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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese, Charakterisierung und Injektion von Monomeren Amyloid-β42 Peptide zur Erzeugung von Amyloid Toxizität in Erwachsenen Zebrafisch, eine Alzheimer-Krankheitsmodell, gefolgt von histologische Analyse und Erkennung von Aggregationen.

Zusammenfassung

Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine schwächende Neurodegenerative Erkrankung in die Ansammlung der giftigen Amyloid-β42 (Aβ42) Peptide zu synaptischen Degeneration, Entzündung, neuronalen Tod führt, und Defizite zu lernen. Menschen können nicht verlorene Neuronen bei AD teilweise aufgrund eingeschränkter proliferative Kapazität der neurale Stammzellen/Vorläuferzellen (NSPCs) und reduzierte Neurogenese regenerieren. Daher effiziente regenerative Therapien dürfte auch die Verbreitung und neurogene Kapazität des NSPCs Zebrafish (Danio Rerio) ist eine regenerative Organismus, und wir können lernen, molekulare Grundprogramme mit denen wir gestalten könnte therapeutische Ansätze zur Bewältigung von AD. Aus diesem Grund war die Generation der ein AD-ähnliches Modell im Zebrafisch notwendig. Mit unserer Methodik können wir synthetische Derivate von Aβ42 Peptid mit Gewebe durchdringende Fähigkeit in das Gehirn des Erwachsenen Zebrafisch vorstellen und analysieren die Krankheit-Pathologie und die regenerative Antwort. Der Vorteil gegenüber den bestehenden Methoden oder Tiermodellen ist das Zebrafisch kann uns lehren, wie eine Wirbeltiere Gehirn natürlich regenerieren kann, und damit helfen Sie uns, menschliche Neurodegenerative Krankheiten besser zu behandeln, indem Sie auf endogene NSPCs. Daher kann das Amyloid-Toxizität-Modell im Gehirn Erwachsener Zebrafisch etabliert neue Möglichkeiten für die Forschung auf dem Gebiet der Neurowissenschaften und der klinischen Medizin öffnen. Darüber hinaus erlaubt die einfache Ausführung dieser Methode für kostengünstige und effiziente experimentelle Bewertung. Dieses Manuskript beschreibt die Synthese und Injektion von Aβ42 Peptide in Zebrafisch Gehirn.

Einleitung

AD ist eine chronisch fortschreitende Erkrankung zeichnet sich durch den Verlust von Neuronen und Synapsen in der Großhirnrinde1,2,3,4,5. Klassische neuropathologische AD zeichnen die Ablagerung von Amyloid Peptide und Bildung von der neurofibrillären Verwicklungen (NFTs)6. Senilen Plaques, auch bekannt als Amyloid-Plaques bestehen aus Amyloid-β (Aβ) Peptide, die β-Plissee Strukturen im Gehirn Parenchym5zu bilden. Die Anhäufung von Aβ42 in Alzheimer-Patienten hat eine frühe und wichtige Rolle im Fortschreiten der Krankheit. Anzeige löst eine Kaskade von Ereignissen zu synaptischen Dysfunktion, beeinträchtigt Plastizität und neuronaler Verlust7,8,9,10.

Die Erwachsene Gehirn teleost Zebrafisch dient als eine ausgezeichnete Modell zur Regulierung der Stammzelle Plastizität11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20 und verschiedenen Krankheiten in das zentrale Nervensystem (ZNS), einschließlich AD21,22,23 ,24. Aufgrund einer Vielzahl von verfügbaren experimentellen Methoden19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, sind diese Studien informativ und umsetzbar. Zebrafisch kann die CNS13,15,32,33,34,35,36,37auffüllen, 38, teilweise mit Hilfe molekularer Programme aktiviert nach neuronaler Verlust19,39,40,41,42,43, 44. Daher kann eine Neurodegenerative Krankheitsmodell zu etablieren, im Zebrafisch Adresse neuartige Fragen zu Fähigkeiten und die Stammzelle Regenerationsbiologie in vertebrate Gehirne helfen.

Vor kurzem, entwickelten wir ein Amyloid Toxizität in Erwachsenen Zebrafisch Gehirn durch die Injektion von synthetischem Aβ42 Peptide (Tabelle 1)39. Diese Injektion verursacht Neurodegeneration Phänotypen erinnert an menschliche Gehirnpathologie (z.B., Absterben von Zellen, Mikroglia-Aktivierung, synaptischen Degeneration und Gedächtnisstörungen), darauf hinweist, dass Zebrafisch eignet sich für entlocken Neurodegeneration im Zebrafisch Gehirn identifiziert Aβ42 Peptide erkannt werden können, mit immunhistochemischen Färbungen und molekularen Mechanismen der Regeneration im Erwachsenen Zebrafisch lässt CNS39. In diesem Protokoll zeigen wir Ihnen die Injektion von synthetischem Amyloid Peptide in der Zebrafisch Gehirn mittels eine Cerebroventricular Injektion (CVMI) Methode27,39,45,46 Amyloid-Ablagerungen (Abbildung 1) zu imitieren. CVMI bietet eine neuartige Weise des Lieferns der Peptide, die aggregiert nach Einspritzung als β-Sheet-Strukturen und üben Toxizität. Die Peptide werden gleichmäßig im gesamten Gehirn, gezielt das ventrikuläre Gebiet entlang der gesamten Rostro-kaudalen Achse45. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode für die Analyse der morphologischen und molekularen Reaktion des NSPCs im Erwachsenen Zebrafisch Gehirn nach Amyloid Einschlüsse. Solche Studien liefern uns einen Einblick für erfolgreiche Gehirn Reparatur bei Säugetieren. Unsere Methode kann verwendet werden, zu verstehen, die notwendig molekularen Mechanismus für eine erfolgreiche Regeneration Antwort nach AD-ähnliche Symptome, Auffüllung des verlorenen Neuronen und funktionelle Wiederherstellung zu induzieren.

Protokoll

dieses Protokoll ist ein Standardverfahren, vorgeschlagen von den EU-Richtlinien (2010/63) und der European Society for Fish Modelle in Biologie und Medizin (EuFishBioMed) im Karlsruher Institut für Technologie (KIT). Alle hier beschriebene Methoden von der Ethikkommission (Landesdirektion Dresden; Belegnummer TVV-52/2015) genehmigt worden.

1. Vorbereitung der Aβ42 Peptid

  1. Synthe Peptide (siehe Tabelle 1) unter Verwendung der standard 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) Chemie mit 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- Tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU) als die Kupplung Reagens auf eine automatisierte Festphasen-Peptid-Synthesizer- 52. Das Ausmaß der Synthese war 100 µmol.
  2. Laden den automatisierten Peptid-Synthesizer mit 500 mg des Harzes Fmoc-geschützt als die feste Phase (Ladekapazität von 0,2 Mmol/g). Laden Sie die gelösten Fmoc-geschützte Aminosäuren in einer Konzentration von 0,5 M in die benötigte Menge und berechnet für den jeweiligen Synthesizer.
    Hinweis: Die Berechnungen vorgenommen werden, ermöglichen die Kopplung der einzelnen Fmoc-geschützte Aminosäuren zweimal mit 5 Mal Übermaß an jeder Baustein in die Harz- 47.
  3. Lösen sich die erforderlichen Reagenzien für die Peptidsynthese in Dimethlyformamide (DMF). Zum Beispiel bereiten den Aktivator, HBTU, bei einer Konzentration von 0,48 M, 45 % V/V N-Methylmorpholine (NMM) (die Basis) und 5 % V/V Essigsäureanhydrid (Deckelung Mischung) nicht reagiert Aminogruppen Cap.
  4. Spalten die Peptide aus dem Harz durch kontinuierliches vermischen die solide Unterstützung mit einem Rührwerk in einem frisch zubereiteten Dekolleté-Gemisch bestehend aus Trifluoroacetic Säure (TFA): Triisopropylsilane(TIS): Wasser: Dithiothreitol (DTT) 90 (V/V): 5 (V/V): 2,5 (V/V): 2,5 (m/V), für 4 Std. verwenden 10 mL für die Synthese-Skala von 100 µmol.
  5. Niederschlag gespalten Produkt indem Sie 100 mL eiskaltes Diethylether Dekolleté-Mischung hinzufügen. Durchlaufen einer Filteranlage mit einem Polytetrafluorethylen (PTFE)-Filter mit einer Porengröße von 0,45 µm und waschen mit 20 mL eiskaltes Diethylether.
  6. Sammeln die gefilterte Peptid aus dem Filterpapier und auflösen 100 mg der ausgefällten Peptid in 5 mL deionisiertes Wasser destilliert: Acetonitril bei 1:1.
  7. Reinigen per Reverse-Phase Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) auf einem semi-präparative HPLC, ausgestattet mit einer porösen Polystyrol Divinylbenzene Spalte mit Perle Größe 10 µm.
    1. Die Spalte vorheizen und bei 50 ° C mit einer Spalte Heizung Gerät pflegen. Sammeln Sie alle großen Fraktionen, die mit einer automatisierten Fraktionssammler durch Anwenden einer Steigung von 5 % auf 100 % Lösungsmittel B mehr als 25 min bei 4 mL/min
      Hinweis: Lösungsmittel A ist 0,1 % TFA in Wasser und Lösungsmittel B beträgt 0,1 % TFA in Acetonitril 52.
    2. Überwachen das Chromatogramm bei 220 nm, die entsprechenden Gipfel zu erfassen und zu analysieren, mit der LC-MS.
  8. Bestätigen die Reinheit durch analytische Reverse phase extrem hohe Druck flüssige Chromatographie (UPLC) bei 220 nm durch die Überwachung mit einem UV-Detektor, indem man die Probe durch eine analytische C18-Säule (Perle Größe 1,7 µm). Bestätigen Sie das Peptid-Produkt durch Massenspektrometrie.
    Hinweis: Die UPLC ist gekoppelt an eine Electrospray Ionisierung Massenspektrometrie (ESI-MS) und Tandem-Quadrupol-Detektor.
  9. Lyophilize die richtige Bruchteile von das gewünschte Peptid in einem Rundboden-Kolben durch Anlegen eines Vakuums von 0.052 Mbar zu einem flauschigen Pulver. Paar der Vakuumpumpe zu einem eiskalten Einheit auf unbestimmte Zeit bei-78 ° c Store bei-80 ° C gehalten.
  10. Verwenden die lyophilisierte Peptid eine Stammlösung 1 mm in einer Mischung aus Acetonitril vorbereiten: DMF: analysenrein Wasser 1:1:1 für die Experimente. Diese Lösung kann für mindestens 6 Monate gespeichert werden, wie die Peptide in dieser Lösung nicht aggregiert.

2. Vorbereitung der Injektion Mischung

  1. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7,4) vorbereiten, verdünnen die lyophilisierten Peptide.
  2. Lösen das Peptid, eine Endkonzentration von 20 µM mit PBS-Puffer. Diese Lösung frisch zubereiten. Gut mischen und auf dem Eis bis zur Injektion lagern. Nicht mehr als 30 min um Aggregation in Lösung zu verhindern.

3. Narkose

  1. Vorbereitung der Stammlösung von Anästhetika, 0,1 % Ethyl-m-Aminobenzoate Methanesulphonate (MESAB), in regelmäßigen Fischwasser aus der zirkulierenden System. Bereiten Sie die Betäubung Lösung, eine Endkonzentration von 0,0025 % (V/V).
  2. Entfernen Sie die gewünschte Anzahl der Fische aus ihren Panzern in einem Transportbehälter mit 5 L Wasser System.
  3. Hälfte füllen ein Kunststoff Petrischale (90 mm) mit 40 mL Betäubungsmittel. Verwenden Sie dieses Gericht für Injektionen.
  4. Die Fische in der Anästhesie zu inkubieren, bis die Kiemendeckel Bewegung aufgehört hat.

4. Mikroinjektion Cerebroventricular

  1. Vorbereitung der Injektionsapparat
    1. bereiten das Glas Injektion Kapillaren mit einem Nadel-Abzieher mit den folgenden Parametern: Heizung Zyklus, 537, ziehende Zyklus, 250, Geschwindigkeit, 1.5 s; Zeit, 80 ms
    2. bringen die Druckeinstellung auf die Druckquelle bis 25 Psi.
    3. Legen Sie die Microinjector-Parameter Folgendes: Halt Druck 20 Psi; Auswerfen Druck 10 Psi; Periodenwert 2,5; gating Wert 100 Ms.
    4. Laden die Glas-Kapillare mit der Injektionslösung. Die Glas-Kapillare in der Mikroinjektion Halter einsetzen. Stellen Sie den Winkel Injektion auf 45°.
      Hinweis: Detaillierte Protokolle können gefunden werden, wie unter Referenzen 27 , 46.
  2. Ort einen Fisch in eine neue Petrischale gefüllt mit Betäubung Lösung (wie in Schritt 3.3).
  3. Halten Sie den Fisch mit der Zange und Orient Injektionslösung.
  4. Erzeugen einen Schlitz mit einer Nadelspitze 30 G in den Schädel über die optic Tectum treffen sich die beiden seitlichen Platten. Stecken die Spitze nicht in das Hirngewebe, dies würde dazu führen, dass Blutungen und Schäden. Siehe Referenzen 27 , 45 , 46 für weitere Details.
  5. Die Glas-Kapillare in den Schlitz einfügen.
    1. Verwenden Sie nur die Spitze der Nadel und dringen nicht mehr als 1 mm durch den Schädel. Halten Sie den Fisch und stecken die Spitze des Glases Kapillaren durch die Inzision Website.
    2. Richten Sie die Spitze des Glases gegenüber dem Telencephalon in einem 45°-Winkel Kapillare. 1 µL der Lösung zu injizieren. Die Flüssigkeit verteilt sich sofort nach der Injektion.

5. Erholung

  1. Ort, die den Fisch zu einem Transportbehälter zurück bis es erholt. Schließen Sie den Behälter an regelmässig Umwälzpumpe Fischwasser um optimale Wasserqualität zu gewährleisten.
    Hinweis: Die Wiederherstellung dauert normalerweise 1 min. Wenn es länger dauert, müssen die Fische in der Anästhetika für eine kürzere Zeit (Dies muss optimiert werden, indem der Experimentator) gehalten werden.

6. Gewebe-Vorbereitung und Berandungen

  1. warten für einen gewünschten Zeitraum der Zeit, bis die Fische zu opfern.
    Hinweis: Dies richtet sich nach der experimentellen Frage. Amyloid-Ablagerungen kann so früh wie 1 Tag nach der Injektion gesehen werden.
  2. Opfern, die Fische, die Verwendung der geeigneten Methode je nach den ethischen Vorschriften (z.B., behandeln Sie den Fisch mit 0,1 M MESAB).
  3. Den Schädel über die optic Tectum mit Spitzen Forcep auf der dorsalen Seite aufgeschnitten und sezieren der Kopf hinter der Brustflosse mit einem Skalpell.
  4. Fixieren die Köpfe mit 2 % Paraformaldehyd (PFA) über Nacht bei 4 ° C. Verwendung 3 mL PFA pro Kopf in ein Kunststoffrohr mit einer Schraube Deckel.
    Achtung: Tragen geeigneten persönlichen Schutzausrüstung beim Umgang mit PFA.
  5. Für Cryoprotection und Entkalkung, waschen den Kopf dreimal in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4), dann in 20 % sucrose/20% Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) Lösung überführen und Inkubation über Nacht bei 4 ° c
  6. Das Gewebe einbetten in Kunstharz-Schnitt frieren die Köpfe in 7,5 % gelatin/20% Zuckerlösung in Kunststoff Histologie Formen auf Trockeneis (ca. 3-5 min zu einen Block zu frieren). Die Proben bei-80 ° C zu speichern oder weiter zum nächsten Schritt (Kryoschneiden).
  7. Abschnitt die Köpfe in 12 µm dicken Cryosections mit einem Kryostat als beschrieben 28 , 42. Die Cryosections direkt auf den Objektträger übertragen und speichern bei-20 ° C für Langzeiteinsatz.

7. Immunhistochemische Färbung und Mikroskopie

Hinweis: führen Sie alle Inkubationsschritte aus in eine feuchte Kammer. Und alle Waschschritte sind für 10 min.

  1. Die Abschnitte für 30 min. bei Zimmertemperatur trocknen. Nach dem Auftauen, waschen Sie die Abschnitte zweimal mit PBS-Puffer und einmal in PBSTx (PBS mit 0,03 % Triton X 100).
  2. Inkubation mit dem primären Antikörper (Anti-Aβ42 Antikörper, Verdünnung 1: 500 in PBSTx) bei 4 ° C über Nacht nach Tag, einmal waschen mit PBS-Puffer und zweimal in PBSTx.
  3. Brüten in den Abschnitten mit den sekundären Antikörper (Fluoreszenz-gekoppelten Erkennung, Verdünnung 1: 500) zusammen mit DAPI (1 μg/mL) in 2 h bei Raumtemperatur PBSTx.
  4. Waschen dreimal in PBSTx. Nach dem letzten Waschen, montieren Sie die Folien mit einem Deckgläschen mit 100 μl 70 % Glycerin.
  5. Acquire fluoreszierende Bilder mit einem confocal Mikroskop (z. B. 20 X PL APO N.A. 0,7 Objektive mit 488 Erregung und ein standard Grünfilter; Abbildung 2) 39.

Ergebnisse

HPLC wurde verwendet, um das synthetisierte Peptid zu reinigen und Massenspektrometrie wurde verwendet, um die gereinigten Amyloid β-Peptide zu charakterisieren. Die HPLC-Säule wurde erhitzt bis zu 50 ° C, die Trennung von Aβ-Peptide zu verbessern und die Fraktionen wurden gesammelt. Um das korrekt synthetisierte Peptid zu identifizieren, wurde für alle Fraktionen Massenspektroskopie Analyse durchgeführt. UPLC Chromatogramm zeigt die Reinheit der Verbindung. Die HPLC-Fraktion, die e...

Diskussion

Das Amyloid Peptide können geändert werden, um Sequenzvariationen oder verschiedenen Tags enthalten. Beispielsweise eine Rührei Amyloide-Peptid kann erzeugt werden, und die Peptide können beschriftet mit fluoreszierenden Tags am N-Terminus von Peptid-Ende oder mit dem Stichwort Träger Peptide39. Ebenso ist das Träger-Peptid in diesem Protokoll der Zelle eindringen Peptid TR wegen seiner Wirksamkeit zu Transport Ladung tief in das Gehirn Gewebe39. Darüber hinaus könn...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von DZNE und die Helmholtz-Gemeinschaft (VH-NG-1021), CRTD, TU Dresden (FZ-111, 043_261518) und DFG (KI1524/6) (c.k.); und durch die Leibniz-Gemeinschaft (SAW-2011-IPF-2) und BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z). Wir möchten auch Ulrike Hofmann für die Peptidsynthese und Nandini Asokan, Prayag Murawala und Elly Tanaka für Hilfe während der Dreharbeiten des Verfahrens danken.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Fmoc-protected amino acidsIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS)
N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU)IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)RL-1030Activator
OxymaIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)RL-1180Racemization supressor
N,N-DiisopropylethylamineIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)SOL-003Base
DimethylformamideIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)SOL-004Solvent
N-MethylmorpholineThermo Fisher (Kandel) GmbH, GermanyA12158Base
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT)Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA)157260 ALDRICHActivator
PiperidineMERCK KGaA (Darmstadt, Germany)822299Fmoc deprotection reagent
Dichlormethane (DCM)MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)106050Solvent
Formic acid (FA)MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)100264Buffer component for HPLC
Trifluoroacetic acid (TFA)MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)808260Clevage Mixture reagent
Triisopropylsilane(TIS)MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)233781 ALDRICHClevage Mixture reagent
Acetonitrile (for UPLC/LCMS)Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH34967-1LSolvent
Acetonitrile (for HPLC)VWR International Ltd, England83639.320Solvent
DiethyletherVWR International Ltd, England23811.326Solvent for peptide precipitation
Dithiotritol (DTT)VWR International Ltd, England0281-25GClevage Mixture reagent
TentaGel S RAM Fmoc rink amide resinRapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany)S30023Solid phase for SPPS
Peptide synthesis 5 ml syringes with included filtersIntavis AG (Cologne, Germany)34.274Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase
Polytetrafluoroethylene (PTFE) filterSartorius Stedtim (Aubagne, France)11806-50-NFilteration of precipitated peptides
Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filterCarl Roth GmbH + Co. KG KarlsruheKC78.1Pre-filteration for HPLC
Peptide SynthesizerIntavis, Cologne, GermanyResPep SLAutomated solid-phase peptide synthesizer
Water Alliance HPLCWaters, Milford Massachusetts, USAWaters 2998, Waters e2695Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC)
PolymerX, bead size 10μm, 250x10 mmPhenomenex Ltd. Germany00G-4328-N0Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column
Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filterEMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USALCPAK0001Water purification system
Filtration UnitSartorius Stedtim (Aubagne, France)16307Filtration unit for peptide precipitation
UPLC Aquity with UV DetectorWaters, Milford Massachusetts, USAM09UPA 664MAnalytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50x2.1 mmWaters, Milford Massachusetts, USA186002350Analytical C18 column
ACQUITY TQ DetectorWaters, Milford Massachusetts, USAQBB908Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany16706, 101542Lyophilizer with vaccum pump
Paradigm plate readerBeckman Coulter
MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate)Sigma-AldrichA5040
Petri dishesSarstedt821.472
Phosphate-buffered salineLife Technologies, GIBCO10010-056
NeedleBecton-Dickinson305178
Dissecting microscopeOlympus, Leica, ZeissVaries with the manufacturer
Dumont TweezersWorld Precision Instruments501985
Gillies Dissecting ForcepsWorld Precision Instruments501265
Glass injection capillariesWorld Precision InstrumentsTWF10
PicoNozzleWorld Precision Instruments5430-12
Pneumatic PicoPumpWorld Precision InstrumentsSYS-PV820
Ring illuminator; Ring Light GuideParkland ScientificILL-RLG
CryostatLeicaCM1950

Referenzen

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