Karaciğer ve Süt örneklerinde vahşi tipli ve sialik asitler tayini ve<em&gt; CMAH</em&gt; Knock-out Fare.

Özet

Fare karaciğeri ve sütündeki N-asetilnöraminik asit ve N-glikolenüraminik asitin tayini için HPLC temelli bir yöntem açıklanmaktadır.

Özet

CMAH (sitidin monofosfat-N-asetilnöramin asit hidroksilaz), memelilerde sitidin monofosfat-N-asetilnöraminik asitlerin oksidasyonundan sorumludur. Bununla birlikte, insanlar CMAH geninin primer ekson silinmesi nedeniyle sitidin monofosfat-N-asetilnöraminik asiti sitidin monofosfat-N-glikoli-nöraminik asite oksitleyemezler . CMAH aktivitesinin eksikliğinin etkilerini ve etkilerini daha ayrıntılı olarak anlamak için, farelerde bir Cmah knock-out modeli, temel ve uygulamalı araştırmalara yoğun ilgi duymaktadır. Bu fare modelinin fenotipini belirlemek için analiz metodu burada detaylı olarak tarif edilmiş olup, vahşi tip ve Cmah nakavt farelerinin karaciğerindeki ve sütünün her ikisinde de N-asetilnöraminasit ve N-glikolenüraminik asitin saptanmasına dayanmaktadır. Endojen sialik asitler serbest bırakılır ve daha sonra HPLC ile analiz edilebilen flüorojenik türevler oluşturmak üzere o-fenilendiamin ile türevlendirilir. Sunulan protokol,Çeşitli başka kaynaklı süt ve doku örneklerinin analizi için de uygulanmış ve N-glikoli-nevüaminik asidin beslenme ve sağlık etkilerini araştırmak için kullanılabilir.

Giriş

N-asetilnöraminik asit (Neu5Ac) ve N-glikoli-nöraminik asit (Neu5Gc), çoğu memelide en yaygın sialik asitlerdir ¹ . Neu5Ac'yi endojen olarak sentezleyebiliyor olsa da, insanlar bir CMP-Neu5Ac hidroksilaz ^{2 , 3'ü} kodlayan CMAH geni üzerinde birincil ekson silinmesi nedeniyle Neu5Gc üretemiyor. Bununla birlikte, hayvana dayalı gıda ürünleri Neu5Gc ^{4 , 5 , 6'nın} diyet kaynaklı olabileceği gibi anti-Neu5Gc antikorlarının üretilmesine ve dolayısıyla Neu5Gc ^7'ye karşı bir bağışıklık tepkisinin tetiklenmesine neden olur. Neu5Gc'nin bu besinsel etkisinin kronik inflamasyona ve diğer çeşitli hastalıklara ^{8 , 9 , 10} katkıda bulunduğu düşünülmektedir. Neu5Gc'nin h üzerindeki etkilerini kapsamlı olarak anlamak içinUmans, gıda kaynaklı sialik asitlerin etkilerinin sistematik çalışması için bir hayvan modeli son derece arzu edilir. Nakavt farelerinin analizinde polimeraz zincir reaksiyonuna (PCR) dayanan protokoller iyi belirlenmiş ve genotipik değerlendirme için uygun bir yol olmasına rağmen, fenotipin metabolik seviyedeki işlevsel analizi daha spesifik analiz yöntemleri gerektirir. Bir Cmah knock-out fare modelinin fenotipi, karaciğer veya süt örneklerinde sialik asitlerin kompozisyonunu izole ederek ve analiz ederek değerlendirilebilir. Hayvan dokularında sialik asitlerin saptanması için çeşitli yöntemler daha önce bildirilmiştir: sialik asitlerin resorsinol ¹¹ ya da tiobarbitürik asit ¹² ile reaksiyona sokulması, bir kromoforik ürünün oluşumuyla sonuçlanır ve basitçe bir platereader temelli kurulum kullanılarak analiz edilebilir ancak sadece toplam siyaliktir Asit içeriği belirlenebilir. Alternatif olarak, sialik asitlerin analizi de gaz kromatografisi¹³ , MALDI-ToF kitle spektrometrisi ¹⁴ veya amperometrik yöntemler ¹⁵ . Bununla birlikte, en yaygın olarak uygulanan sialik asit analiz yöntemleri, hidrolitik salıma, bunu takiben floresan türevlendirmeye ve daha sonra yüksek performanslı sıvı kromatografisine ( ^{16 , 17 , 18)} dayalıdır.

Protokol

Hayvanları ilgilendiren prosedürler, Nanjing Ziraat Üniversitesi Deneysel Hayvan Merkezi Etik Kurulu tarafından Deneysel Hayvan Refahı Ulusal Rehberine (Çin Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Bakanlığı, 2006) uygun olarak, bir SPF'de barındırılan hayvanlarla onaylanmıştır Tesis (İzin KİMLİĞİ: SYXK-J-2011-0037).

1. Cmah Knock-out Fare Modeli

1. Yangzhou Üniversitesi (Çin) Karşılaştırmalı Tıp Merkezi'nden alınan vahşi tip C57Bl / 6 farelerini kullanın.
   Not: Cmah knock-out fareler de Cmah geninin ekson 6 92 baz çifti kaldırarak, ticari olarak bir CRISPR / Cas9 ²⁰ strateji kullanarak önceki Cmah nakavt çalışmaları ^{17, 19} ve elde edilen sağlanan bilgilere dayanarak oluşturulan Insan CMAH geninde silinmiş ¹⁹ . Pozitif F _{0 <}/ alt> -mice (2 birey) heterozigot F ₁ -mice elde etmek için, yabani tip fareler ile çaprazlanır. Heterozigot F _1- misli (beş birey) geçtikten sonra, homozigot CmA knock-out F _2- misli başarıyla elde edilebilir (3 kişi).
2. Ticari bir DNA saflaştırma kiti kullanarak Zangala ²¹ tarafından gösterilen yönteme göre genomik DNA kullanarak farelerin genotiplendirme yapın.
   1. Ticari DNA polimeraz ve primer çift 5'gaaagggctcggctctgtatgaa3 've 5'tttaaaatgtcccgggtgagaagc3' kullanarak Cmah geninin ilgili bir DNA parçasını genişletin. 94 ° C'de 40 saniye, 63 ° C'de 40 saniye tavlama ve 1 dakika boyunca 72 ° C'de uzama içeren 34 PCR döngüsü kullanılarak gen amplifikasyonunu uygulayın.
   2. PCR ürünlerini% 1 agaroz jel üzerinde görselleştirin. Vahşi tip birey için tek bir bant (0.5 kb), çift bant (0.4 ve 0.5 kb) gözlemlenmelidir.Heterozigot knock-out bireyi ve homozigot nakavt bireyi için tek bir bant (0.4 kb) içermektedir.

2. Örnek Koleksiyon

1. Willingham ve ark tarafından açıklanan protokolü kullanarak fare sütü toplayın . ²² .
2. Gonçalves ve ark. Tarafından tarif edilen protokolü kullanarak fare karaciğer dokusunu toplayın . ²³ ve örnekleri -80 ° C'de saklayın.

3. Sütten Sialik Asitlerin İzolasyonu

1. Damıtılmış _H2O 88 mL'lik buzlu asetik asit 12 ml ilave edilerek 2 M asetik asit solüsyonu, 100 mL hazırlanması
2. 50 mL sütü bir 1.5 mL santrifüj tüpüne aktarın ve hazırlanan sulu asetik asit çözeltisinden 1.2 mL ekleyin.
3. Süspansiyonu 80 ° C'de 4 saat inkübe edin ve numuneyi 14.000 xg'de 10 dakika santrifüjleyin.
4. Süpernatantın en iyi 1.000 μL'sini taze bir 1.5 mL santrifüj tüpüne aktarın ve remÇözücüyü oda sıcaklığında santrifüj buharlaştırmayla kurutun (bağlı vakum pompasına bağlı olarak 4-20 saat sürecektir). Yeniden çözülür damıtılmış _H2O 500 uL numune
5. Bir mikro-anyon değişim sütunu hazırlayın. Bu adım, özellikle anyonik bileşiklerin zenginleşmesine ve süt ve karaciğer örneklerinden katyonik ve nötr bileşiklerin uzaklaştırılmasına ve dolayısıyla florojenik OPD etiketleme maddesinin sialik asit türetilmesi için seçiciliğini arttırır.
   1. Her numune için, 200 mg anyon değişim reçinesi (Dowex 1X8), boş bir 3 ml sütun tüplerine, bağlı bir musluk ile aktarın.
   2. Reçinedeki klorür iyonlarını asetat iyonlarıyla değiştirmek için aşama 3.1'de hazırlanan sulu asetik asit çözeltisinin 2 mL'si ilave edin. Çözücü reçinenin üst kısmına ulaştığında musluğu kapatın.
   3. Damıtılmış H ₂ O damla damla 2 mL hafifçe ilave edin, musluğu açın ve çözücünün çoğuna ulaştığında akışını durdurunReçinenin üstü. Reçinenin daima solvent ile kaplandığından emin olun.
   4. Fazla asetat çıkarılması için damıtılmış _H2O 2 mL reçine sütun iki kez daha yıkanır.
6. Elde edilen 500 μL örnek solven 3.4 adımından aktarılır. Reçine sütun üzerine yerleştirin ve akışı atın. Yavaşça 1.5 mL bir 50 mM amonyum asetat solüsyonu 1 ml kullanılarak reçineden örnek anyonlar (amonyum asetat 386 mg damıtılmış _H2O, 100 mL) damıtılmış _H2O Elute 2 mL reçine yıkama Santrifüj tüpü. Solvent, oda sıcaklığında kuruyana kadar santrifüj buharlaştırma ile çıkarılır.
   NOT: Kuru numuneler en fazla 12 ay süreyle 4-6 ° C'de saklanabilir.

4. Karaciğer dokusundan Sialik Asitlerin İzolasyonu

1. 20-50 mg fare karaciğeri yavaşça çözündürün ve bir Dounce doku öğütücüsüne (1 mL veya 2 mL hacim) aktarın. 1.2 mL sulu asetik asit çözeltisiAdım 3.1'de hazırlanan ve dokuyu 10 saniye boyunca hafifçe keserek homojenize edin. Nihai süspansiyon 1.5 mL santrifüj tüpüne aktarılır.
2. Adımları takip edin 3.3. 3.6'ya kadar.
   NOT: Kuru numuneler en fazla 12 ay süreyle 4-6 ° C'de saklanabilir.

5. Karışık bir Sialik Asit Standardının Hazırlanması

1. Analitik bir balansda 1-5 mg santrifüj tüpüne 5-8 mg N-asetilnöraminik asit tartılır. Kesin ağırlık not edin ve her mg için damıtılmış _H2O 164 mcL (yani Neu5Ac ağırlığı 7.2 mg, sonra 7.2 = 1 x 164, damıtılmış _H2O 181 mcL ise). Bu, -20 ° C'de 12 aya kadar depolanabilen 20 mM Neu5Ac stok solüsyonuyla sonuçlanır.
2. N-glikolneukaminik asit, 1 mg'lık alikotlar gibi orta bir fiyatla daha küçük miktarlarda alın. Bir ~ 20 mM Neu5Gc stok solüsyonu elde etmek üzere bileşik ₂ O direkt olarak distile H 154 uL ekleyin. AktarınSolüsyonu 1.5 mL'lik santrifüj tüpüne eklenir. Bu çözüm -20 ° C'de 12 aya kadar depolanabilir.
3. Adım 5.1 ve 5.2'deki her stok solüsyondan 5 μL, taze bir 1.5 mL santrifüj tüpüne birleştirin ve kuruyana kadar oda sıcaklığında santrifüj buharlaştırarak çözücü çıkartın.
   NOT: Karışık sialik asit standardı 4 - 6 ° C'de 12 aya kadar depolanabilir.

6. Sialik Asitlerin Flüoresan Türetilmesi

1. O-fenilendiamin 100 mg ve 10 ml sodyum hidrojen sülfit 208 mg oluşan 10 ml OPD-solüsyonunun hazırlanması _H2O damıtılmış
2. Fare sütünün (adım 3), fare karaciğeri (adım 4) veya karışık sialik asit standardından (adım 5) türetilmiş sialik asit örneklerine 20 μL OPD çözeltisi ekleyin. 30 saniye boyunca şiddetle girdap edin ve örnekleri karanlıkta 80 ° C'de 4 saat inkübe edin ( yani mikro tüpleri alüminyum folyoya sarın).
3. Örnekleri 5 dakika soğumaya bırakın, 80 μ ekleyinDamıtık _H2O L ve 1 dakika boyunca 14,000 x g'de santrifüj tüpleri.
4. Süpernatandan 80 μL, 300 μL'lik yüksek kurtarma HPLC şişesine aktarın. Türetilmiş sialik asit örnekleri, bir haftaya kadar 4-6 ° C'de saklanabilir.

7. Sialik Asit Türevlerinin HPLC Analizi

1. Çevrimiçi flüoresan dedektörüne bağlı standart bir HPLC sistemi kullanarak numuneleri analiz edin.
2. Analiz için 250 mm uzunluğunda ve 4.6 mm çaplı standart boyutlara sahip ters faz C18 sütun kullanın.
3. 200 mL stok solüsyonunu 800 mL LCMS dereceli su (LCMS - sıvı kromatografi kütle spektrometresi) ile seyrelterek solvent A hazırlayın. Stok çözeltisinin kendisi aşağıdaki gibi hazırlanabilir:
   1. LCMS dereceli _H2O 800 mL formik asidin 46 g 'ekleme
   2. Damla damla amonyum hidroksit çözeltisi (puriss. Pa) ilave ederek pH'ı 4.5'e ayarlayın.
   3. Solventi birLCMS dereceli H ₂ O ile 1000 mL'ye kadar doldurun. Bu stok çözeltisi 4 - 6 ° C'de 3 aya kadar depolanabilir.
4. B çözücüsü için LCMS dereceli asetonitril kullanın.
5. Sialik asit türevlerini 1 mL / dakika akış oranında aşağıdaki gradyanlı elüsyon ile ayırın:
   1. Önce çözücü A'ya karıştırılmış B çözücüsü% 10 eklenerek başlanmalıdır.
   2. 0 dakikadan 15 dakikaya kadar, solvent B oranını yavaşça doğrusal bir gradyanla% 60'a yükseltin.
   3. 15 dakika ila 16 dakika arasında, solvent B oranını% 60 ila% 90 arasında doğrusal bir gradyanla hızla arttırın. Bu, HPLC kolonunun yıkanmasını başlatır.
   4. HPLC sütununu daha da yıkamak için, 18 dakika ile 19 dakika arasında çözücünün B düzeyini% 10'a kadar kademeli olarak düşürmeden önce, çözücünün B seviyesini 16 dakika ile 18 dakika arasında% 90 seviyesinde tutun.
   5. HPLC sütununu,% 19 B başlangıç ​​koşullarına 19 ila 24 dakika arasında yeniden dengeleyin.
6. İçinde50 μL numuneyi HPLC sistemine verin.
7. 373/448 nm floresan dedektör uyarma / emisyon dalga boylarını kullanarak eluentleri izleyin ve türevlendirilmiş sialik asitlerin yaklaşık tutma süreleri 9 dakika (Neu5Gc-OPD için) ve 10 dakika (Neu5Ac-OPD için) beklenebilir.
8. Neu5Ac (A _Neu5Ac ) ve Neu5Gc'nin (A _Neu5Gc ) floresan zirve bölgelerinden Neu5Gc'nin (F _Neu5Gc ) göreli miktarını aşağıdaki gibi hesaplayın: F _Neu5Gc [100] = 100 x A _Neu5Gc / (A _Neu5Ac + A _Neu5Gc ). Homozigot Cmah knock-out fare F _Neu5Gc'den süt ve karaciğer örnekleri% 0 olmalı, oysa heterozigot ve vahşi tip F _Neu5Gc değerleri fare yaşına ve doku türüne (2% Ve>% 90) ve beklenen hata marjları ±% 12'dir.

Sonuçlar

Tanımlanan analiz yönteminin şematik bir görünümü Şekil 1'de gösterilmiştir ve vahşi tip ve Cmah nakavt mutant farelerinin süt ve karaciğer numunelerinden sialik asitlerin izolasyonu ve bu bileşenlerin flüoresan türetilmesi ve HPLC analizini içerir. Şekil 2 ve Şekil 3 , homo- ve heterozigot nakavt Cmah farelerinden (- / - ve +/-) ve yabani tip farelerden süt...

Tartışmalar

Burada sunulan protokol, süt ve karaciğer numunelerinin Neu5Gc nispi miktarlarını analiz ederek ve nicelleştirerek homozigot Cmah nakavt farelerinin fenotipik değerlendirmesini sağlar. Analiz, floresans algılama özelliğine sahip standart bir HPLC ayarı kullanılarak gerçekleştirildi. Bu prosedürün en kritik basamağı, anyon değişim sütunlarının hazırlanması ve anyon değişim kromatografisinin uygulanmasıdır; Reçineyi düzgün şekilde çöktürmek ve doğru yıkama ve elüsyon paylar?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals:
N-acetylneuraminic acid	Sigma	A0812
N-glycolylneuraminic acid	Sigma	50644	1 mg aliquot should be sufficient
o-Phenylenediamine	Sigma	694975
Sodium hydrogen sulfite	J&K Scientific Ltd	75234
Tools/Materials:
3 mL SPE tubes	Supelco	Sigma 57024	empty solid phase extraction columns
Luer stopcock	Sigma	S7396	to stop the flow of the SPE tube
Dowex 1X8	Dow Chemicals	Sigma 44340	200-400 mesh
Dounce tissue grinder	Sigma	D8938	tight fit
HPLC Analysis:
High-recovery HPLC vial	Agilent Technologies	#5188-2788
HPLC System	Shimadzu	Nexera
Fluorescence Detector for HPLC	Shimadzu	RF-20Axs
HPLC Column	Phenomenex	Hyperclone ODS	250x4.6 mm
LCMS-grade H2O	Merck Millipore	#WX00011
LCMS-grade Acetonitrile	Merck Millipore	#100029	Hypergrade
Ammonium hydroxide solution	Fluka	#44273	puriss. P.a.