קביעת חומצות סיאליות בדגימות כבד וחלב של סוג הבר<em&gt; CMAH</em&gt; נוק- out עכברים.

Summary

אנו מתארים שיטה מבוססת HPLC לקביעת חומצה N-acetylneuraminic ו- N-glycolylenuraminic חומצה בכבד העכבר חלב.

Abstract

CMAH (cytidine monophosphate-N-Acetylneuraminic acid hydroxylase) הוא אחראי על החמצון של חומצות cytidine monophosphate-N- אצטילנורמין ב יונקים. עם זאת, בני אדם לא יכולים לחמצן cytidine monophosphate-N- חומצה אצטילנוראמית כדי cytidine monophosphate-N- חומצה glycolylneuraminic בשל מחיקת אקסון העיקרי של הגן CMAH . כדי להבין את ההשפעות ואת ההשלכות של חוסר פעילות CMAH בפירוט רב יותר, מודל Cmah לדפוק את העכברים הוא עניין רב במחקר בסיסי ויישומי. שיטת ניתוח כדי לקבוע את הפנוטיפ של מודל העכבר כאן הוא תיאר בפירוט, והוא מבוסס על זיהוי של שניהם חומצה N-acetylneuraminic ו- N-glycolylenuraminic חומצה בכבד וחלב של wild-type ו- Cmah לדפוק את העכברים. חומצות sialic אנדוגניים משתחררים ו derivatized עם o-phenylenediamine לייצר נגזרות fluorogenic, אשר ניתן לנתח לאחר מכן על ידי HPLC. הפרוטוקול המוצג יכול להיותחל גם על ניתוח של דגימות חלב ורקמות ממקורות שונים אחרים, והוא עשוי להיות שימוש כדי לחקור את התזונתיים ואת ההשפעות הבריאותיות של N-glycolylneuraminic חומצה.

Introduction

N-Acetylneuraminic חומצה (Neu5Ac) ו- N-glycolylneuraminic חומצה (Neu5Gc) הם חומצות sialic הנפוצים ביותר יונקים ¹ . למרות יכולת סינתזה Neu5Ac endogenously, בני אדם אינם מסוגלים לייצר Neu5Gc בשל מחיקת אקסון העיקרי על קידוד הגן CMAH עבור הידרוקסילאז CMP-Neu5Ac ^{2 , 3} . עם זאת, מוצרי מזון המבוססים על בעלי חיים יכולים להיות מקורות תזונתיים של Neu5Gc ^{4 , 5 , 6} , המוביל לייצור נוגדנים נוגדי Neu5Gc ולכן מפעיל תגובה חיסונית כלפי Neu5Gc ⁷ . השפעה זו תזונתית של Neu5Gc חשוד לתרום דלקת כרונית ומחלות שונות ^{8 , 9 , 10} . על מנת להבין את ההשפעות של Neu5Gc ב חUmans, מודל חיה עבור המחקר השיטתי של ההשפעות של חומצות סיאליות במזון הוא רצוי מאוד. למרות פרוטוקולים המבוססים על תגובת שרשרת פולימראז (PCR) לניתוח של נוק- out עכברים מבוססים היטב דרך נוחה להערכה genotypical, ניתוח פונקציונלי של פנוטיפ ברמה המטבולית דורש שיטות ניתוח ספציפי יותר. פנוטיפ של מודל Cmah לדפוק את העכבר ניתן להעריך על ידי בידוד וניתוח הרכב של חומצות sialic בדגימות כבד או חלב. מספר שיטות לאיתור חומצות סיאליות ברקמות בעלי חיים דווחו בעבר: תגובה של חומצות סיאליות עם רסורצינול ¹¹ או חומצה thiobarbituric ¹² לגרום להיווצרות של מוצר chromophoric וניתן פשוט ניתח באמצעות ההתקנה מבוסס platereader, אבל רק את סך sialic ניתן לקבוע תוכן חומצי. לחלופין, ניתוח של חומצות sialic תוארה גם באמצעות כרומטוגרפיה גז¹³ , MALDI-ToF ספקטרומטריית מסה ¹⁴ או שיטות אמפומטריות ¹⁵ . עם זאת, הנפוץ ביותר sialic החלים שיטות ניתוח מבוססים על שחרור hydrolytic, ואחריו derivatization פלואורסצנטי ואחריו ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית ^{16 , 17 , 18} .

Protocol

נהלים הקשורים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה האתית של המרכז החינוכי הניסויי של נאנג 'ינג האוניברסיטה החקלאית בהתאם להנחיות הלאומיות לרווחת בעלי חיים ניסיוני (משרד המדע והטכנולוגיה, יחסי ציבור של סין, 2006) עם בעלי החיים השוכן SPF מתקן (מזהה הרשאה: SYXK-J-2011-0037).

1. Cmah לדפוק את העכבר דגם

1. השתמש wild-type C57Bl / 6 עכברים מהמרכז הרפואי השוואתי של אוניברסיטת יאנגז 'ו (סין).
   הערה: Cmah לדפוק את העכברים נוצרו על סמך המידע שסופק מן Cmah הקודם לדפוק- out מחקרים ^{17 , 19} ו שהושגו מסחרית באמצעות אסטרטגיה CRISPR / Cas9 ^{20 על} ידי הסרת 92 זוגות זוג מן אקסון 6 של הגן Cmah , שהוא גם נמחק בגן CMAH האנושי ¹⁹ . חיובי F ₀/ Sub> -mice (2 אנשים) חצו עם עכברים מסוג בר כדי להשיג heterozygous F- ₁ עכבר. לאחר חציית F הטרוזיגוטיים F- ₁ (5 אנשים), הומוזיגיים Cmah לדפוק- F _2- עכברים ניתן להשיג בהצלחה (3 אנשים).
2. בצע genotyping של עכברים באמצעות DNA גנומי על פי השיטה המוצגת על ידי Zangala ²¹ באמצעות ערכת טיהור DNA מסחרי.
   1. להגביר את קטע ה- DNA המקביל של הגן Cmah באמצעות פולימראז דנ"א מסחרי ואת זוג primer 5'gaaagggctcggctctgtatgaa3 'ו 5'tttaaaatgtcccgggtgagaagc3'. בצע את הגברה הגן באמצעות 34 מחזורים PCR המורכב denaturation ב 94 מעלות צלזיוס במשך 40 s, חישול ב 63 מעלות צלזיוס במשך 40 שניות, התארכות ב 72 מעלות צלזיוס למשך 1 דקות.
   2. דמיינו מוצרים PCR על ג'ל agarose 1%. יש לצפות בלהקה בודדת (0.5 קילו-בייט) עבור האדם מסוג wild wild, פס כפול (0.4 ו -0.5 קילו-בייט) עבורהטרוזיגוסית, ולהקה בודדת (0.4 קילו-בייט) לאדם ההומו-ציגי.

2. אוסף דוגמאות

1. איסוף חלב עכבר באמצעות פרוטוקול המתואר על ידי Willingham et al. ²² .
2. איסוף רקמת הכבד העכבר באמצעות פרוטוקול המתואר על ידי Gonçalves et al. ²³ ו חנות דגימות ב -80 ° C.

3. בידוד של חומצות סיאליות מחלב

1. הכן 100 מ"ל של פתרון 2 חומצה אצטית M על ידי הוספת 12 מ"ל של חומצה אצטית קרחוני לתוך 88 מ"ל של מזוקק H ₂ O.
2. העברת 50 μL של חלב לתוך צינור 1.5 מ"ל צנטריפוגה להוסיף 1.2 מ"ל של תמיסת חומצה מימית מוכן.
3. לדגור את ההשעיה במשך 4 שעות ב 80 מעלות צלזיוס ו צנטריפוגה המדגם ב XG 14,000 במשך 10 דקות.
4. מעבירים את μL 1000 העליון של supernatant לתוך צינור צנטריפוגות טרי 1.5 מ"ל רםOve ממס על ידי אידוי צנטריפוגלי בטמפרטורת החדר כדי להשלים יובש (בהתאם משאבת ואקום המצורפת זה ייקח 4-20 שעות). Re- להמיס את המדגם μL 500 של מזוקקים H ₂ O.
5. הכן טור חילופי מיקרו אניון. שלב זה יהיה להעשיר תרכובות anionic במיוחד ולהסיר תרכובות קטיוני וניטרלי מן דגימות חלב וכבד, ולכן מגביר את הסלקטיביות של fluorogenic OPD סוכן תיוג עבור derivatization חומצה sialic.
   1. העברה עבור כל מדגם 200 מ"ג של שרף חילופי אניון (Dowex 1X8) לתוך צינורות ריק 3 מ"ל טור עם שסתום המצורפת.
   2. הוסף 2 מ"ל של תמיסת חומצה אצטית מימית מוכן בשלב 3.1 כדי להחליף את יוני כלור שרף עם יונים אצטט. סגור את שסתום ברגע ממס מגיע לראש שרף.
   3. בעדינות להוסיף 2 מ"ל של מזוקק H ₂ O, לפתוח את שסתום לעצור את הזרימה ברגע שרוב הממס מגיעהחלק העליון של השרף. ודא כי שרף תמיד מכוסה ממס.
   4. שטפו את שרף טור פעמיים נוספות עם 2 מ"ל של מזוקק H ₂ O להסרת עודף אצטט.
6. מעבירים את μL 500 וכתוצאה מכך ממס מדגם משלב 3.4. על העמוד שרף וזורקים את הזרימה דרך. בעדינות לשטוף את שרף עם 2 מ"ל של מזוקקים H ₂ O. Elute אניונים מדגם מן שרף באמצעות 1 מ"ל של פתרון 50 מ"מ אמוניום אצטט (386 מ"ג של אצטט אמוניום מומס 100 מ"ל של מזוקק H ₂ O) לתוך 1.5 מ"ל צינור צנטריפוגה. הסר את הממס על ידי אידוי צנטריפוגלי בטמפרטורת החדר ליובש.
   הערה: דגימות יבשות ניתן לאחסן על 4-6 מעלות צלזיוס למשך עד 12 חודשים.

4. בידוד של חומצות סיאליות מ רקמת כבד

1. בעדינות להפשיר 20 - 50 מ"ג של הכבד העכבר ולהעביר אותו לתוך מטחנת רקמה Dounce (1 מ"ל או 2 מ"ל של נפח). הוסף 1.2 מ"ל של תמיסת חומצה אצטית מימיתמוכן בשלב 3.1 ו homogenize הרקמה על ידי גז עדין במשך 10 s. מעבירים את ההשעיה וכתוצאה מכך צינור צנטריפוגות 1.5 מ"ל.
2. בצע את השלבים 3.3. Solid
   הערה: דגימות יבשות ניתן לאחסן על 4-6 מעלות צלזיוס למשך עד 12 חודשים.

5. הכנת תקן חומצה Sialic מעורב

1. שוקלים בין 5 - 8 מ"ג של חומצה N-acetylneuraminic על איזון אנליטית לתוך צינור 1.5 צנטריפוגות מ"ל. שים לב למשקל המדויק ולהוסיף 164 μL של H ₂ מזוקק עבור כל מ"ג ( כלומר אם המשקל של Neu5Ac הוא 7.2 מ"ג ואז להוסיף 7.2 x 164 = 1, 181 μL של מזוקק H ₂ O). התוצאה היא פתרון 20 מ"מ Neu5Ac המניות אשר ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך 12 חודשים.
2. השג N-glycolylneuraminic חומצה בכמויות קטנות במחיר מתון כגון 1 מ"ג aliquots. הוסף 154 μL של מזוקק H ₂ O ישירות למתחם על מנת להשיג ~ 20 מ"מ Neu5Gc פתרון המניות. להעביר אתפתרון לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל. פתרון זה ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך 12 חודשים.
3. שלב 5 μL מהפתרון כל המניות משלב 5.1 ו 5.2 לתוך צינור צנטריפוגה טרי 1.5 מ"ל ולהסיר את הממס על ידי אידוי צנטריפוגלי בטמפרטורת החדר ליובש.
   הערה: תקן חומצה sialic מעורב יכול להיות מאוחסן על 4 - 6 מעלות צלזיוס למשך עד 12 חודשים.

6. הקרינה Derivatization של חומצות Sialic

1. הכן 10 מ"ל של OPD פתרון, בהיקף של 100 מ"ג של o-phenylenediamine o ו 208 מ"ג של מימן sulfite נתרן 10 מ"ל של מזוקק H ₂ O.
2. הוסף 20 μL של OPD פתרון לדגימות חומצה sialic נגזר חלב העכבר (שלב 3), כבד העכבר (שלב 4), או תקן חומצה sialic מעורבת (שלב 5). וורטקס במרץ עבור 30 ד ו דגירה דגימות במשך 4 שעות ב 80 ° C בחושך ( כלומר לעטוף את microtubes רדיד אלומיניום).
3. בואו הדגימות להתקרר במשך 5 דקות, להוסיף 80 μ, L מזוקקים H ₂ O ו צנטריפוגה צינורות ב XG 14,000 במשך 1 דקות.
4. העברת 80 μL מן supernatant לתוך בקבוקון 300 μL גבוהה התאוששות HPLC. הדגימות חומצה sialic derivatized ניתן לאחסן 4 - 6 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע אחד.

7. HPLC ניתוח של Sialic חומצה נגזרים

1. ניתוח הדגימות באמצעות מערכת HPLC סטנדרטי מחובר גלאי פלואורסצנטי באינטרנט.
2. השתמש טור שלב C18 הפוך עם ממדים סטנדרטיים של 250 מ"מ אורך ו 4.6 מ"מ קוטר לניתוח.
3. הכן ממס על ידי דילול 200 מ"ל של פתרון המניות עם 800 מ"ל של מים כיתה LCMS (LCMS - כרומטוגרפיה כרומטוגרפית נוזלית מסה). פתרון המניות עצמו יכול להיות מוכן כדלקמן:
   1. הוסף 46 גרם של חומצה פורמית ל 800 מ"ל של LCMS כיתה H ₂ O.
   2. התאם את pH 4.5 על ידי הוספת drop הוספת hydroxide אמוניום פתרון (purissa הרשות).
   3. מעבירים את הממס למדידת גליל ולמלא עד 1000 מ"ל עם LCMS כיתה H ₂ O. פתרון זה המניות ניתן לאחסן 4 - 6 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים.
4. עבור ממס B, השתמש אצטוניטריל LCMS בכיתה.
5. להפריד את חומצות sialic נגזרים בקצב 1 מ"ל / דקות הזרימה עם elution הבאות gradient:
   1. התחל על ידי הוספת 10% של ממס ב 'מעורב א ממס א.
   2. מ 0 דקות עד 15 דקות, להגדיל בהדרגה את שיעור ממס B עם שיפוע ליניארי ל 60%.
   3. מ 15 דקות עד 16 דקות, להגדיל במהירות את שיעור ממס B עם שיפוע ליניארי מ 60% ל 90%. זה יוזם את הכביסה של העמוד HPLC.
   4. כדי לשטוף עוד את העמודה HPLC, לשמור על רמת ממס ב 90% בין 16 דקות ו 18 דקות לפני הפחתת בהדרגה את רמת ממס ממס שוב 10% בין 18 דקות ו 19 דקות.
   5. Re-equilibrate עמודות HPLC לתנאי ההתחלה של 10% B בין 19 ו 24 דקות.
6. בJect 50 μL של המדגם לתוך מערכת HPLC.
7. צג eluents באמצעות גלאי פלואורסצנטי עירור / פליטת גלים של 373/448 ננומטר, ואת חומצות sialic derivatized ניתן לצפות בשעה משוער פעמים של 9 דקות (עבור Neu5Gc-OPD) ו 10 דקות (עבור Neu5Ac-OPD).
8. לחשב את הסכום היחסי של Neu5Gc (F _Neu5Gc) מאזורי השיא הקרינה של Neu5Ac (א _Neu5Ac) ו Neu5Gc (א _Neu5Gc) כדלקמן: F _Neu5Gc [%] = 100 × _Neu5Gc / (א _{Neu5Gc Neu5Ac} + A). במקרה של דגימות חלב וכבד מן העכבר Cmah לדפוק החוצה עכבר F _Neu5Gc צריך להיות 0%, ואילו הערכים עבור F _Neu5Gc של העכברים הטרוזיגיים wild-type עשוי להשתנות במידה רבה בהתאם לגיל העכבר ואת סוג הרקמה (בין 2% ו - 90%) עם שולי שגיאה צפויים של ± 12%.

תוצאות

סקירה סכמטית של שיטת הניתוח המתואר מוצג באיור 1 וכולל את הבידוד של חומצות sialic מדגימות חלב וכבד של wild-type ו- Cmah לדפוק- out עכברים מוטציה, ו derivatization פלואורסצנטי וניתוח HPLC של רכיבים אלה. איור 2 איור 3 להרא...

Discussion

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר הערכה פנוטיפית של הומוזיגוס Cmah לדפוק את העכברים על ידי ניתוח וכימות כמויות יחסית של Neu5Gc של חלב ודגימות כבד. הניתוח בוצע באמצעות התקנה סטנדרטית HPLC עם זיהוי פלואורסצנטי. השלב הקריטי ביותר של הליך זה הוא הכנת העמודות חילופי אניון וביצוע כ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals:
N-acetylneuraminic acid	Sigma	A0812
N-glycolylneuraminic acid	Sigma	50644	1 mg aliquot should be sufficient
o-Phenylenediamine	Sigma	694975
Sodium hydrogen sulfite	J&K Scientific Ltd	75234
Tools/Materials:
3 mL SPE tubes	Supelco	Sigma 57024	empty solid phase extraction columns
Luer stopcock	Sigma	S7396	to stop the flow of the SPE tube
Dowex 1X8	Dow Chemicals	Sigma 44340	200-400 mesh
Dounce tissue grinder	Sigma	D8938	tight fit
HPLC Analysis:
High-recovery HPLC vial	Agilent Technologies	#5188-2788
HPLC System	Shimadzu	Nexera
Fluorescence Detector for HPLC	Shimadzu	RF-20Axs
HPLC Column	Phenomenex	Hyperclone ODS	250x4.6 mm
LCMS-grade H2O	Merck Millipore	#WX00011
LCMS-grade Acetonitrile	Merck Millipore	#100029	Hypergrade
Ammonium hydroxide solution	Fluka	#44273	puriss. P.a.