أسلوب LC-MS/MS الأمثل لتحليل العينات السريرية إيفاكافتور، والايضات الرئيسية، ولوماكافتور في السوائل البيولوجية لمرضى التليف الكيسي الفائق

Summary

الجمع بين إيفاكافتور وإيفاكافتور-لوماكافتور هما أدوية جديدة لقوات التحالف. ومع ذلك، لا يزال هناك ندرة في التفاهم على PK/PD والصيدلة. نقدم أسلوب [هبلك]--مايكروسوفت أمثل للتحليل المتزامن إيفاكافتور ووالايضات الرئيسية، ولوماكافتور.

Abstract

عيوب في الجهة الموصلية عبر غشاء التليف الكيسي (CFTR) هي السبب في التليف الكيسي (CF)، هو مرض مع المظاهر الرئوية تهدد الحياة. إيفاكافتور (IVA)، والجمع بين إيفاكافتور-لوماكافتور (لمي) هي اثنين المخدرات اختراق قوات التحالف الجديد أن تعدل مباشرة النشاط والاتجار بها البروتين CFTR معيبة. ومع ذلك، لا يزال هناك ندرة في التفاهم على معلمات الحرائك الدوائية/ميكروبيولوجية والصيدلة إيفاكافتور ولوماكافتور. التقنية [هبلك]-مرض التصلب العصبي المتعدد للتحليل المتزامن لتركيزات إيفاكافتور، هيدروكسيميثيل-إيفاكافتور، إيفاكافتور-كاربوكسيلات، ولوماكافتور في السوائل البيولوجية في المرضى الذين يتلقون القياسية تركيبة إيفاكافتور أو إيفاكافتور-لوماكافتور العلاج قد سبق وضعها في مجموعتنا والتحقق من صحتها جزئيا لمعايير إدارة الأغذية والعقاقير. ومع ذلك، يسمح تحليل الفائق لعدد أكبر من عينات المرضى، مجموعتنا قد الأمثل الأسلوب المبلغ عنها من خلال استخدام عمود كروماتوغرافيا المرحلة عكس حجم مسام أصغر (2.6 ميكرومتر، C8 100؛ 50 x 2.1 ملم) ونظام تدرج المذيبات ( 0-1 دقيقة: 40% ب؛ 1-2 دقيقة: 40-70% ب؛ 2-2.7 دقيقة: عقدت في 70% ب؛ 2.7-2.8 دقيقة: ب 70-90 في المائة؛ 2.8-4.0 دقيقة: 90% ب الغسل؛ 4.0-4.1 دقيقة: 90-40% ب؛ 4.1-6.0 دقيقة: عقد 40% ب) بدلاً من شطف isocratic. وكان الهدف من هذه الدراسة لتقليل الوقت [هبلك]-مرض التصلب العصبي المتعدد تحليل كل عينة كبيرة من ~ 15 دقيقة إلى فقط 6 دقيقة لكل عينة، هو أمر أساسي لتحليل كمية كبيرة من عينات المرضى. هذا الأسلوب المناسب ستكون ذات فائدة كبيرة لدراسات في العلاقات التعرض/الاستجابة لهذه الأدوية تقدم قوات التحالف.

Introduction

التليف الكيسي (CF) أمراض وراثية شيوعاً تشمل الغدد إفرازات المخاط من الرئة والكبد والبنكرياس والأمعاء يسبب فشل الجهاز المتعدد التدريجي، مثل انخفاض وظائف الرئة وقصور البنكرياس^{1، 2،3}. إيفاكافتور (IVA) هو أول إدارة الغذاء والدواء (إدارة الأغذية والعقاقير الأمريكية) ووافقت وكالة الأدوية الأوروبية (EMA) التليف الكيسي عبر غشاء الموصلية منظم (CFTR) بوتينتياتور المخدرات، مع فعالية سريرية تدل على إنتاج كبير تحسن في وظيفة الرئة عبر الغفل في مجموعة فرعية صغيرة من المرضى CF واضعة G551D-CFTR [جليكاين (ز) في موقف 551 هو الاستعاضة عن حمض الأسبارتيك (د)]^4،مغلطه الطفرات (~ 4-5% السكان CF)⁵. وهذا تدار شفويا الزيادات المخدرات القناة CFTR فتح، وبالتالي زيادة تدفق أيون كلوريد ويتصرف في العيب الأساسي الذي يؤدي إلى المظاهر السريرية CF^4،6. ولسوء الحظ، إيفا الأحادي ليست فعالة في المرضى مع الطفرة F508del متماثل أكثر شيوعاً [في إطار حذف جين CFTR مما يؤدي إلى فقدان فينيلألانين (و) في موقف 508] الذي ينتج تجمعات CFTR، الذي ينظر إليه في ~ 50% من ^7،قوات التحالف السكان⁸.

في الآونة الأخيرة، منحت إدارة الأغذية والعقاقير موافقة للجمع بين إيفا مع مصحح CFTR لوماكافتور المخدرات. استراتيجية ذكية للجمع بين CFTR مصحح (لوماكافتور، مي) الذي ينقذ F508del CFTR إلى سطح الخلية مع المغير (IVA) الذي يقوي التي تعالج النشاط قناة CFTR، فعالية يوسع إطار العلاج لمعظم السكان CF⁵ . تظل هناك أسئلة حول ما إذا كانت هذه الأدوية ستفي بوعودها كما ظهر عدد من التقارير المتضاربة أن يلقي الشك على الفعالية السريرية^9،10. بالإضافة إلى ذلك، تم إدخال تحسينات على وظيفة الرئة فقط متواضعة (2.6-4% للجمع بين إيفاكافتور-لوماكافتور) مقارنة بالنجاح الذي تحقق مع إيفا الأحادي في المرضى تحمل تحور (10.6-12.5 في المائة) G551D⁸. محتملة معادية المخدرات-المخدرات التفاعلات بين إيفا ومي أن تحد من فعالية السريرية للجمع بين إيفاكافتور-لوماكافتور تأتي من خصائص الحرائك الدوائية أقل من مثالية^7،11. يتم استقلاب إيفا على نطاق واسع بالأنزيمات السيتوكروم P450 (CYP)، أساسا إلى المستقلب نشط هيدروكسيميثيل-إيفا (إيفا-M1، M1) ونموذج غير نشط إيفا-كاربوكسيلات (إيفا-M6، M6)^7،12. CYP3A4 محفز لمي، من ناحية أخرى، لا يتم استقلاب على نطاق واسع، ويفرز إلى حد كبير دون تغيير في البراز¹¹. كما حمل مستحثات CYP3A4 الأيض الفسفرة، يمكن تخفيض تركيزات إيفاكافتور (الركيزة CYP3A4). وعلاوة على ذلك، إيفا ومي جزيئات مسعور جداً وملزمة ~ 99% لبروتينات البلازما، مما يحد بشكل كبير^1،تركيز خالية من المخدرات (نشط)¹³.

جماعياً، قد تأتي هذه العوامل معا للحد من فعالية السريرية للجمع بين إيفاكافتور-لوماكافتور. فإنه ليس من المعروف ما إذا كانت تركيزات البلازما المثلى تتحقق تحت نظام الجرعة الحالية للجمع بين إيفاكافتور-لوماكافتور أو إذا عتبة العلاجية هو الإبقاء على⁸. في الوقت الحاضر، هناك ندرة في المعلومات المتعلقة بالمعلمات الحرائك الدوائية مثل ذروة وتركيزات البلازما حالة ثابتة من إيفاكافتور أو إيفاكافتور-لوماكافتور. نظراً لوحظ أيض إيفاكافتور ولوماكافتور، رصد علاقات التعرض/الاستجابة شرط أساسي لتحقيق نظم الجرعة المثلى للعلاج إيفاكافتور أو إيفاكافتور-لوماكافتور. مؤخرا نشرت مجموعتنا أول أسلوب [هبلك]/LC-مرض التصلب العصبي المتعدد لرصد علاقات التعرض/الاستجابة لايفا ومي¹⁴. أبلغ عن لا تقنيات بديلة لقياس تركيزات إيفاكافتور، والايض، ولوماكافتور حتى الآن. للسماح بتحليل الفائق الجماعية المريض أكبر، وتخفيض هائل في وقت التحليل، مجموعتنا قد تحسين أسلوب الإبلاغ عنها عن طريق استخدام عمود كروماتوغرافيا المرحلة عكس حجم مسام أصغر ونظام تدرج للمذيبات التي يقلل من تكلفة وأوقات التشغيل.

Protocol

تم الحصول على الموافقة للأخلاقيات من موناش جامعة البشرية بحوث أخلاقيات اللجنة (موهريك)-

1. تطبيق المقايسة: "جمع العينات المريض"

1. تسجيل الوقت عندما يأخذ المريض الجرعة القياسية من 150 ملغ إيفاكافتور أو إيفاكافتور 125 ملغ/lumacaftor 200 مغ.
2. ملاحظة انخفاض في الوقت المحدد عندما يتم جمع عينة دم المريض.
   ملاحظة: نوصي بجمع عينات من 4-5 على مدى دورة وقت 24 ساعة. إذا أمكن جمع عينة واحدة فقط، النقطة الزمنية المشار إليها هي 2.5-4 ح وظيفة إيفاكافتور أو إيفاكافتور-لوماكافتور تركيبة الجرعات سوف تكون تركيزات ج _{كحد أقصى} في حالة مستقرة قابلة للتحقيق بعد > 5 أيام معاملة على التوالي-
3. جمع 4-5 مل دم في أنابيب زرقاء غير المعالجة المتاحة تجارياً-
4. بعد جمع الدم كله، تسمح للدم تجلط بتركها دون عائق في درجة حرارة الغرفة-
   ملاحظة: وهذا عادة ما يستغرق 15-30 دقيقة
إزالة
5. الجلطة قبل سينتريفوجينج في 1,000 2,000 س ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في أجهزة الطرد مركزي مبردة. تعيين المادة طافية الناتجة البلازما.
6. عقب الطرد المركزي، فورا نقل المادة طافية (البلازما) في أنبوب البولي بروبلين نظيفة باستخدام ماصة باستور. تمت تسمية البلازما أنبوب مع "معرف المريض" (مثلاً، 1 المريض)، المخدرات تدار (مثلاً، الجمع بين إيفاكافتور-لوماكافتور)، والوقت عينة المريض المجمعة (مثلاً، ح 2.5 بعد انتهاء الجرعة).
7. المحافظة على العينات عند 2-8 درجة مئوية أثناء المناولة. وبمجرد الانتهاء من معالجة، تخزين العينات في – 20 ° C.
السفينة
8. إذا لزم الأمر، مع ساعي معتمدة لمعهد تحليل عينات.
   ملاحظة: يتم شحنها في الثلج الجاف حتى وصول العينات ويجب أن يبقى على – 80 درجة مئوية حتى التحليل.

2. إعداد وتجهيز العينات التي تكبدتها والمعايير

ملاحظة: البلازما من السذاجة المانحين صحي للعلاج إيفاكافتور/لوماكافتور تم الحصول عليها من "الصليب الأحمر الأسترالي". لضمان السلامة، ينبغي أن تظل جميع العينات ومعايير في 2-8 درجة مئوية أثناء جمع وتجهيز. وبمجرد الانتهاء من معالجة، تخزين العينات في – 20 ° C.

1. تزن إيفا وايفا-كاربوكسيلات، هيدروكسيميثيل-إيفا والتي ستكون بمثابة مرجع للمعايير الداخلية لمي-
إعداد
2. حلين الأوراق المالية المستقلة لكل أكثر (M1 وايفا ومي، M6) في الميثانول الصف LC-MS 100 ميكروغرام/مل وإلى 10 ميكروغرام/مل.
   ملاحظة: المركبات سوف تنتهي بعد 10 أيام على benchtop.
3. طازجة إعداد LC-MS المعايرة معايير قبل كل تشغيل التحليلية بتمييع المعايير المعايرة حلول الأسهم في البلازما البشرية لتحقيق أثر التركيزات: 0.01، 0.025، 0.05، 0.1، 0.2، 0.5، 1.0، 2.5، 5.0، 10.0 ميكروغرام/مل. هذه العينات هي المشار إليها كمعايير.
4. يعجل بالبروتينات وإعداد 0.1% حمض الفورميك (FA) في الاسيتو الانيتريل (ACN، الصف LC-MS) ويترك في الثلاجة حتى الحاجة.

3. المعالجة المسبقة للعينات التي تكبدتها والمعايير

1. تسمح كلا عينات البلازما المريض وفارغة حجته إلى درجة حرارة الغرفة.
2. دوامة لخلط كل عينة البلازما لمدة 15 ثانية لكل عينة.
3. نقل قاسمة 100 ميليلتر أما البلازما فارغة للمعايير أو لتحليل عينات المرضى في أنبوب ميكروسينتريفوجي البولي بروبلين 1.5 مل.
إضافة
4. إيفا القياسية الداخلية في كل من هذه الأنابيب القياسية (مثلاً، 0.01، 0.025، 0.05، 0.1، 0.2، 0.5، 1.0، 2.5، 5.0، 10.0 ميكروغرام/مل لتغطية نطاق التركيز المحتملة) وإغلاق الغطاء، ودوامه لملاحظة س. 2-3 هذا المعيار الداخلي فقط إضافة إلى البلازما فارغة ويتم إضافة لا المعايير الداخلية لعينات المرضى.
5. كرر الخطوة 3.4. للمعايير الداخلية الأخرى M1، M6، ومي-
6. تدور أسفل كل أنبوبة بإيجاز لضمان أنه لا توجد أية قطرات على الغطاء.
7. إضافة 200 ميليلتر من المزيج من 0.1% فا في تزاول في كل أنبوب يعجل ببروتينات البلازما.
8. دوامة الخليط بقوة لحوالي 15 س.
9. السماح بأنابيب الوقوف لمدة 10 دقائق في الثلاجة.
10. الطرد المركزي في 10,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية، إذا كان ذلك ممكناً-
11. تصفية قاسمة 200 ميليلتر من المادة طافية من خلال عامل تصفية حقنه 13 مم في قنينة [هبلك] 1.5 مل.
12. نقل 100 ميليلتر من المادة طافية في القنينة LC-مرض التصلب العصبي المتعدد للتحليل [هبلك]-MS.

4. [هبلك]-مرض التصلب العصبي المتعدد "تحليل"

ملاحظة: أجرى تحليل [هبلك]--مايكروسوفت على نظام LC MS يقترن مطياف الرباعي الثلاثي الشامل (الجدول 1).

1. بدوره على نظام LC MS، ضع العلبة مع العينات في السيارات-أخذ العينات-
2. إرفاق العمود عمود حرس والاتصال بنظام LC-MS.
3. إرفاق كل زجاجات من مراحل المتنقلة (زجاجة ج: 100% تزاول؛ وزجاجة ب 0.1% حمض الفورميك في المياه) وحجته نظام LC-MS.
4. دمج المعلمات التالية في البروتوكول LC-MS.
   1. تقسيم تدفق المرحلة المحمول قبل دخول مطياف الشامل بنسبة 2:1 (النفايات: مدخل MS).
   2. القيام شطف تدرج بمعدل 0.5 مل/دقيقة باستخدام مرحلة متنقلة تتألف من حمض الفورميك تزاول و 0.1% 100% في المياه تدفق (ابتداء من نقطة في حيز، v/v). علما بأن نسبة حجم المرحلة المتنقلة يتغير طوال التحليل.
   3. تعمل مطياف الشامل بطريقة تاين اليكتروسبراي إيجابية.
   4. تأكد من أن الإعدادات LC-مرض التصلب العصبي المتعدد كما يلي: أيون رذاذ الجهد 4.5 كيلوفولت، الطاقة الاصطدام 295.9 الخامس، nebulizing الغاز: النيتروجين في 3 لتر في الدقيقة؛ والغاز الاصطدام: الأرجون؛ وتجفيف الغاز تدفق 20 لتر في الدقيقة، وعدسة الجهد Q3:-22 الخامس، ديسولفيشن درجة حرارة 250 درجة مئوية مع كتلة حرارة درجة حرارة 400 درجة مئوية.
   5. حقن 10 ميليلتر حجم كل عينة.
   6. كشف تحليلها باستخدام عدة رد فعل الرصد (MRM). رصد التحولات أيون من m/z 392.49 → 393، m/z 408.49 → 409، m/z 422.47 → 423 و m/z 452.40 → 453 إيفا وايفا-M1، إيفا-M6 ومي، على التوالي.
      ملاحظة: الأسلوب الأمثل حديثا لم يتم التحقق من صحة تماما وفقا لمعايير إدارة الأغذية والعقاقير-

5. منحنيات المعايرة

1. منحنيات المعايرة بناء مرض التصلب العصبي المتعدد-LC قبل كل تشغيل التحليلية باستخدام العلاقة بين نسب المنطقة ذروة كل من تحليلها الأربعة على المستوى الداخلي والمعايرة القياسية الاسمية تركيزات إيفاكافتور (إيفا-M1، إيفا-M6 أو لمي) داخل البرنامج إعدادات LC-MS.
   ملاحظة: الخطوات الدقيقة لبناء منحنى المعايرة فيعتمد على نموذج LC MS المعدات المستخدمة. قد تكون هذه المعلومات متوفرة في دليل المعدات.
2. القيام بتحليل انحدار خطي المربعات الصغرى بالترجيح 1/ج ² استناداً المعاملة بالمثل لتركيزات.

النتائج

لقد مؤخرا أبلغ أسلوب، التحقق من صحتها جزئيا لمعايير إدارة الأغذية والعقاقير، على ثلاثي-الرباعي LC-مرض التصلب العصبي المتعدد ونظام كاشف [هبلك]، باستخدام عمود C8 (5 ميكرومتر، معرف 3.9 مم x 50 مم) مع المرحلة متنقلة تتألف من حمض الفورميك تزاول و 0.1% 100% في الماء (تشكل ، v/v) معدل تدفق من 1 مل/دقيقة. ولوحظ ا?...

Discussion

وكما ذكر سابقا، قد مجموعتنا للمرة الأولى المتقدمة والتحقق من صحة أسلوب [هبلك] و LC-مرض التصلب العصبي المتعدد للكشف السريع والتحديد الكمي إيفاكافتور وايضه الرئيسية هيدروكسيميثيل-إيفا M1 (نشطة) وايفا-كاربوكسيلات M6 (غير نشط)؛ ولوماكافتور في البلازما والبصاق من مرضى التليف الكيسي¹⁴...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
IVA (Cat#S114)	SelleckChem (USA).
LUMA (Cat#S1565)	SelleckChem (USA).
IVA-carboxylate (Cat# 510242247CS)	Clearsynth (Canada).
hydroxymethyl-IVA (Cat# 510240849CS)	Clearsynth (Canada).
Methanol (MeOH, LC-MS grade),	Sigma-Aldrich
acetonitrile (ACN, LC-MS grade)	Sigma-Aldrich
formic acid (FA)	Sigma-Aldrich
triple-quadrupole Shimadzu 8030 LC-MS
Phenomenex Kinetex (2.6 µm C8 100 Å; 50 × 2.1mm)
(KrudKatcher Ultrea HPLC In-Line Filter 0.5 m Depth Filter x 0.004inID).
1.5 mL polypropylene microcentrifuge tube (VWR).
Eppendorf Centrifuge 5430
13-mm syringe filter (0.45 µm nylon, GRACE, USA)
[Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 µL, PTFE/Silicone septa].