Bestimmung von Sialinsäuren in Leber- und Milchproben von Wildtyp und<em&gt; CMAH</em&gt; Knock-out Mäuse.

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein HPLC-basiertes Verfahren zur Bestimmung von N-Acetylneuraminsäure und N-Glykolylenuraminsäure in Mausleber und Milch.

Zusammenfassung

CMAH (Cytidinmonophosphat-N-acetylneuraminsäure-hydroxylase) ist verantwortlich für die Oxidation von Cytidinmonophosphat-N-acetylneuraminsäuren bei Säugetieren. Jedoch kann der Mensch Cytidinmonophosphat-N-acetylneuraminsäure nicht zu Cytidinmonophosphat-N-glykolylneuraminsäure aufgrund einer primären Exon-Deletion des CMAH- Gens oxidieren. Um die Effekte und Implikationen des Mangels an CMAH-Aktivität genauer zu verstehen, ist ein Cmah- Knock-out-Modell bei Mäusen von großem Interesse an Grund- und angewandter Forschung. Das Analyseverfahren zur Bestimmung des Phänotyps dieses Mausmodells wird hier im Detail beschrieben und basiert auf dem Nachweis sowohl der N-Acetylneuraminsäure als auch der N-Glykolylenuraminsäure in der Leber und der Milch von Wildtyp- und Cmah- Knock-out-Mäusen. Endogene Sialinsäuren werden freigesetzt und mit o-Phenylendiamin derivatisiert, um fluorogene Derivate zu erzeugen, die anschließend mittels HPLC analysiert werden können. Das vorgestellte Protokoll kann seinAuch für die Analyse von Milch und Gewebeproben aus verschiedenen anderen Ursprüngen angewendet und kann von Nutzen sein, um die ernährungs- und gesundheitlichen Auswirkungen von N-Glykolylneuraminsäure zu untersuchen.

Einleitung

N-Acetylneuraminsäure (Neu5Ac) und N-Glykolylneuraminsäure (Neu5Gc) sind die häufigsten Sialinsäuren bei den meisten Säugetieren ¹ . Obwohl es in der Lage ist, Neu5Ac endogen zu synthetisieren, sind die Menschen nicht in der Lage, Neu5Gc aufgrund einer primären Exon-Deletion auf dem CMAH- Gen, das für eine CMP-Neu5Ac-Hydroxylase ^{2 , 3} kodiert ^{, zu produzieren} . Allerdings können tierische Lebensmittelprodukte diätetische Quellen von Neu5Gc ^{4 , 5 , 6 sein} , was zur Herstellung von Anti-Neu5Gc-Antikörpern führt und daher eine Immunantwort gegen Neu5Gc ⁷ auslöst. Diese diätetische Wirkung von Neu5Gc wird vermutlich zur chronischen Entzündung und verschiedenen anderen Krankheiten beitragen ^{8 , 9 , 10} . Um die Wirkungen von Neu5Gc in h zu verstehenUmans, ein Tiermodell für die systematische Untersuchung der Wirkungen von lebensmittelhaltigen Sialinsäuren ist höchst wünschenswert. Obwohl die auf der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basierenden Protokolle zur Analyse von Knock-out-Mäusen gut etabliert sind und ein bequemer Weg für die genotypische Beurteilung ist, erfordert die funktionelle Analyse des Phänotyps auf dem metabolischen Niveau spezifischere Analysemethoden. Der Phänotyp eines Cmah- Knock-out-Mausmodells kann durch Isolierung und Analyse der Zusammensetzung von Sialinsäuren in Leber- oder Milchproben beurteilt werden. Mehrere Verfahren zum Nachweis von Sialinsäuren in tierischen Geweben wurden bisher beschrieben: Die Umsetzung von Sialinsäuren mit Resorcin ¹¹ oder Thiobarbitursäure ¹² führt zur Bildung eines chromophoren Produktes und kann einfach unter Verwendung eines plateraderbasierten Aufbaus analysiert werden, aber nur das gesamte Sialis Säuregehalt kann bestimmt werden. Alternativ wurde auch die Analyse von Sialinsäuren mittels Gaschromatographie beschrieben¹³ , MALDI-ToF-Massenspektrometrie ¹⁴ oder amperometrische Methoden ¹⁵ . Die am häufigsten angewandten Sialinsäureanalyseverfahren basieren jedoch auf der hydrolytischen Freisetzung, gefolgt von der Fluoreszenzderivatisierung und der nachfolgenden Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ^{16 , 17 , 18} .

Protokoll

Verfahren, die Tierfächer betreffen, wurden vom Ethischen Komitee des Experimentellen Tierzentrums der Nanjing Agricultural University im Einklang mit den nationalen Richtlinien für das experimentelle Tierschutz (Ministerium für Wissenschaft und Technologie, PR von China, 2006) mit den Tieren, die in einem SPF untergebracht wurden, genehmigt (Berechtigungs-ID: SYXK-J-2011-0037).

1. Cmah Knock-out Maus Modell

1. Verwenden Sie Wildtyp-C57Bl / 6-Mäuse aus dem Vergleichsmedizinzentrum der Universität von Yangzhou (China).
   HINWEIS : Cmah- Knock-out-Mäuse wurden basierend auf den Informationen aus früheren Cmah- Knock-out-Studien ^{17 , 19 erstellt} und kommerziell unter Verwendung einer CRISPR / Cas9 ^20- Strategie gewonnen, indem 92 Basenpaare aus Exon 6 des Cmah- Gens entfernt wurden, was ebenfalls der Fall ist Deletiert im menschlichen CMAH- Gen ¹⁹ . Positiv F _{0 <}/ sub> -mice (2 Personen) wurden mit Wildtyp - Mäusen gekreuzt heterozygot F ₁ -mice zu erhalten. Nach dem Überqueren von heterozygoten F ₁ -Mäuse (5 Individuen) konnte man homozygote Cmah- Knock-out-F ₂ -Mäuse erfolgreich erhalten (3 Individuen).
2. Führen Sie die Genotypisierung von Mäusen mit genomischer DNA nach dem von Zangala ²¹ gezeigten Verfahren unter Verwendung eines kommerziellen DNA-Reinigungskits durch.
   1. Verstärken Sie ein entsprechendes DNA-Fragment des Cmah- Gens unter Verwendung von kommerzieller DNA-Polymerase und dem Primerpaar 5'gaaagggctcggctctgtataa '' und 5'tttaaatertcccgggtgagaagc3 '. Führen Sie die Genamplifikation unter Verwendung von 34 PCR-Zyklen aus, die aus einer Denaturierung bei 94 ° C für 40 s, einem Glühen bei 63 ° C für 40 s und einer Dehnung bei 72 ° C für 1 min bestehen.
   2. Visualisierung von PCR-Produkten auf einem 1% Agarosegel. Man sollte ein einzelnes Band (0,5 kb) für das Wildtyp-Individuum, ein Doppelband (0,4 und 0,5 kb) für dieHeterozygoten Knock-out-Individuum und ein einziges Band (0,4 kb) für das homozygote Knock-out-Individuum.

2. Probenahme

1. Sammeln Sie die Mausmilch mit dem von Willingham et al. ²²
2. Sammle das Mauslebergewebe mit dem von Gonçalves et al. Beschriebenen Protokoll . ²³ und Proben bei -80 ° C aufbewahren.

3. Isolierung von Sialinsäuren aus Milch

1. 100 ml einer 2 M Essigsäurelösung durch Zugabe von 12 ml Eisessig in 88 ml destilliertem H ₂ O zubereiten.
2. 50 μl Milch in ein 1,5 mL Zentrifugenröhrchen geben und 1,2 ml der vorbereiteten wässrigen Essigsäurelösung zugeben.
3. Inkubieren Sie die Suspension für 4 h bei 80 ° C und zentrifugieren Sie die Probe bei 14.000 xg für 10 min.
4. Übertragen Sie die obersten 1.000 μl des Überstandes in ein frisches 1,5 mL Zentrifugenröhrchen und remDas Lösungsmittel durch Zentrifugalverdampfung bei Raumtemperatur abkühlen lassen, um die Trockenheit zu beenden (abhängig von der angeschlossenen Vakuumpumpe dauert dies 4 - 20 h). Die Probe in 500 μl destilliertem H ₂ O auflösen.
5. Bereiten Sie eine Mikroanionenaustauschersäule vor. Dieser Schritt wird spezifisch anionische Verbindungen anreichern und kationische und neutrale Verbindungen aus den Milch- und Leberproben entfernen und damit die Selektivität des fluorogenen OPD-Markierungsmittels für die Sialinsäurederivatisierung erhöhen.
   1. Übertragen Sie für jede Probe 200 mg des Anionenaustauscherharzes (Dowex 1X8) in leere 3 mL Säulenröhrchen mit einem angehängten Hahn.
   2. Man gibt 2 ml der in Schritt 3.1 hergestellten wässrigen Essigsäurelösung zu, um die Chloridionen im Harz mit Acetat-Ionen zu ersetzen. Schließen Sie den Hahn, sobald das Lösungsmittel die Oberseite des Harzes erreicht.
   3. Fügen Sie 2 ml destilliertes H ₂ O vor, öffnen Sie den Hahn und stoppen Sie den Fluss, sobald der Großteil des Lösungsmittels erreicht istDie Oberseite des Harzes. Stellen Sie sicher, dass das Harz immer mit Lösungsmittel bedeckt ist.
   4. Die Harzsäule zwei weitere Male mit 2 ml destilliertem H ₂ O zum Entfernen des überschüssigen Acetats waschen.
6. Übertragen Sie die resultierenden 500 μl Probenlöser aus Schritt 3.4. Auf die Harzsäule auftragen und den Durchfluss verwerfen. Das Harz mit 2 ml destilliertem H ₂ O vorsichtig waschen. Die Probenanionen aus dem Harz unter Verwendung von 1 ml einer 50 mM Ammoniumacetatlösung (386 mg Ammoniumacetat, gelöst in 100 ml destilliertem H ₂ O) in ein 1,5 ml eluieren Zentrifugenröhrchen. Entfernen Sie das Lösungsmittel durch Zentrifugalverdampfung bei Raumtemperatur bis zur Trockenheit.
   HINWEIS: Trockene Proben können bei 4-6 ° C für bis zu 12 Monate gelagert werden.

4. Isolierung von Sialinsäuren aus Lebergewebe

1. Vorsicht 20 - 50 mg Mausleber auftauen und in eine Dounce - Gewebemühle (1 ml oder 2 ml Volumen) überführen. Zugabe von 1,2 ml der wässrigen EssigsäurelösungHergestellt in Schritt 3.1 und homogenisieren das Gewebe durch sanfte Scherung für 10 s. Die erhaltene Suspension in ein 1,5 mL Zentrifugenröhrchen überführen.
2. Folgen Sie den Schritten 3.3. Auf 3,6.
   HINWEIS: Trockene Proben können bei 4-6 ° C für bis zu 12 Monate gelagert werden.

5. Vorbereitung eines gemischten Sialinsäure-Standards

1. Wiegen zwischen 5 - 8 mg N-Acetylneuraminsäure auf einem analytischen Gleichgewicht in ein 1,5 mL Zentrifugenröhrchen. Man beachte das genaue Gewicht und füge 164 μl destilliertes H ₂ O für jede mg hinzu ( dh wenn das Gewicht von Neu5Ac 7,2 mg beträgt, dann 7,2 x 164 = 1, 181 μl destilliertes H ₂ O) zugeben. Daraus ergibt sich eine 20 mM Neu5Ac-Stammlösung, die bei -20 ° C für bis zu 12 Monate gelagert werden kann.
2. N-Glykolylneuraminsäure in kleineren Mengen zu einem moderaten Preis erhalten, wie in 1 mg Aliquoten. Füge 154 μl destilliertes H ₂ O direkt zu der Verbindung hinzu, um eine ~ 20 mM Neu5Gc-Stammlösung zu erhalten. Übertragen Sie dieLösung in ein 1,5 mL Zentrifugenröhrchen gegeben. Diese Lösung kann bei -20 ° C für bis zu 12 Monate gelagert werden.
3. Kombinieren Sie 5 μl aus jeder Stammlösung aus Schritt 5.1 und 5.2 in ein frisches 1,5 mL Zentrifugenröhrchen und entfernen Sie das Lösungsmittel durch Zentrifugalverdampfung bei Raumtemperatur bis zur Trockene.
   HINWEIS: Der gemischte Sialinsäurestandard kann bis zu 12 Monate bei 4 - 6 ° C gelagert werden.

6. Fluoreszenzderivatisierung von Sialinsäuren

1. Vorbereiten von 10 ml OPD-Lösung, bestehend aus 100 mg o-Phenylendiamin und 208 mg Natriumhydrogensulfit in 10 ml destilliertem H ₂ O.
2. Füge 20 μl OPD-Lösung zu den aus Mäusemilch gewonnenen Sialinsäureproben (Schritt 3), Mausleber (Schritt 4) oder dem gemischten Sialinsäurestandard (Schritt 5) hinzu. Vortex kräftig für 30 s und inkubieren Proben für 4 h bei 80 ° C im Dunkeln ( dh wickeln die Mikroröhrchen in Aluminiumfolie).
3. Lassen Sie die Proben 5 min abkühlen, fügen Sie 80 μ hinzu; L destilliertem H ₂ O und die Röhrchen bei 14000 × g für 1 min zentrifugiert.
4. Übertragen Sie 80 μl aus dem Überstand in eine 300 μl hochauflösende HPLC-Durchstechflasche. Die derivatisierten Sialinsäureproben können bis zu einer Woche bei 4 - 6 ° C gelagert werden.

7. HPLC-Analyse von Sialinsäurederivaten

1. Analysieren Sie die Proben mit einem Standard-HPLC-System, das mit einem Online-Fluoreszenzdetektor verbunden ist.
2. Verwenden Sie für die Analyse eine Umkehrphasen-C18-Säule mit den Standardabmessungen von 250 mm Länge und 4,6 mm Durchmesser.
3. Vorbereitung des Lösungsmittels A durch Verdünnen von 200 ml Stammlösung mit 800 ml LCMS-Wasser (LCMS - Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie). Die Stammlösung selbst kann wie folgt hergestellt werden:
   1. Füge 46 g Ameisensäure zu 800 ml LCMS-Klasse H ₂ O hinzu.
   2. Stellen Sie den pH-Wert auf 4,5 durch tropfenweise Zugabe von Ammoniumhydroxidlösung (pur. Pa) ein.
   3. Übertragen Sie das Lösungsmittel auf einMesszylinder und füllen bis zu 1.000 ml mit LCMS-Klasse H ₂ O. Diese Stammlösung kann bei 4 - 6 ° C für bis zu 3 Monate gelagert werden.
4. Für Lösungsmittel B, verwenden Sie LCMS-Grad Acetonitril.
5. Trennen Sie die Sialinsäurederivate bei einer 1 mL / min Fließgeschwindigkeit mit folgender Gradientenelution:
   1. Beginnen Sie mit der Zugabe von 10% des Lösungsmittels B, das dem Lösungsmittel A gemischt wurde.
   2. Von 0 min bis 15 min erhöht man allmählich den Anteil des Lösungsmittels B mit einem linearen Gradienten auf 60%.
   3. Von 15 min auf 16 min steigern schnell den Anteil an Lösungsmittel B mit einem linearen Gradienten von 60% bis 90%. Dies initiiert das Waschen der HPLC-Säule.
   4. Um die HPLC-Säule weiter zu waschen, halten Sie den Füllstand des Lösungsmittels B bei 90% zwischen 16 min und 18 min, bevor Sie den Füllstand des Lösungsmittels B wieder auf 10% zwischen 18 min und 19 min reduzieren.
   5. Die HPLC-Säule auf die Ausgangsbedingungen von 10% B zwischen 19 und 24 min re-equilibrieren.
6. Im50 μl Probe in das HPLC-System geben.
7. Überwachen Sie die Eluenten mit den Fluoreszenzdetektor-Anregungs- / Emissionswellenlängen von 373/448 nm und die derivatisierten Sialinsäuren können bei den ungefähre Retentionszeiten von 9 min (für Neu5Gc-OPD) und 10 min (für Neu5Ac-OPD) erwartet werden.
8. Berechnen Sie die relative Menge von Neu5Gc (F _Neu5Gc ) aus den Fluoreszenz-Peakflächen des Neu5Ac (A _Neu5Ac ) und Neu5Gc (A _Neu5Gc ) wie folgt: F _Neu5Gc [%] = 100 × A _Neu5Gc / (A _Neu5Ac + A _Neu5Gc ). Im Falle der Milch- und Leberproben aus der homozygoten Cmah- Knock-out-Maus sollte F _Neu5Gc 0% _betragen , während die Werte für F _Neu5Gc von heterozygoten und Wildtyp-Mäusen je nach _Mausalter und Gewebetyp stark variieren können (zwischen 2% Und> 90%) mit erwarteten Fehlerrändern von ± 12%.

Ergebnisse

Ein schematischer Überblick über das beschriebene Analyseverfahren ist in Abbildung 1 dargestellt und beinhaltet die Isolierung von Sialinsäuren aus Milch- und Leberproben von Wildtyp- und Cmah- Knockout-Mutanten-Mäusen sowie die Fluoreszenz-Derivatisierung und HPLC-Analyse dieser Komponenten. Abbildung 2 und Abbildung 3 zeigen repräsentative HPLC-Chromatogramme von derivatisierten Sia...

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll erlaubt die phänotypische Beurteilung von homozygoten Cmah- Knock-out-Mäusen durch Analysieren und Quantifizieren der relativen Mengen an Neu5Gc Milch und Leberproben. Die Analyse wurde unter Verwendung eines Standard-HPLC-Setups mit Fluoreszenzdetektion durchgeführt. Der wichtigste Schritt dieses Verfahrens ist die Herstellung der Anionenaustauschsäulen und die Durchführung der Anionenaustauschchromatographie; Um das Harz richtig zu regeln und die richtigen Wasch- und Eluti...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals:
N-acetylneuraminic acid	Sigma	A0812
N-glycolylneuraminic acid	Sigma	50644	1 mg aliquot should be sufficient
o-Phenylenediamine	Sigma	694975
Sodium hydrogen sulfite	J&K Scientific Ltd	75234
Tools/Materials:
3 mL SPE tubes	Supelco	Sigma 57024	empty solid phase extraction columns
Luer stopcock	Sigma	S7396	to stop the flow of the SPE tube
Dowex 1X8	Dow Chemicals	Sigma 44340	200-400 mesh
Dounce tissue grinder	Sigma	D8938	tight fit
HPLC Analysis:
High-recovery HPLC vial	Agilent Technologies	#5188-2788
HPLC System	Shimadzu	Nexera
Fluorescence Detector for HPLC	Shimadzu	RF-20Axs
HPLC Column	Phenomenex	Hyperclone ODS	250x4.6 mm
LCMS-grade H2O	Merck Millipore	#WX00011
LCMS-grade Acetonitrile	Merck Millipore	#100029	Hypergrade
Ammonium hydroxide solution	Fluka	#44273	puriss. P.a.