تحديد الأحماض السياليك في الكبد وعينات الحليب من البرية من نوع و<em&gt; CMAH</em&gt; خروج المغلوب الفئران.

Summary

نحن تصف طريقة القائم على هبلك لتحديد N- حمض أسيتيلنورامينيك وحمض N- جليكوليلورامينيك في الكبد الماوس والحليب.

Abstract

كماه (سيتيدين مونوفوسفهات-N-أسيتيلنورامينيك حامض هيدروكسيلاز) هو المسؤول عن أكسدة أحماض سيتيدين أحادي فوسفات - N- أسيتيلنورامينيك في الثدييات. ومع ذلك، لا يمكن للبشر أكسدة حمض السيتيدين مونوفوسفهات-N- أسيتيلنورامينيك إلى حمض سيتيدين مونوفوسفهات-N- جليكولنورامينيك بسبب حذف اكسون الابتدائي للجين كماه . لفهم الآثار والآثار المترتبة على عدم وجود نشاط سماه بمزيد من التفصيل، ونموذج تدق كماه في الفئران هو من اهتمام كبير في البحوث الأساسية والتطبيقية. طريقة التحليل لتحديد النمط الظاهري لهذا النموذج الماوس هو موضح هنا بالتفصيل، ويستند على الكشف عن كل من N- حمض أسيتيلنورامينيك وحمض N- غليكوليلورامينيك في الكبد وحليب البرية من نوع و كماه تدق الفئران. يتم الافراج عن الأحماض السياليك الذاتية و ديريفاتيزد مع o- فينيلينديامين لتوليد المشتقات الفلورية، والتي يمكن تحليلها لاحقا من قبل هبلك. يمكن أن يكون البروتوكول المقدمكما طبقت لتحليل عينات الحليب والأنسجة من مختلف الأصول الأخرى، ويمكن أن تكون مفيدة للتحقيق في الآثار الغذائية والصحية للحمض N-غليكوليلورامينيك.

Introduction

N- حمض أسيتيلنورامينيك (Neu5Ac) وحمض N- جليكولنورامينيك (Neu5Gc) هي الأحماض السياليك الأكثر شيوعا في معظم الثدييات ¹ . على الرغم من أن قادرة على تصنيع Neu5Ac داخليا، والبشر ليست قادرة على إنتاج Neu5Gc بسبب حذف اكسون الابتدائي على ترميز الجينات سماه ل هيدروكسيلاز سمب-Neu5Ac ^{2 ، 3} . ومع ذلك، يمكن للمنتجات الغذائية الحيوانية القائمة على مصادر غذائية من Neu5Gc ^{4 ، 5 ، 6} ، مما يؤدي إلى إنتاج الأجسام المضادة لمكافحة Neu5Gc، وبالتالي تؤدي إلى استجابة مناعية تجاه Neu5Gc ⁷ . ويشتبه هذا التأثير الغذائي لل Neu5Gc للمساهمة في التهاب مزمن وأمراض أخرى مختلفة ^{8 ، 9 ، 10} . من أجل فهم شامل لآثار Neu5Gc في حأومانز، نموذج حيواني للدراسة المنهجية لآثار الأحماض السياليك التي تنقلها الأغذية هو مرغوب فيه للغاية. على الرغم من أن البروتوكولات القائمة على البوليميراز سلسلة من ردود الفعل (ير) لتحليل الفئران التدقرج هي راسخة وطريقة مريحة للتقييم الجيني، والتحليل الوظيفي للنمط الظاهري على مستوى التمثيل الغذائي يتطلب أساليب تحليل أكثر تحديدا. يمكن تقييم النمط الظاهري للماوس تدق نموذج الماوس من خلال عزل وتحليل تكوين الأحماض السياليك في عينات الكبد أو الحليب. وقد تم الإبلاغ عن عدة طرق للكشف عن الأحماض السياليك في أنسجة الحيوانات في وقت سابق: رد فعل الأحماض السياليك مع ريسورسنول ¹¹ أو حمض الثيوباربيتوريك ¹² يؤدي إلى تشكيل منتج كروموفوريك ويمكن تحليلها ببساطة باستخدام الإعداد بلاتريدر مقرها، ولكن فقط مجموع سياليك قد يتم تحديد محتوى الحمض. بدلا من ذلك، تم وصف تحليل الأحماض السياليك أيضا باستخدام اللوني للغاز¹³ ، مالدي-توف الطيف الكتلي ¹⁴ أو أساليب أمبيروميتريك ¹⁵ . ومع ذلك، فإن أساليب تحليل حمض السياليك الأكثر شيوعا تعتمد على الإفراج التحلل، تليها مشتق مضان واللاحقة عالية الأداء اللوني السائل ^{16 ، 17 ، 18} .

Protocol

وقد وافقت اللجنة الأخلاقية لمركز الحيوان التجريبي في جامعة نانجينغ الزراعية وفقا للإجراءات الوطنية لرعاية الحيوان التجريبي (وزارة العلوم والتكنولوجيا، العلاقات العامة في الصين، 2006) مع الحيوانات الموجودة في سف منشأة (رقم التصريح: سيكسك-J-2011-0037).

1. كماه المغلوب خارج الماوس نموذج

1. استخدام البرية من نوع C57Bl / 6 الفئران من مركز الطب المقارن من جامعة يانغتشو (الصين).
   ملاحظة: تم إنشاؤها كماه تدق الفئران خارج استنادا إلى المعلومات المقدمة من السابق كماه تدق التدريجي الدراسات ^{17 ، 19} والحصول تجاريا باستخدام استراتيجية كريسبر / Cas9 ²⁰ عن طريق إزالة 92 أزواج قاعدة من اكسون 6 من الجينات كماه ، والذي هو أيضا محذوف في الجين البشري كماه ¹⁹ . إيجابي F _{0 <}/ الفرعية> -mice (2 أفراد) عبرت مع الفئران نوع البرية للحصول على متخالف F ₁ -mice. بعد عبور متخالف F ₁ -mice (5 أفراد)، متماثل Cmah خروج المغلوب F ₂ -mice يمكن الحصول عليها بنجاح (3 أفراد).
2. إجراء التنميط الجيني من الفئران باستخدام الحمض النووي الجيني وفقا للطريقة التي أظهرها زانغالا ²¹ باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي التجارية.
   1. تضخيم المقابلة جزء الحمض النووي للجين Cmah باستخدام البلمرة DNA التجاري والزوج التمهيدي 5'gaaagggctcggctctgtatgaa3 "و5'tttaaaatgtcccgggtgagaagc3. أداء التضخيم الجيني باستخدام 34 دورة ير تتكون من تمسخ في 94 درجة مئوية لمدة 40 ثانية، الصلب عند 63 درجة مئوية لمدة 40 ثانية، واستطالة عند 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
   2. تصور المنتجات ير على هلام الاغاروز 1٪. ينبغي للمرء أن يراقب فرقة واحدة (0.5 كيلو بايت) للفرد من نوع البرية، ونطاق مزدوج (0.4 و 0.5 كيلو بايت) لمتفرقة متخالف الفردي، والفرقة واحدة (0.4 كيلو بايت) لفرد متماثل ضرب المغلوب.

2. جمع العينات

1. جمع الحليب الماوس باستخدام بروتوكول وصفها ويلينغهام وآخرون. ^22-
2. جمع الأنسجة الماوس الكبد باستخدام بروتوكول وصفها غونكالفس وآخرون. ²³ وتخزين العينات في -80 درجة مئوية.

3. عزل الأحماض السياليك من الحليب

1. إعداد 100 مل من محلول حمض الخليك 2 M عن طريق إضافة 12 مل من حمض الخليك الجليدي إلى 88 مل من المقطر H ₂ O.
2. نقل 50 ميكرولتر من الحليب إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل وإضافة 1.2 مل من محلول حمض أسيتيك مائي أعدت.
3. احتضان تعليق لمدة 4 ساعات في 80 درجة مئوية وأجهزة الطرد المركزي العينة في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة.
4. نقل أعلى 1000 ميكرولتر من طاف في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل الطازجة و ريمفوق المذيب عن طريق التبخر الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لاستكمال جفاف (اعتمادا على مضخة فراغ المرفقة هذا وسوف يستغرق 4-20 ساعة). إعادة حل العينة في 500 ميكرولتر من المقطر H ₂ O.
5. إعداد عمود الصرف أنيون الصغرى. هذه الخطوة سوف تثري على وجه التحديد المركبات الأيونية وإزالة المركبات الموجبة والمحايدة من عينات الحليب والكبد، وبالتالي يزيد من الانتقائية من وكيل أوبد الفلوروجينيك المسمى وسم مشتقات حمض سياليك.
   1. نقل لكل عينة 200 ملغ من راتنج التبادل أنيون (داوكس 1X8) إلى أنابيب عمود فارغة 3 مل مع محبس المرفقة.
   2. إضافة 2 مل من محلول حمض أسيتيك مائي أعدت في الخطوة 3.1 لاستبدال أيونات الكلوريد في الراتنج مع أيونات خلات. إغلاق محبس في أقرب وقت المذيبات تصل إلى الجزء العلوي من الراتنج.
   3. إضافة بلطف 2 مل من H المقطر O ₂ ، فتح محبس ووقف تدفق في أقرب وقت معظم المذيبات تصلالجزء العلوي من الراتنج. تأكد من أن الراتنج مغطى دائما مع المذيبات.
   4. غسل عمود الراتنج مرتين أكثر مع 2 مل من H المقطر H ₂ O لإزالة خلات الزائدة.
6. نقل الناتجة ميكرولتر 500 من عينة المذيبات من الخطوة 3.4. على عمود الراتنج وتجاهل تدفق من خلال. غسل بلطف الراتنج مع 2 مل من المقطر H ₂ O. أزل العينة الأنيونات من الراتنج باستخدام 1 مل من 50 ملي محلول الأمونيوم خلات (386 ملغ من خلات الأمونيوم الذائبة في 100 مل من المقطر H ₂ O) إلى 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي. إزالة المذيب عن طريق التبخر الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة إلى جفاف.
   ملاحظة: يمكن تخزين العينات الجافة في 4-6 درجة مئوية لمدة تصل إلى 12 شهرا.

4. عزل الأحماض السياليك من أنسجة الكبد

1. ذوبان الجليد بلطف 20 - 50 ملغ من الكبد الماوس ونقله إلى دونس طاحونة الأنسجة (1 مل أو 2 مل من حجم). إضافة 1.2 مل من محلول حمض أسيتيك مائيأعدت في الخطوة 3.1 وتجانس الأنسجة عن طريق القص لطيف لمدة 10 ثانية. نقل تعليق الناتجة في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل.
2. اتبع الخطوات 3.3. إلى 3.6.
   ملاحظة: يمكن تخزين العينات الجافة في 4-6 درجة مئوية لمدة تصل إلى 12 شهرا.

5. إعداد معيار حمض سياليك مختلطة

1. تزن في ما بين 5-8 ملغ من حمض N- أسيتيلنورامينيك على التوازن التحليلي في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل. لاحظ الوزن الدقيق وإضافة 164 ميكرولتر من H المقطر H ₂ O لكل ملغ ( أي إذا كان وزن Neu5Ac هو 7.2 ملغ ثم إضافة 7.2 × 164 = 1، 181 ميكرولتر من المقطر H ₂ O). هذا يؤدي إلى حل الأسهم 20 ملي Neu5Ac التي يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 12 شهرا.
2. الحصول على حمض N- جليكولنورامينيك بكميات أصغر بسعر معتدل مثل في 1 ملغ أليكوتس. إضافة 154 ميكرولتر من المقطر H ₂ O مباشرة إلى المجمع من أجل الحصول على ~ 20 ملي حل الأسهم NE5Gc. نقلحل في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل. يمكن تخزين هذا الحل في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 12 شهرا.
3. الجمع بين 5 ميكرولتر من كل حل المخزون من الخطوة 5.1 و 5.2 إلى الطازجة 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي وإزالة المذيبات بواسطة التبخر الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة إلى جفاف.
   ملاحظة: يمكن تخزين معيار حمض السياليك مختلطة في 4-6 درجة مئوية لمدة تصل إلى 12 شهرا.

6. مضان اشتقاق الأحماض السياليك

1. إعداد 10 مل من أوبد الحل، ويتألف من 100 ملغ من o- فينيلينديامين و 208 ملغ من كبريتات الهيدروجين الصوديوم في 10 مل من H المقطر H ₂ O.
2. إضافة 20 ميكرولتر من حل أوبد لعينات حمض السياليك المستمدة من حليب الماوس (الخطوة 3)، كبد الفأر (الخطوة 4)، أو مختلطة حمض سياليك القياسية (الخطوة 5). دوامة بقوة لمدة 30 ثانية واحتضان عينات لمدة 4 ساعات في 80 درجة مئوية في الظلام ( أي التفاف ميكروتوبس في رقائق الألومنيوم).
3. السماح للعينات يبرد لمدة 5 دقائق، إضافة 80 μ؛ L المقطر H ₂ O وأجهزة الطرد المركزي أنابيب في 14،000 x ج لمدة 1 دقيقة.
4. نقل 80 ميكرولتر من طاف في 300 ميكرولتر عالية الانتعاش قارورة هبلك. يمكن تخزين عينات حمض السياليك ديريفاتيزد في 4-6 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.

7. تحليل هبلك من المشتقات حمض سياليك

1. تحليل العينات باستخدام نظام هبلك القياسية متصلة كاشف مضان على الانترنت.
2. استخدام عمود المرحلة C18 عكس مع الأبعاد القياسية من 250 مم طول و 4.6 مم قطر للتحليل.
3. إعداد المذيب A عن طريق تمييع 200 مل من محلول المخزون مع 800 مل من المياه لمس الصف (لمس - اللوني السائل الكتلة الطيفية). الحل الأسهم نفسها يمكن إعدادها على النحو التالي:
   1. إضافة 46 غرام من حمض الفورميك إلى 800 مل من LMS- الصف H ₂ O.
   2. ضبط درجة الحموضة إلى 4.5 بواسطة قطرة قطرة إضافة محلول هيدروكسيد الأمونيوم (بوريس.
   3. نقل المذيب إلىقياس اسطوانة وملء ما يصل إلى 1000 مل مع LMS- الصف H ₂ O. ويمكن تخزين هذا الحل المخزون في 4-6 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
4. بالنسبة للمذيب B، استخدم أسيتونيتريل لمس-غريد.
5. فصل المشتقات الأحماض سياليك بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة مع شطف التدرج التالية:
   1. ابدأ بإضافة 10٪ من المذيب B المختلط إلى المذيب A.
   2. من 0 دقيقة إلى 15 دقيقة، وزيادة تدريجية في نسبة المذيب B مع التدرج الخطي إلى 60٪.
   3. من 15 دقيقة إلى 16 دقيقة، بسرعة زيادة نسبة المذيب B مع التدرج الخطي من 60٪ إلى 90٪. هذا يبدأ غسل العمود هبلك.
   4. لمزيد من غسل العمود هبلك، والحفاظ على مستوى المذيب B في 90٪ بين 16 دقيقة و 18 دقيقة قبل الحد تدريجيا من مستوى المذيب B مرة أخرى إلى 10٪ بين 18 دقيقة و 19 دقيقة.
   5. إعادة توازن عمود هبلك إلى ظروف انطلاق 10٪ B بين 19 و 24 دقيقة.
6. فيجيكت 50 ميكرولتر من العينة في نظام هبلك.
7. رصد خيوط باستخدام مضان كاشف الإثارة / انبعاث موجات من 373/448 نانومتر، والأحماض سياليك ديريفاتيزد يمكن أن يتوقع في أوقات الاحتفاظ التقريبي من 9 دقيقة (ل Neu5Gc-أوبد) و 10 دقيقة (ل Neu5Ac-أوبد).
8. حساب المبلغ النسبي لل Neu5Gc (F _Neu5Gc ) من المناطق ذروة مضان من Neu5Ac (A _Neu5Ac ) و Neu5Gc (A _Neu5Gc ) على النحو التالي: F _Neu5Gc [٪] = 100 × و _Neu5Gc / (A _ne5Ac + A _Neu5Gc ). في حالة عينات الحليب والكبد من متماثل متماثلة كماه ضرب المغلوب الماوس F _Neu5Gc ينبغي أن يكون 0٪، في حين أن القيم ل F _Neu5Gc من متخالف والبرية من نوع الفئران قد تختلف على نطاق واسع اعتمادا على عصر الماوس ونوع الأنسجة (بين 2٪ و> 90٪) مع هوامش الخطأ المتوقعة ± 12٪.

النتائج

ويرد نظرة عامة التخطيطي لطريقة تحليل وصفها في الشكل 1 ، ويتضمن عزل الأحماض السياليك من عينات الحليب والكبد من نوع البرية و كماه تدق الطرد الفئران متحولة، ومشتق مضان وتحليل هبلك من هذه المكونات. الشكل 2

Discussion

يسمح البروتوكول هنا تقديم التقييم phenotypical من متماثل الفئران خروج المغلوب Cmah من خلال تحليل وقياس كميات النسبية Neu5Gc من الحليب والكبد العينات. تم إجراء التحليل باستخدام إعداد هبلك القياسية مع الكشف مضان. الخطوة الأكثر أهمية من هذا الإجراء هو إعداد الأعمدة تبادل أن?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals:
N-acetylneuraminic acid	Sigma	A0812
N-glycolylneuraminic acid	Sigma	50644	1 mg aliquot should be sufficient
o-Phenylenediamine	Sigma	694975
Sodium hydrogen sulfite	J&K Scientific Ltd	75234
Tools/Materials:
3 mL SPE tubes	Supelco	Sigma 57024	empty solid phase extraction columns
Luer stopcock	Sigma	S7396	to stop the flow of the SPE tube
Dowex 1X8	Dow Chemicals	Sigma 44340	200-400 mesh
Dounce tissue grinder	Sigma	D8938	tight fit
HPLC Analysis:
High-recovery HPLC vial	Agilent Technologies	#5188-2788
HPLC System	Shimadzu	Nexera
Fluorescence Detector for HPLC	Shimadzu	RF-20Axs
HPLC Column	Phenomenex	Hyperclone ODS	250x4.6 mm
LCMS-grade H2O	Merck Millipore	#WX00011
LCMS-grade Acetonitrile	Merck Millipore	#100029	Hypergrade
Ammonium hydroxide solution	Fluka	#44273	puriss. P.a.