Determinazione degli acidi sialici nei campioni di fegato e latte di tipo selvatico e<em&gt; CMAH</em&gt; Mouse Knock-out.

Riepilogo

Descriviamo un metodo basato su HPLC per la determinazione dell'acido N-acetilneuraminico e dell'acido N-glicolilenraminico nel fegato e nel latte del topo.

Abstract

CMAH (idrossilasi di citidina monofosfato-N-acetilneuraminico idrossilasi) è responsabile dell'ossidazione degli acidi citidina monofosfato-N-acetilneuraminico nei mammiferi. Tuttavia, l'uomo non può ossidare l'acido di citidina monofosfato-N-acetilneuraminico a acido citidico monofosfato-N-glicolico-neuraminico a causa di una delezione primaria di esone del gene CMAH . Per comprendere in modo più approfondito gli effetti e le implicazioni della mancanza di attività CMAH , il modello Cmah in topi è di grande interesse per la ricerca di base e applicata. Il metodo di analisi per determinare il fenotipo di questo modello di topo è qui descritto in dettaglio e si basa sulla rilevazione dell'acido N-acetilneuraminico e dell'acido N-glicolenuraminico nel fegato e nel latte di topi di tipo selvatico e Cmah . Gli acidi sialici endogeni vengono liberati e derivatizzati con o-fenilendiammina per generare derivati ​​fluorogenici, che possono essere successivamente analizzati mediante HPLC. Il protocollo presentato può essereAnche applicato per l'analisi di campioni di latte e tessuti provenienti da varie altre origini e può essere utile per indagare gli effetti nutrizionali e sanitari dell'acido N-glycolylneuraminic.

Introduzione

L'acido N-acetilneuraminico (Neu5Ac) e l'acido N-glycolylneuraminic (Neu5Gc) sono gli acidi sialici più comuni nella maggior parte dei mammiferi ¹ . Sebbene in grado di sintetizzare Neu5Ac in modo endogeno, gli esseri umani non sono in grado di produrre Neu5Gc a causa di una delezione primaria dell'esone sul gene CMAH che codifica per una CMP-Neu5Ac idrossilasi ^{2 , 3} . Tuttavia, i prodotti alimentari a base di animali possono essere fonti dietetiche di Neu5Gc ^{4 , 5 , 6} , che portano alla produzione di anticorpi anti-Neu5Gc e quindi attivano una risposta immunitaria nei confronti di Neu5Gc ⁷ . Si sospetta che questo effetto dietetico di Neu5Gc contribuisca all'infiammazione cronica e alle varie malattie ^{8 , 9 , 10} . Per comprendere in modo completo gli effetti di Neu5Gc in hUmani, un modello animale per lo studio sistematico degli effetti degli acidi sialici alimentari è molto auspicabile. Anche se i protocolli basati sulla reazione a catena polimerica (PCR) per l'analisi dei topi knock-out sono ben stabiliti e un modo pratico per la valutazione genotipica, l'analisi funzionale del fenotipo a livello metabolico richiede metodi di analisi più specifici. Il fenotipo di un modello di topo knock-out Cmah può essere valutato isolando e analizzando la composizione degli acidi sialici nei campioni di fegato o di latte. Diversi metodi per la rilevazione di acidi sialici nei tessuti animali sono stati riportati in precedenza: la reazione degli acidi sialici con resorcinolo ¹¹ o acido tiobarbiturico ¹² determina la formazione di un prodotto cromoforico e può essere semplicemente analizzato utilizzando un setup basato su platereader, ma solo il totale sialico Può essere determinato il contenuto di acido. In alternativa, l'analisi degli acidi sialici è stata descritta anche utilizzando gas cromatografia¹³ , spettrometria di massa MALDI-ToF ¹⁴ o metodi amperometrici ¹⁵ . Tuttavia, i metodi di analisi dell'acido sialico più comunemente applicati sono basati sul rilascio idrolitico, seguito da derivatizzazione fluorescente e successiva cromatografia liquida ad alta prestazione ^{16 , 17 , 18} .

Protocollo

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal comitato etico del Centro sperimentale animale dell'Università agricola di Nanjing in conformità alle linee guida nazionali per il benessere degli animali sperimentali (Ministero della scienza e della tecnologia, PR della Cina, 2006) con gli animali alloggiati in un SPF (ID di autorizzazione: SYXK-J-2011-0037).

1. Modello del mouse di Knock-out Cmah

1. Usa i topi selvatici C57Bl / 6 dal Centro di Medicina Comparativa dell'Università di Yangzhou (Cina).
   NOTA: CMAH topi knock-out sono stati generati sulla base delle informazioni fornite dai precedenti CMAH studi knock-out ^{17, 19} e ottenuti commercialmente utilizzando un CRISPR / Cas9 ²⁰ strategia rimuovendo 92 coppie di basi dal esone 6 del gene CMAH, anch'esso Cancellati nel gene umano CMAH ¹⁹ . Positivo F _{0 <}/ sub> -mice (2 persone) sono stati incrociati con topi di tipo selvatico avere eterozigoti F ₁ -mice. Dopo aver attraversato eterozigoti F ₁ -mice (5 persone), omozigote CMAH knock-out F ₂ -mice potrebbe essere ottenuta con successo (3 persone).
2. Eseguire la genotipizzazione dei topi usando il DNA genomico secondo il metodo mostrato da Zangala ²¹ utilizzando un kit di purificazione del DNA commerciale.
   1. Amplificare un corrispondente frammento di DNA del gene Cmah utilizzando la commercializzazione di DNA polimerasi e la coppia di primari 5'gaaagggctcggctctgtatgaa3 'e 5'tttaaaaggctccggggtgagaagc3'. Eseguire l'amplificazione genica utilizzando 34 cicli PCR costituiti da denaturazione a 94 ° C per 40 s, ricottura a 63 ° C per 40 s e allungamento a 72 ° C per 1 min.
   2. Visualizzare i prodotti PCR su un gel agarosico del 1%. Bisogna osservare una singola banda (0,5 kb) per l'individuo di tipo selvaggio, una doppia banda (0,4 e 0,5 kb) perIndividuo eterozigotico, e una singola banda (0,4 kb) per l'individuo omogeneo di knock-out.

2. Raccolta del campione

1. Raccogliere il latte del topo utilizzando il protocollo descritto da Willingham et al. ²² .
2. Raccogliere il tessuto epatico del topo utilizzando il protocollo descritto da Gonçalves et al. ²³ e conservare i campioni a -80 ° C.

3. Isolamento di Acidi Sialici dal latte

1. Preparare 100 mL di una soluzione di acido acetico da 2 M aggiungendo 12 mL di acido acetico glaciale in 88 mL di H ₂ O distillato.
2. Trasferire 50 μL di latte in un tubo di centrifuga da 1,5 ml e aggiungere 1,2 ml della soluzione di acido acetico acquoso preparato.
3. Incubare la sospensione per 4 ore a 80 ° C e centrifugare il campione a 14.000 xg per 10 min.
4. Trasferire i primi 1.000 μL del supernatante in un nuovo tubo di centrifuga da 1.5 ml e rimuovereOve il solvente per evaporazione centrifuga a temperatura ambiente per completare la secchezza (a seconda della pompa vuoto attaccata, questo richiede 4 - 20 h). Riapplicare il campione in 500 μl di H ₂ O distillato.
5. Preparare una colonna di scambio di microanion. Questa fase arricchirà specificamente i composti anionici e rimuove i composti cationici e neutrali dal campione di latte e fegato e aumenta quindi la selettività dell'agente di etichettatura OPD fluorogenica per la derivatizzazione dell'acido sialico.
   1. Trasferire per ciascun campione 200 mg della resina di scambio anionico (Dowex 1X8) in tubi vuoto di colonna 3 mL con un rubinetto di fissaggio fissato.
   2. Aggiungere 2 ml della soluzione acquosa acquosa acetica preparata nel punto 3.1 per sostituire gli ioni cloruri nella resina con gli ioni acetato. Chiudere il rubinetto non appena il solvente raggiunge la parte superiore della resina.
   3. Aggiungere delicatamente 2 ml di H ₂ O distillato, aprire il rubinetto e fermare il flusso non appena la maggior parte del solvente raggiungeLa parte superiore della resina. Assicurarsi che la resina sia sempre coperta con solvente.
   4. Lavare la colonna di resina ancora due volte con 2 ml di H ₂ O distillato per rimuovere l'acetato in eccesso.
6. Trasferire il risultante 500 μL di solvente del campione dal punto 3.4. Sulla colonna della resina e scartare il flusso. Lavare delicatamente la resina con 2 mL di H _{2 O} distillata O. Eluire gli anioni del campione dalla resina utilizzando 1 ml di una soluzione di acetato di ammonio 50 mM (386 mg di acetato di ammonio sciolti in 100 mL di acqua distillata H ₂ O) in 1,5 mL Tubo di centrifuga. Togliere il solvente con evaporazione centrifuga a temperatura ambiente a secchezza.
   NOTA: I campioni asciutti possono essere conservati a 4-6 ° C per un massimo di 12 mesi.

4. Isolamento di Acidi Sialici dalla Tissue Fegato

1. Scongelare delicatamente 20-50 mg di fegato del topo e trasferirlo in un macinatore di tessuto Dounce (1 mL o 2 mL di volume). Aggiungere 1,2 ml della soluzione di acido acetico acquosoPreparato nel punto 3.1 e omogeneizzare il tessuto mediante una leggera cesoia per 10 s. Trasferire la sospensione risultante in un tubo da centrifuga da 1,5 ml.
2. Seguire i passaggi 3.3. A 3.6.
   NOTA: I campioni asciutti possono essere conservati a 4-6 ° C per un massimo di 12 mesi.

5. Preparazione di uno standard acido sialico mista

1. Ponderate fra 5 e 8 mg di acido N-acetilneuraminico in un equilibrio analitico in un tubo da centrifuga da 1,5 ml. Si noti il peso esatto e aggiungere 164 ml di H _{2 O} distillata O per ogni mg (cioè se il peso del Neu5Ac è di 7,2 mg quindi aggiungere 7,2 x 164 = 1, 181 ml di acqua distillata H ₂ O). Ciò comporta una soluzione di 20 mM Neu5Ac che può essere conservata a -20 ° C per un massimo di 12 mesi.
2. Ottenere l'acido N-glycolylneuraminic in quantità minori a un prezzo moderato come in 1 mg aliquote. Aggiungere 154 μL di H ₂ O distillato direttamente al composto per ottenere una soluzione di maglia di ~ 20 mM Neu5Gc. TrasferisciSoluzione in un tubo da centrifuga da 1,5 ml. Questa soluzione può essere conservata a -20 ° C per un massimo di 12 mesi.
3. Combinare 5 μL da ciascuna soluzione di scorta da punto 5.1 e 5.2 in un nuovo tubo da centrifuga da 1,5 ml e rimuovere il solvente con evaporazione centrifuga a temperatura ambiente a secchezza.
   NOTA: Lo standard di acido sialico miscelato può essere conservato a 4 - 6 ° C per un massimo di 12 mesi.

6. Derivazione della fluorescenza degli Acidi Sialici

1. Preparare 10 ml di OPD-soluzione, costituita da 100 mg di o-fenilendiammina e 208 mg di idrogeno solfito di sodio in 10 ml di H ₂ O. distillata
2. Aggiungere 20 μL di soluzione OPD ai campioni di acido sialico derivato dal latte del topo (fase 3), dal fegato del topo (fase 4) o nello standard acido sialico standard (fase 5). Vorticare vigorosamente per 30 s e incubare i campioni per 4 ore a 80 ° C al buio ( cioè avvolgere i microtubi in foglio di alluminio).
3. Lasciare raffreddare i campioni per 5 min, aggiungere 80 μ; L di H ₂ O distillata e centrifugare i tubi a 14.000 xg per 1 min.
4. Trasferire 80 μl dal supernatante in un flacone HPLC ad alta reazione da 300 μL. I campioni di acido sialico derivatizzato possono essere conservati a 4 - 6 ° C per una settimana.

7. Analisi HPLC di derivati ​​acido sialico

1. Analizzare i campioni utilizzando un sistema HPLC standard collegato a un rilevatore di fluorescenza online.
2. Utilizzare una colonna C18 di fase inversa con le dimensioni standard di 250 mm di lunghezza e di 4,6 mm di diametro per l'analisi.
3. Preparare il solvente A dilutando 200 mL di soluzione di magazzino con 800 mL di acqua di LCMS (LCMS - spettrometria di massa cromatografica liquida). La soluzione stessa può essere preparata come segue:
   1. Aggiungere 46 g di acido formico a 800 mL di LCMS-grado H ₂ O.
   2. Regolare il pH a 4,5 aggiungendo in goccia l'idrossido di ammonio (purissima pa).
   3. Trasferire il solvente aMisurare il cilindro e riempire fino a 1.000 mL con LCMS-grado H ₂ O. Questa soluzione di magazzino può essere conservata a 4 - 6 ° C per un massimo di 3 mesi.
4. Per il solvente B, utilizzare acetonitrile di grado LCMS.
5. Separare i derivati ​​degli acidi sialici a una portata di 1 mL / min con la seguente eluizione di gradiente:
   1. Inizia l'aggiunta del 10% del solvente B miscelato al solvente A.
   2. Da 0 min a 15 min aumenta gradualmente la percentuale di solvente B con un gradiente lineare al 60%.
   3. Da 15 minuti a 16 min, aumentare rapidamente la percentuale di solvente B con un gradiente lineare dal 60 al 90%. Questo inizia il lavaggio della colonna HPLC.
   4. Per lavare ulteriormente la colonna HPLC, mantenere il livello del solvente B al 90% tra 16 min e 18 min prima di gradualmente ridurre il livello del solvente B al 10% tra 18 min e 19 min.
   5. Riqualificare la colonna HPLC alle condizioni di partenza del 10% B tra 19 e 24 min.
6. In50 μL di campione nel sistema HPLC.
7. Monitorare gli eluenti utilizzando le lunghezze d'onda di eccitazione / emissione di rilevatore di fluorescenza di 373/448 nm e gli acidi sialici derivatizzati possono essere previsti a tempi di ritenzione approssimativi di 9 minuti (per Neu5Gc-OPD) e 10 min (per Neu5Ac-OPD).
8. Calcolare la quantità relativa di Neu5Gc (F _Neu5Gc ) dalle aree di picco di fluorescenza del Neu5Ac (A _Neu5Ac ) e Neu5Gc (A _Neu5Gc ) come segue: F _Neu5Gc [%] = 100 × A _Neu5Gc / (A _Neu5Ac + A _Neu5Gc ). Nel caso dei campioni di latte e di fegato dal omozigote topo knock-out CMAH F _Neu5Gc dovrebbe essere 0%, mentre i valori di F _Neu5Gc di topi eterozigoti e wild-type possono variare ampiamente a seconda dell'età del mouse e tipo di tessuto (tra 2% E> 90%) con margini di errore previsti di ± 12%.

Risultati

Una panoramica schematica del metodo di analisi descritto è mostrato nella figura 1 e comprende l'isolamento di acidi sialici da campioni di fegato di latte e fegato di topi mutanti topi di tipo selvatico e Cmah , e la derivatizzazione fluorescente e l'analisi HPLC di questi componenti. Le figure 2 e 3 illustrano cromatogrammi HPLC rappresentativi di a...

Discussione

Il protocollo qui presentato consente di valutare fenotipicamente i topi omotigmatici di Cmah knock-out analizzando e quantificando le quantità relative di Neu5Gc di campioni di latte e fegato. L'analisi è stata eseguita utilizzando una configurazione standard HPLC con rilevazione di fluorescenza. La fase più critica di questa procedura è la preparazione delle colonne di scambio anionico e l'esecuzione della cromatografia per l'anione; Per sistemare correttamente la resina e per raccogl...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals:
N-acetylneuraminic acid	Sigma	A0812
N-glycolylneuraminic acid	Sigma	50644	1 mg aliquot should be sufficient
o-Phenylenediamine	Sigma	694975
Sodium hydrogen sulfite	J&K Scientific Ltd	75234
Tools/Materials:
3 mL SPE tubes	Supelco	Sigma 57024	empty solid phase extraction columns
Luer stopcock	Sigma	S7396	to stop the flow of the SPE tube
Dowex 1X8	Dow Chemicals	Sigma 44340	200 - 400 mesh
Dounce tissue grinder	Sigma	D8938	tight fit
HPLC Analysis:
High-recovery HPLC vial	Agilent Technologies	#5188-2788
HPLC System	Shimadzu	Nexera
Fluorescence Detector for HPLC	Shimadzu	RF-20Axs
HPLC Column	Phenomenex	Hyperclone ODS	250 x 4.6 mm
LCMS-grade H2O	Merck Millipore	#WX00011
LCMS-grade Acetonitrile	Merck Millipore	#100029	Hypergrade
Ammonium hydroxide solution	Fluka	#44273	puriss. P.a.