АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описываем метод ВЭЖХ для определения N-ацетилнейраминовой кислоты и N-гликолиленураминовой кислоты в печени и молоке мыши.

Аннотация

CMAH (гидроксилаза цитидин-моно-фосфат-N-ацетилнейраминовой кислоты) ответственна за окисление монофосфат-цитидин-N-ацетилнейраминовых кислот у млекопитающих. Однако люди не могут окислять монофосфат-N-ацетилнейраминовую кислоту цитидина до монофосфат-N-гликолинераминовой кислоты цитидина из-за первичной экзоновой делеции гена CMAH . Чтобы более подробно понять последствия и последствия отсутствия активности CMAH , модель нокаутов Cmah у мышей представляет большой интерес к фундаментальным и прикладным исследованиям. Метод анализа для определения фенотипа этой модели мыши подробно описан здесь и основан на обнаружении как N-ацетилнейраминовой кислоты, так и N-гликолиленураминовой кислоты в печени и молоке мышей с диким типом и Cmah . Эндогенные сиаловые кислоты высвобождаются и дериватизируются о-фенилендиамином для получения флуорогенных производных, которые затем могут быть проанализированы с помощью ВЭЖХ. Представленный протокол может бытьТакже применяется для анализа образцов молока и тканей из различных других источников и может быть полезен для исследования пищевых и медицинских эффектов N-гликолилнейраминовой кислоты.

Введение

N-ацетилнейраминовая кислота (Neu5Ac) и N-гликолилнеураминовая кислота (Neu5Gc) являются наиболее распространенными сиаловыми кислотами у большинства млекопитающих 1 . Несмотря на то, что эндогенно синтезируется Neu5Ac, люди не способны продуцировать Neu5Gc из-за первичной делеции экзона на ген CMAH , кодирующий гидроксилазу CMP-Neu5Ac 2 , 3 . Однако пищевые продукты на основе животных могут быть диетическими источниками Neu5Gc 4 , 5 , 6 , что приводит к получению антител против Neu5Gc и, следовательно, вызывает иммунный ответ на Neu5Gc 7 . Предполагается, что этот диетический эффект Neu5Gc способствует хроническому воспалению и различным другим заболеваниям 8 , 9 , 10 . Чтобы всесторонне понять эффекты Neu5Gc в hUmans, животная модель для систематического изучения эффектов сиаловых кислот пищевого происхождения весьма желательна. Хотя протоколы, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР) для анализа выбитых мышей, хорошо известны и являются удобным способом генотипической оценки, функциональный анализ фенотипа на метаболическом уровне требует более конкретных методов анализа. Фенотип модели выкатной мыши Cmah можно оценить, выделив и проанализировав состав сиаловых кислот в образцах печени или молока. Ранее сообщалось о нескольких методах обнаружения сиаловых кислот в тканях животных: реакция сиаловых кислот с резорцинолом 11 или тиобарбитуровой кислотой 12 приводит к образованию хромофорного продукта и может быть просто проанализирована с использованием установки на основе плиттера, но только общая сиалическая Содержание кислоты может быть определено. Альтернативно, анализ сиаловых кислот также описывался с использованием газовой хроматографии13 , масс-спектрометрия MALDI-TOF 14 или амперометрические методы 15 . Однако наиболее часто применяемые методы анализа сиаловой кислоты основаны на гидролитическом высвобождении с последующей дериватизацией флуоресценции и последующей высокоэффективной жидкостной хроматографией 16 , 17 , 18 .

протокол

Процедуры, связанные с животными, были одобрены Этическим комитетом экспериментального животного центра Нанкинского сельскохозяйственного университета в соответствии с Национальными руководящими принципами по обеспечению благополучия животных (Министерство науки и технологий, КНР, 2006 г.) с животными, содержащимися в SPF Объект (ID разрешения: SYXK-J-2011-0037).

1. Модель мышиной мыши Cmah

  1. Используйте мышей дикого типа C57Bl / 6 из Центра сравнительной медицины Университета Янчжоу (Китай).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Мышцы Cmah с нокаутом были созданы на основе информации, предоставленной в предыдущих исследованиях 17 , 19 Kmah , и коммерчески использовали стратегию CRISPR / Cas9 20 , удалив 92 пары оснований из экзона 6 гена Cmah , что также Удалены в человеческом CMAH- гене 19 . Положительный F 0 </ Sub> -mice (2 индивидуума) скрещивались с мышами дикого типа, чтобы получить гетерозиготную F 1 -мерную. После пересечения гетерозиготных F 1 -mice (5 особей), гомозиготные Cmah выбивание F 2 -mice может быть успешно получен (3 особей).
  2. Выполните генотипирование мышей с использованием геномной ДНК в соответствии с методом, показанным Zangala 21, с использованием коммерческого набора для очистки ДНК.
    1. Усилить соответствующий фрагмент ДНК гена Cmah с использованием коммерческой ДНК-полимеразы и пары праймеров 5'gaaagggctcggctctgtatgaa3 'и 5'tttaaaatgtcccgggtgagaagc3'. Выполните амплификацию гена с использованием 34 циклов ПЦР, состоящих из денатурации при 94 ° С в течение 40 с, отжига при 63 ° С в течение 40 с и удлинения при 72 ° С в течение 1 мин.
    2. Визуализируйте продукты ПЦР на 1% агарозном геле. Нужно наблюдать одиночную полосу (0,5 т.п.н.) для индивидуума дикого типа, двойную полосу (0,4 и 0,5 кб) дляГетерозиготный нокаутный индивидуум и одиночная полоса (0,4 т.п.н.) для гомозиготного нокаута.

2. Сбор образцов

  1. Собирайте мышечное молоко с использованием протокола, описанного Willingham et al. 22 .
  2. Собирайте ткань печени мыши, используя протокол, описанный Gonçalves et al. 23 и хранить образцы при -80 ° C.

3. Выделение сиаловых кислот из молока

  1. Подготовьте 100 мл 2 М раствора уксусной кислоты, добавив 12 мл ледяной уксусной кислоты в 88 мл дистиллированного H 2 O.
  2. Передайте 50 мкл молока в 1,5 мл центрифужную пробирку и добавьте 1,2 мл полученного водного раствора уксусной кислоты.
  3. Инкубировать суспензию в течение 4 ч при 80 ° С и центрифугировать образец при 14000 мкг в течение 10 мин.
  4. Перенесите верхние 1000 мкл надосадочной жидкости в свежую 1,5 мл центрифужную пробирку и запишитеРастворител центрифугированием при комнатной температуре до полного сухости (в зависимости от подключенного вакуумного насоса это займет 4-20 ч). Повторно растворите образец в 500 мкл дистиллированного H 2 O.
  5. Подготовьте колонку обмена микроанионом. Эта стадия специально обогащает анионные соединения и удаляет катионные и нейтральные соединения из образцов молока и печени и, следовательно, повышает селективность флюорогенного меченого агента OPD для дериватизации сиаловой кислоты.
    1. Перенесите для каждого образца 200 мг анионообменной смолы (Dowex 1X8) в пустые 3-миллилитровые колонки с прикрепленным краном.
    2. Добавить 2 мл водного раствора уксусной кислоты, полученного на стадии 3.1, для замены ионов хлорида в смоле ацетатными ионами. Закройте краном, как только растворитель достигнет вершины смолы.
    3. Аккуратно добавьте 2 мл дистиллированного H 2 O, откройте запорный кран и остановите поток, как только большая часть растворителя достигнетВерхняя часть смолы. Убедитесь, что смола всегда покрыта растворителем.
    4. Промойте колонку смолы еще два раза с помощью 2 мл дистиллированного H 2 O для удаления избытка ацетата.
  6. Перенесите полученные 500 мкл растворителя образца из стадии 3.4. На колонну смолы и отказаться от сквозного потока. Аккуратно промыть смолу 2 мл дистиллированного H 2 O. Элюировать образцы анионов из смолы, используя 1 мл 50 мМ раствора ацетата аммония (386 мг ацетата аммония, растворенного в 100 мл дистиллированной H 2 O), в 1,5 мл Центрифужная трубка. Удалите растворитель центробежным выпариванием при комнатной температуре досуха.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Сухие образцы можно хранить при температуре 4-6 ° C в течение 12 месяцев.

4. Выделение сиаловых кислот из ткани печени

  1. Аккуратно оттереть 20 - 50 мг печени мыши и перенести его в тканевую дробилку Dounce (1 мл или 2 мл объема). Добавить 1,2 мл водного раствора уксусной кислотыПолученного на стадии 3.1, и гомогенизируют ткань путем осторожного сдвига в течение 10 с. Перенесите полученную суспензию в 1,5 мл центрифужную пробирку.
  2. Выполните шаги 3.3. До 3.6.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Сухие образцы можно хранить при температуре 4-6 ° C в течение 12 месяцев.

5. Подготовка стандарта смешанной сиаловой кислоты

  1. Взвешивают между 5-8 мг N-ацетилнейраминовой кислоты на аналитическом балансе в 1,5 мл центрифужную пробирку. Обратите внимание на точный вес и добавьте 164 мкл дистиллированного H 2 O для каждого мг ( т.е. если масса Neu5Ac составляет 7,2 мг, затем добавьте 7,2 × 164 = 1, 181 мкл дистиллированного H 2 O). В результате получается 20 мМ исходного раствора Neu5Ac, который можно хранить при -20 ° C в течение 12 месяцев.
  2. Получают N-гликолилнейраминовую кислоту в меньших количествах по умеренной цене, например, в аликвотах по 1 мг. Добавьте 154 мкл дистиллированного H 2 O непосредственно к соединению для получения 20 мМ исходного раствора Neu5Gc. ПередайтеРаствор в 1,5 мл центрифужную пробирку. Этот раствор можно хранить при -20 ° C в течение 12 месяцев.
  3. Объедините 5 мкл из каждого исходного раствора с шага 5.1 и 5.2 в свежую пробирку с 1,5 мл центрифуги и удалите растворитель центробежным выпариванием при комнатной температуре досуха.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Смешанный стандарт сиаловой кислоты можно хранить при 4-6 ° C в течение 12 месяцев.

6. Флюоресцентная дериватизация сиаловых кислот

  1. Подготовьте 10 мл OPD-раствора, состоящего из 100 мг о-фенилендиамина и 208 мг гидросульфита натрия в 10 мл дистиллированного H 2 O.
  2. Добавьте 20 мкл OPD-раствора в образцы сиаловой кислоты, полученные из мышиного молока (стадия 3), печень мыши (стадия 4) или смешанный стандарт сиаловой кислоты (этап 5). Вихрь энергично в течение 30 с и инкубируйте образцы в течение 4 ч при 80 ° С в темноте ( т. Е. Оберните микропробирки в алюминиевой фольге).
  3. Пусть образцы остынут в течение 5 минут, добавьте 80 μ, L дистиллированного H 2 O и центрифугируют пробирки при 14000 xg в течение 1 мин.
  4. Передайте 80 мкл из супернатанта в 300 мкл высокоэффективного ВЭЖХ-ампулы. Образцы производных сиаловой кислоты можно хранить при 4-6 ° C в течение одной недели.

7. Анализ ВЭЖХ производных сиаловой кислоты

  1. Проанализируйте образцы, используя стандартную систему ВЭЖХ, подключенную к онлайн-детектору флуоресценции.
  2. Для анализа используйте колонку с обращенной фазой C18 с стандартными размерами 250 мм и диаметром 4,6 мм.
  3. Подготовьте растворитель А, разбавив 200 мл исходного раствора 800 мл воды LCMS (LCMS - жидкостная хроматографическая масс-спектрометрия). Сам исходный раствор можно приготовить следующим образом:
    1. Добавить 46 г муравьиной кислоты до 800 мл LCMS-класса H 2 O.
    2. Отрегулируйте pH до 4,5 путем добавления по каплям раствора гидроксида аммония (puriss. Pa).
    3. Перенесите растворитель вИзмерительный цилиндр и заполнить до 1000 мл LCMS-grade H 2 O. Этот исходный раствор можно хранить при 4-6 ° C в течение 3 месяцев.
  4. Для растворителя B используйте ацетонитрил LCMS.
  5. Отделите производные сиаловых кислот со скоростью потока 1 мл / мин со следующим градиентным элюированием:
    1. Начните с добавления 10% растворителя В, смешанного с растворителем А.
    2. От 0 мин до 15 мин постепенно увеличивают долю растворителя В с линейным градиентом до 60%.
    3. С 15 минут до 16 минут быстро увеличивайте долю растворителя B с линейным градиентом от 60% до 90%. Это инициирует промывку колонки ВЭЖХ.
    4. Для дальнейшей промывки колонки ВЭЖХ поддерживать уровень растворителя В на 90% между 16 и 18 мин, прежде чем постепенно снижать уровень растворителя В снова до 10% в течение 18 мин и 19 мин.
    5. Повторно уравновешивают колонку ВЭЖХ до начальных условий 10% В между 19 и 24 мин.
  6. В50 мкл образца в систему ВЭЖХ.
  7. Контролировать элюенты с использованием длин волн возбуждения / испускания флуоресцентного излучения 373/448 нм, а дериватизированные сиаловые кислоты можно ожидать при приблизительном времени удерживания 9 мин (для Neu5Gc-OPD) и 10 мин (для Neu5Ac-OPD).
  8. Вычислите относительное количество Neu5Gc (F Neu5Gc ) из областей пика флуоресценции Neu5Ac (A Neu5Ac ) и Neu5Gc (A Neu5Gc ) следующим образом: F Neu5Gc [%] = 100 × A Neu5Gc / (A Neu5Ac + A Neu5Gc ). В случае образцов молока и печени из гомозиготной мышиной ножки Cmah F Neu5Gc должно быть 0%, тогда как значения для F Neu5Gc гетерозиготных и дикого типа мышей могут широко варьироваться в зависимости от возраста мыши и типа ткани (от 2% И> 90%) с ожидаемым пределом погрешности ± 12%.

Результаты

Схематический анализ описанного метода анализа показан на рисунке 1 и включает выделение сиаловых кислот из образцов молока и печени мутантных мышей дикого типа и Cmah , а также дериватизацию флуоресценции и анализ HPLC этих компонентов. Н...

Обсуждение

Представленный здесь протокол позволяет фенотипическую оценку гомозиготных мышечных мышей Cmah , анализируя и количественно определяя относительные количества Neu5Gc образцов молока и печени. Анализ проводили с использованием стандартной установки ВЭЖХ с детектированием флуо...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана Фондом естественных наук Китая (номера грантов 31471703, A0201300537 и 31671854 для СП и LL) и 100 иностранных планов талантов (номер гранта JSB2014012 для СП).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals:
N-acetylneuraminic acidSigmaA0812
N-glycolylneuraminic acidSigma506441 mg aliquot should be sufficient
o-PhenylenediamineSigma694975
Sodium hydrogen sulfiteJ&K Scientific Ltd75234
Tools/Materials:
3 mL SPE tubesSupelcoSigma 57024empty solid phase extraction columns
Luer stopcockSigmaS7396to stop the flow of the SPE tube
Dowex 1X8Dow ChemicalsSigma 44340200-400 mesh
Dounce tissue grinderSigmaD8938tight fit
HPLC Analysis:
High-recovery HPLC vialAgilent Technologies#5188-2788
HPLC SystemShimadzuNexera
Fluorescence Detector for HPLCShimadzuRF-20Axs
HPLC ColumnPhenomenexHyperclone ODS250x4.6 mm
LCMS-grade H2OMerck Millipore#WX00011
LCMS-grade AcetonitrileMerck Millipore#100029Hypergrade
Ammonium hydroxide solutionFluka#44273puriss. P.a.

Ссылки

  1. Lamari, F. N., Karamanos, N. K. Separation methods for sialic acids and critical evaluation of their biologic relevance. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781 (1-2), 3-19 (2002).
  2. Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273 (25), 15866-15871 (1998).
  3. Chou, H. H., et al. A mutation in human CMP-sialic acid hydroxylase occurred after the Homo-Pan divergence. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (20), 11751-11756 (1998).
  4. Rehan, I. F., et al. Large-Scale Glycomics of Livestock: Discovery of Highly Sensitive Serum Biomarkers Indicating an Environmental Stress Affecting Immune Responses and Productivity of Holstein Dairy Cows. J Agric Food Chem. 63 (48), 10578-10590 (2015).
  5. Wang, B., McVeagh, P., Petocz, P., Brand-Miller, J. Brain ganglioside and glycoprotein sialic acid in breastfed compared with formula-fed infants. Am J Clin Nutr. 78 (5), 1024-1029 (2003).
  6. Yao, H. L., et al. Quantification of sialic acids in red meat by UPLC-FLD using indoxylsialosides as internal standards. Glycoconj J. 33 (2), 219-226 (2016).
  7. Nguyen, D. H., Tangvoranuntakul, P., Varki, A. Effects of natural human antibodies against a nonhuman sialic acid that metabolically incorporates into activated and malignant immune cells. J Immunol. 175 (1), 228-236 (2005).
  8. Byres, E., et al. Incorporation of a non-human glycan mediates human susceptibility to a bacterial toxin. Nature. 456 (7222), 648-652 (2008).
  9. Hedlund, M., Padler-Karavani, V., Varki, N. M., Varki, A. Evidence for a human-specific mechanism for diet and antibody-mediated inflammation in carcinoma progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (48), 18936-18941 (2008).
  10. Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (21), 12045-12050 (2003).
  11. Svennerholm, L. Quantitative estimation of sialic acids. II. A colorimetric resorcinol-hydrochloric acid method. Biochim Biophys Acta. 24 (3), 604-611 (1957).
  12. Warren, L. The thiobarbituric acid assay of sialic acids. J Biol Chem. 234 (8), 1971-1975 (1959).
  13. Kakehi, K., Maeda, K., Teramae, M., Honda, S., Takai, T. Analysis of sialic acids by gas chromatography of the mannosamine derivatives released by the action of N-acetylneuraminate lyase. J Chromatogr. 272 (1), 1-8 (1983).
  14. Wheeler, S. F., Domann, P., Harvey, D. J. Derivatization of sialic acids for stabilization in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and concomitant differentiation of alpha(2 --> 3)- and alpha(2 --> 6)-isomers. Rapid Commun Mass Spectrom. 23 (2), 303-312 (2009).
  15. Hurum, D. C., Rohrer, J. S. Determination of sialic acids in infant formula by chromatographic methods: a comparison of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection and ultra-high-performance liquid chromatography methods. J Dairy Sci. 95 (3), 1152-1161 (2012).
  16. Ito, M., et al. An improved fluorometric high-performance liquid chromatography method for sialic acid determination: an internal standard method and its application to sialic acid analysis of human apolipoprotein. E. Anal Biochem. 300 (2), 260-266 (2002).
  17. Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Mol Cell Biol. 27 (8), 3008-3022 (2007).
  18. Manzi, A. E., et al. High-pressure liquid chromatography of sialic acids on a pellicular resin anion-exchange column with pulsed amperometric detection: a comparison with six other systems. Anal Biochem. 188 (1), 20-32 (1990).
  19. Hedlund, M., et al. N-glycolylneuraminic acid deficiency in mice: implications for human biology and evolution. Mol Cell Biol. 27 (12), 4340-4346 (2007).
  20. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  21. Zangala, T. Isolation of genomic DNA from mouse tails. J Vis Exp. (6), e246 (2007).
  22. Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
  23. Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar J. 6, 169 (2007).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

125CMAHNeu5GcNNeu5AcHPLC FLD

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены