanzia neuropathological classiche dell'annuncio sono la deposizione dei peptidi amiloidi e formazione del neurofibrillary tangles (NFTs)6. Le placche senili, noto anche come placche amiloidi, sono composti da peptidi dell'amiloide-β (Aβ) che formano strutture β-pieghettato in parenchima del cervello5. L'accumulo di Aβ42 nei pazienti dell'annuncio ha un ruolo critico e primo in progressione di malattia. Annuncio innesca una cascata di eventi che conducono alla disfunzione sinaptica, plasticità alterata e perdita di un neurone7,8,9,10.

Il cervello adulto di teleostei zebrafish serve come un eccellente modello per studiare la regolazione della plasticità delle cellule staminali11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20 e varie malattie nel sistema nervoso centrale (CNS), tra cui annuncio21,22,23 ,24. A causa di una vasta gamma di metodi sperimentali disponibili19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, questi studi sono informativi e fattibile. Zebrafish può ricostituire il CNS13,15,32,33,34,35,36,37, 38, in parte utilizzando programmi molecolari attivati dopo la perdita di un neurone19,39,40,41,42,43, 44. Quindi, che stabilisce un modello di malattia neurodegenerative in zebrafish può aiutare a affrontare le questioni romanzo per quanto riguarda biologia rigenerativa di capacità e di cellule staminali nel cervello dei vertebrati.

Recentemente, abbiamo sviluppato un modello di tossicità dell'amiloide nel cervello adulto zebrafish iniettando sintetico Aβ42 peptidi (tabella 1)39. Questa iniezione causato neurodegenerazione fenotipi ricordano la patologia del cervello umano (ad esempio, la morte delle cellule, l'attivazione microgliale, degenerazione sinaptica e i deficit di memoria), che indica che zebrafish può essere utilizzato per suscitare neurodegenerazione nel cervello di zebrafish, Aβ42 peptidi possono essere rilevati con gli stainings di immunohistochemical e meccanismi molecolari della rigenerazione in zebrafish adulto che CNS può essere identificato39. In questo protocollo, dimostriamo l'iniezione di peptidi sintetici dell'amiloide nel cervello zebrafish utilizzando un intracerebroventricolare iniezione (CVMI) metodo27,39,45,46 per imitare il deposito dell'amiloide (Figura 1). CVMI fornisce un nuovo modo di erogare i peptidi, che aggregano all'iniezione come β-foglio strutture ed esercitano tossicità. I peptidi sono distribuiti uniformemente in tutto il cervello, come target l'area ventricolare lungo l'intero asse rostro-caudale45. Inoltre, questo metodo consente per analizzare la risposta morfologica e molecolare di NSPCs nel cervello adulto zebrafish dopo inclusioni dell'amiloide. Tali studi ci fornirà un'idea per la riparazione del danno cerebrale successo nei mammiferi. Il nostro metodo può essere utilizzato per capire il meccanismo molecolare necessario di una risposta di successo di rigenerazione dopo annuncio-come i sintomi per indurre la rigenerazione dei neuroni persi e recupero funzionale.

Protocollo

questo protocollo è una procedura standard suggerita da orientamenti dell'Unione europea (2010/63) e della European Society for Fish modelli in biologia e medicina (EuFishBioMed) a Karlsruhe Insitute di Technology (KIT). Tutti i metodi descritti qui dopo sono stati approvati dalla Commissione etica (Landesdirektion Dresda; documento numero TVV-52/2015).

1. preparazione di Aβ42 Peptide

  1. Synthesize peptidi (Vedi tabella 1) usando la chimica standard 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) con 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU) come il reagente di accoppiamento su un sintetizzatore di automatizzato del peptide di fase solida 52. La scala della sintesi era 100 µmol.
  2. Caricare il sintetizzatore di peptidi automatizzato con 500 mg di resina Fmoc-protetto come fase solida (capacità di carico di 0,2 mmol/g). Caricare i disciolti amminoacidi Fmoc-protetto ad una concentrazione di 0,5 M nel volume richiesto e calcolata per il sintetizzatore rispettivo.
    Nota: I calcoli sono effettuati per consentire l'accoppiamento di ciascun amminoacido Fmoc-protetto due volte con eccesso di 5 volte di ogni blocco di costruzione per la resina 47.
  3. Sciogliere i reagenti necessari per la sintesi peptidica in dimethlyformamide (DMF). Ad esempio, preparare l'attivatore, HBTU, ad una concentrazione di 0,48 M, 45% v/v N-metilmorpholin-(NMM) (base) e 5% v/v l'anidride acetica (la miscela di tappatura) per ricoprire i gruppi amminici non reagiti.
  4. Cleave tutti i peptidi dalla resina mescolando continuamente il supporto solido utilizzando un agitatore in una miscela preparata clivaggio composto da acido trifluoroacetico (TFA): Triisopropylsilane(TIS): acqua: ditiotreitolo (DTT) a 90 (v/v): 5 (v/v): 2.5 (v/v): 2,5 (m/v), per 4 h. uso 10 mL per la scala di sintesi di 100 µmol.
  5. Precipitare il prodotto fenduto aggiungendo la miscela di fenditura per 100 mL di etere etilico ghiacciata. Passare attraverso un'unità di filtrazione contenente un filtro di politetrafluoroetilene (PTFE) con un diametro dei pori di 0,45 µm e lavare con 20 mL di etere etilico ghiacciata.
  6. Raccogliere il peptide filtrato dal filtro di carta e sciogliere 100 mg del peptide precipitato in 5 mL acqua distillata o deionizzata: acetonitrile 1:1.
  7. Purificare tramite cromatografia liquida fase inversa ad alta pressione (HPLC) su un semi-preparatorio HPLC dotato di una colonna di divinilbenzene polistirolo poroso di perlina dimensioni 10 µm.
    1. Pre-riscaldare la colonna e mantenere a 50 ° C, utilizzando una colonna dispositivo di riscaldamento. Raccogliere tutte le principali frazioni utilizzando un collettore automatico frazione applicando una sfumatura dal 5% al 100% di solvente B su 25 min a 4 mL/min
      Nota: A solvente è 0,1% TFA in acqua e solvente B è 0,1% TFA in acetonitrile 52.
    2. Monitorare il cromatogramma a 220 nm, raccogliere le cime appropriate e analizzare mediante LC-MS.
  8. Conferma la purezza di analitica inversa fase ultra-alta pressione liquido cromatografia (UPLC) a 220 nm monitorando con un rivelatore UV mentre far passare il campione attraverso una colonna C18 analitica (perlina dimensioni 1,7 µm). Confermare il prodotto di peptidi mediante spettrometria di massa.
    Nota: Il UPLC è accoppiato un spettrometria totale ionizzazione electrospray (ESI-MS) e Tandem quadrupolo Detector.
  9. Lyophilize le frazioni corrette del peptide desiderato in un pallone a fondo tondo, applicando un vuoto di 0.052 mbar, per un soffice polvere. Accoppiare la pompa del vuoto ad un congelamento unità mantenuta a-78 ° C. Store a-80 ° C, a tempo indeterminato.
  10. Utilizzare il peptide liofilizzato per preparare una soluzione stock di 1 mM in una miscela di acetonitrile: DMF: acqua di grado analitico a 1:1:1 per gli esperimenti. Questa soluzione può essere conservata per almeno 6 mesi, come i peptidi non si aggregano in questa soluzione.

2. Preparazione della miscela di iniezione

  1. preparare il tampone fosfato salino (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mm Na 2 HPO 4, 2mm KH 2 PO 4, pH 7.4) per diluire i peptidi liofilizzati.
  2. Sciogliere il peptide ad una concentrazione finale di 20 µM in PBS. Preparare questa soluzione fresca. Mescolare bene e conservare il ghiaccio fino al momento dell'iniezione. Non superare i 30 minuti per impedire l'aggregazione in soluzione.

3. Anestesia

sistema
  1. preparare la soluzione di riserva degli anestetici, 0.1% m-aminobenzoate dell'etile methanesulphonate (MESAB), in acqua di pesci regolare la circolazione. Preparare la soluzione di anestetizzazione a una concentrazione finale di 0,0025% (v/v).
  2. Rimuovere il numero desiderato di pesce da loro carri armati in un contenitore di trasporto con 5 L di acqua sistema.
  3. Riempire a metà una plastica Petri (90 mm) con anestetici di 40 mL. Utilizzare questo piatto p.p.i.
  4. Incubare il pesce negli anestetici finché non ha cessato il movimento opercular.

4. Intracerebroventricolare Microinjection

  1. preparazione dell'apparato di iniezione
    1. preparare il vetro capillari di iniezione utilizzando un estrattore di ago con i seguenti parametri: riscaldamento ciclo, 537; trazione ciclo, 250; velocità, 1.5 s; tempo, 80 ms
    2. portare l'impostazione di pressione sulla fonte di pressione di 25 psi.
    3. Impostare i parametri di microinjector seguenti: hold pressione 20 psi; espellere pressione 10 psi; valore periodo 2,5; gating valore 100 ms.
    4. Caricare il capillare di vetro con la soluzione di iniezione. Il titolare di microiniezione, inserire il capillare di vetro. Regolare l'angolo di iniezione a 45°.
      Nota: Protocolli più dettagliati possono essere trovati come descritto in riferimenti 27 , 46.
  2. Il un pesce posto in una nuova piastra di Petri riempito con soluzione di anestetizzazione (come descritto al punto 3.3).
  3. Tenere il pesce con il forcipe e orient iniettabile.
  4. Generare una fessura con la punta di un ago 30g nel cranio sopra il tectum ottica dove si incontrano le due piastre laterali. Non inserire la punta nel tessuto cerebrale, questo causerebbe danni e sanguinamento. Vedi riferimenti 27 , 45 , 46 per ulteriori dettagli.
  5. Inserire il capillare di vetro nella fessura.
    1. Utilizzare solo la punta dell'ago e non penetrano più di 1 mm attraverso il cranio. Continuare a tenere premuto il pesce e inserire la punta del capillare attraverso il sito di incisione vetro.
    2. Consente di orientare la punta del vetro capillare verso il telencefalo un'angolazione di 45°. Iniettare 1 µ l della soluzione. Il liquido si disperde immediatamente dopo l'iniezione.

5. Recupero

  1. posto il pesce torna a un contenitore di trasporto fino a quando si recupera. Collegare il contenitore per l'acqua di pesce regolarmente circolanti per garantire la qualità dell'acqua ottimale.
    Nota: Il recupero dovrebbe essere 1 min. Se prende più lungamente, il pesce deve essere conservato negli anestetici per un tempo più breve (questo deve essere ottimizzato dallo sperimentatore).

6. Preparazione dei tessuti e sezionamento

  1. attesa per un periodo di tempo prima di sacrificare il pesce desiderato.
    Nota: Questo dipende dalla domanda sperimentale. Deposito dell'amiloide può essere visto più presto 1 giorno dopo l'iniezione.
  2. Sacrificare il pesce utilizzando il metodo appropriato a seconda delle norme etiche (per esempio, trattare il pesce con 0,1 M MESAB).
  3. Taglio aperto il cranio sopra il tectum ottica mediante pinza punta sul lato dorsale e sezionare la testa appena dietro la pinna pettorale usando un bisturi.
  4. Difficoltà le teste utilizzando 2% paraformaldeide (PFA) durante la notte a 4 ° C. uso 3 mL di PFA a testa in un tubo di plastica con coperchio a vite.
    Attenzione: Indossare l'attrezzatura di protezione idonea per maneggiare PFA.
  5. Per crioprotezione e decalcificazione, lavare le teste tre volte in 0.1M tampone fosfato (pH 7,4), quindi trasferirli in sucrose/20% 20% soluzione di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e incubare per una notte a 4 ° C.
  6. Per incorporare il tessuto di resina, di sezionamento congelare le teste in soluzione di saccarosio al 7,5% gelatin/20% in stampi di plastica istologia su ghiaccio secco (circa 3-5 min di congelare un blocco). Conservare i campioni a-80 ° C o continuare con il passaggio successivo (cryosectioning).
  7. Sezione le teste in 12 µm spessore cryosections utilizzando un criostato come descritto 28 , 42. Trasferire il cryosections direttamente su vetrini e conservare a-20 ° C per uso a lungo termine.

7. La colorazione immunoistochimica e microscopia

Nota: eseguire tutte le fasi di incubazione in una camera umidificata. E, tutti i passaggi del lavaggio sono per 10 min ogni.

  1. Asciugare le sezioni per 30 min a temperatura ambiente. Dopo lo scongelamento, lavare le sezioni due volte in PBS e una volta in PBSTx (PBS con 0,03% Triton X-100).
  2. Incubate con l'anticorpo primario (anticorpo anti-Aβ42; diluizione 1: 500 in PBSTx) a 4 ° C durante la notte. a seguito di giorno, lavare una volta in PBS e due volte in PBSTx.
  3. Incubare le sezioni con l'anticorpo secondario (rilevazione di fluorescenza-accoppiato, diluizione 1: 500) insieme con DAPI (1 μg/mL) in PBSTx per 2 h a temperatura ambiente.
  4. Lavare tre volte in PBSTx. Dopo il lavaggio finale, montare i vetrini con un vetrino coprioggetto utilizzando 100 μL 70% glicerolo.
  5. Acquisire immagini fluorescenti utilizzando un microscopio confocale (ad esempio con obiettivo 20 X PL APO N.A. 0,7 con 488 gamma di eccitazione e un filtro verde standard; Figura 2) 39.

Risultati

HPLC è stato utilizzato per purificare il peptide sintetizzato e spettrometria di massa è stata utilizzata per caratterizzare i peptidi purificati β amiloide. La colonna HPLC è stata riscaldata a 50 ° C per migliorare la separazione dei peptidi Aβ e tutte le frazioni sono stati raccolti. Per identificare il peptide sintetizzato correttamente, analisi di spettroscopia di massa è stata effettuata per tutte le frazioni. Il cromatogramma UPLC Mostra la purezza del composto. La frazione...

Discussione

I peptidi dell'amiloide possono essere modificati per includere le variazioni di sequenza o vari tag. Per esempio, può essere generato un peptide amiloide uova strapazzato, e i peptidi possono essere etichettati con tag fluorescente al N-terminale dell'estremità del peptide o etichettati come vettore peptidi39. Allo stesso modo, in questo protocollo, il peptide vettore è il cellula-penetrante peptide TR a causa della sua efficacia a carico di trasporto profondo nel tessuto di cervello

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato da DZNE e l'Associazione Helmholtz (VH-NG-1021), CRTD, TU Dresden (FZ-111, 043_261518) e DFG (KI1524/6) (C.K.); e dall'associazione di Leibniz (SAW-2011-IPF-2) e BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). Vorremmo anche ringraziare Ulrike Hofmann per sintesi peptidica e Nandini Asokan, Prayag Murawala e Elly Tanaka per aiuto durante le riprese la procedura.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Fmoc-protected amino acidsIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS)
N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU)IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)RL-1030Activator
OxymaIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)RL-1180Racemization supressor
N,N-DiisopropylethylamineIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)SOL-003Base
DimethylformamideIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)SOL-004Solvent
N-MethylmorpholineThermo Fisher (Kandel) GmbH, GermanyA12158Base
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT)Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA)157260 ALDRICHActivator
PiperidineMERCK KGaA (Darmstadt, Germany)822299Fmoc deprotection reagent
Dichlormethane (DCM)MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)106050Solvent
Formic acid (FA)MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)100264Buffer component for HPLC
Trifluoroacetic acid (TFA)MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)808260Clevage Mixture reagent
Triisopropylsilane(TIS)MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)233781 ALDRICHClevage Mixture reagent
Acetonitrile (for UPLC/LCMS)Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH34967-1LSolvent
Acetonitrile (for HPLC)VWR International Ltd, England83639.320Solvent
DiethyletherVWR International Ltd, England23811.326Solvent for peptide precipitation
Dithiotritol (DTT)VWR International Ltd, England0281-25GClevage Mixture reagent
TentaGel S RAM Fmoc rink amide resinRapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany)S30023Solid phase for SPPS
Peptide synthesis 5 ml syringes with included filtersIntavis AG (Cologne, Germany)34.274Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase
Polytetrafluoroethylene (PTFE) filterSartorius Stedtim (Aubagne, France)11806-50-NFilteration of precipitated peptides
Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filterCarl Roth GmbH + Co. KG KarlsruheKC78.1Pre-filteration for HPLC
Peptide SynthesizerIntavis, Cologne, GermanyResPep SLAutomated solid-phase peptide synthesizer
Water Alliance HPLCWaters, Milford Massachusetts, USAWaters 2998, Waters e2695Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC)
PolymerX, bead size 10μm, 250x10 mmPhenomenex Ltd. Germany00G-4328-N0Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column
Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filterEMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USALCPAK0001Water purification system
Filtration UnitSartorius Stedtim (Aubagne, France)16307Filtration unit for peptide precipitation
UPLC Aquity with UV DetectorWaters, Milford Massachusetts, USAM09UPA 664MAnalytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50x2.1 mmWaters, Milford Massachusetts, USA186002350Analytical C18 column
ACQUITY TQ DetectorWaters, Milford Massachusetts, USAQBB908Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany16706, 101542Lyophilizer with vaccum pump
Paradigm plate readerBeckman Coulter
MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate)Sigma-AldrichA5040
Petri dishesSarstedt821.472
Phosphate-buffered salineLife Technologies, GIBCO10010-056
NeedleBecton-Dickinson305178
Dissecting microscopeOlympus, Leica, ZeissVaries with the manufacturer
Dumont TweezersWorld Precision Instruments501985
Gillies Dissecting ForcepsWorld Precision Instruments501265
Glass injection capillariesWorld Precision InstrumentsTWF10
PicoNozzleWorld Precision Instruments5430-12
Pneumatic PicoPumpWorld Precision InstrumentsSYS-PV820
Ring illuminator; Ring Light GuideParkland ScientificILL-RLG
CryostatLeicaCM1950

Riferimenti

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