Optimisé méthode LC-MS/MS pour l’analyse de haut débit d’échantillons cliniques de Ivacaftor, ses principaux métabolites et Lumacaftor dans les fluides biologiques des patients atteints de fibrose kystique

Résumé

Combinaison Ivacaftor et ivacaftor-lumacaftor sont deux nouveaux médicaments CF. Cependant, il y a toujours un manque de compréhension sur leur pharmacocinétique/pharmacodynamique et pharmacologie. Nous présentons une technique HPLC-MS optimisée pour l’analyse simultanée d’ivacaftor et ses principaux métabolites et lumacaftor.

Résumé

Défauts dans le régulateur de la conductance membranaires de la fibrose kystique (CFTR) sont la cause de la fibrose kystique (FK), une maladie dont les manifestations pulmonaires mortelles. Ivacaftor (IVA) et combinaison ivacaftor-lumacaftor (luminance) sont deux nouveaux médicaments pour percée CF directement modulent l’activité et le trafic de la protéine CFTR défectueuse. Cependant, il y a toujours un manque de compréhension sur les paramètres pharmacocinétiques/pharmacodynamiques et la pharmacologie des ivacaftor et lumacaftor. La technique HPLC-MS pour l’analyse simultanée des concentrations d’ivacaftor hydroxyméthyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate et lumacaftor dans les liquides biologiques chez les patients recevant la combinaison standard d’ivacaftor ou ivacaftor-lumacaftor la thérapie a été développé par notre groupe et partiellement validé aux normes FDA. Toutefois, pour permettre l’analyse de haut débit d’un grand nombre d’échantillons de patients, notre groupe a optimisé la méthode signalée par l’utilisation d’une colonne de chromatographie en phase inverse de taille pores plus petite (2,6 µm, C8 100 Å ; 50 x 2.1 mm) et un système de solvants dégradé ( 0-1 min : 40 % B ; 1-2 min : 40-70 % B ; 2-2,7 min : tenue à 70 % B ; 2.7-2,8 min : 70-90 % B ; 2.8-lavage de 4,0 min : 90 % de B ; 4.0-4,1 min : 90-40 % B ; 4.1-6.0 min : tenue à 40 % B) au lieu d’une élution isocratique. L’objectif de cette étude était de réduire le temps d’analyse HPLC-MS par exemple spectaculaire de ~ 15 min à seulement 6 min par échantillon, ce qui est essentiel pour l’analyse d’une grande quantité d’échantillons de patients. Ce moyen de communication sera très utile pour les études sur les relations exposition-réponse de ces médicaments de CF révolutionnaires.

Introduction

Fibrose kystique (FK) est une maladie génétique commune impliquant les glandes exocrines de mucus du poumon, foie, pancréas et les intestins causant la rupture progressive de plusieurs organes, comme une diminution de la fonction pulmonaire et une insuffisance pancréatique^{1, 2,3}. Ivacaftor (IVA) est le premier aliment et Drug Administration (FDA-US) et l’Agence européenne des médicaments (EMA) a approuvé la fibrose kystique membranaires conductance regulator (CFTR) potentialisateur, dont l’efficacité clinique en témoigne, produisant une importante amélioration de la fonction pulmonaire au placebo chez un petit sous-groupe de patients atteints de mucoviscidose portant le G551D-CFTR [glycine (G) en position 551 est remplacé par l’acide aspartique (D)] mutation faux-sens (~ 4 à 5 % de l’effectif des FC)^4,5. Cela administré par voie orale drogue augmente le canal CFTR ouvrir, donc augmenter le flux d’ions chlorure et agissant sur le défaut principal qui mène aux manifestations cliniques de CF^4,6. Malheureusement, IVA en monothérapie n’est pas efficace chez les patients avec la plus commune mutation homozygote de F508del [dans une délétion du gène CFTR qui entraîne la perte de la phénylalanine (F) en position 508 cadre] qui se traduit par CFTR mal repliée, ce qui est vu dans environ 50 % des le CF population^7,8.

Récemment, la FDA a accordé l’homologation permettant de combiner IVA avec le correcteur CFTR drogue lumacaftor. L’habile stratégie de combiner un correcteur CFTR (lumacaftor, LUMA) qui sauve F508del-CFTR à la surface de la cellule avec un modulateur (IVA) qui potentialise l’activité du canal CFTR, étendre efficacement la fenêtre de traitement à la plupart de la population de CF⁵ . Des questions subsistent sur la question de savoir si ces médicaments seront engage réaliser comme un certain nombre de rapports contradictoires est apparues que jeté le doute sur leur efficacité clinique^9,10. En outre, amélioration des fonctions pulmonaires ont été modeste (2,6-4 % seulement pour combinaison ivacaftor-lumacaftor) par rapport aux succès obtenus avec IVA en monothérapie chez les patients ayant une mutation (10,6-12,5 %) de G551D⁸. Des interactions de médicaments antagonistes entre IVA et LUMA qui limitent potentiellement l’efficacité clinique d’ivacaftor-lumacaftor Association viennent de ses propriétés pharmacocinétiques moins qu’idéales^7,11. IVA est fortement métabolisée par les enzymes du cytochrome P450 (CYP), principalement à un métabolite actif hydroxyméthyl-IVA (IVA-M1, M1) et une forme inactive IVA-carboxylate (IVA-M6, M6)^7,12. L’inducteur du CYP3A4 LUMA, en revanche, n’est pas métabolisée et est principalement excrétée inchangée dans les fèces¹¹. Comme inducteurs du CYP3A4 induisent le métabolisme du cytochrome, pourraient ramener les concentrations d’ivacaftor (substrat du CYP3A4). En outre, IVA et la luminosité sont des molécules très hydrophobes et sont ~ 99 % liée aux protéines plasmatiques, ce qui limite considérablement le médicament (actif) gratuit concentration^1,13.

Collectivement, ces facteurs peuvent venir ensemble pour limiter l’efficacité clinique de la combinaison de l’ivacaftor-lumacaftor. On ne sait pas si les concentrations plasmatiques optimale sont atteints dans la posologie actuelle pour combinaison ivacaftor-lumacaftor, ou si le seuil thérapeutique est maintenu⁸. Actuellement, il y a un manque d’informations concernant les paramètres pharmacocinétiques tels que le pic et les concentrations plasmatiques de l’état d’équilibre d’ivacaftor ou ivacaftor-lumacaftor. Compte tenu du métabolisme a noté des ivacaftor et lumacaftor, suivi des relations exposition-réponse est nécessaire pour atteindre les posologies optimales pour la thérapie ivacaftor ou ivacaftor-lumacaftor. Notre groupe a récemment publié la première méthode CLHP/SM-pour le suivi des relations exposition-réponse de l’IVA et LUMA¹⁴. Aucune des techniques alternatives de mesurer les concentrations d’ivacaftor, de ses métabolites et lumacaftor n’ont été signalés à ce jour. Pour permettre l’analyse de haut débit d’un collectif plus grand de patients et de réduire considérablement les temps d’analyse, notre groupe a optimisé la méthode signalée par l’utilisation d’une colonne de chromatographie en phase inverse de taille pores plus petite et un système de solvants dégradé qui réduit le coût et le temps.

Protocole

approbation de l’éthique a été obtenue de la Monash University humaine Comité recherche pour l’éthique (MUHREC).

1. application du test : prélèvement d’échantillons de Patient

1. enregistrer le moment où le patient prend leur dose standard de 150 mg ivacaftor ou ivacaftor 125 mg /lumacaftor 200 mg.
2. Note vers le bas l’heure exacte lorsque l’échantillon de sang de patients est collecté.
   Remarque : Nous recommandons le prélèvement d’échantillons de 4-5 sur un parcours de temps de 24h. Si le prélèvement d’un seul échantillon est possible, le point de l’heure indiquée est 2,5 à 4 h post ivacaftor ou ivacaftor-lumacaftor combinaison de dosage comme C _max des concentrations à l’équilibre seront obtenues après > 5 jours de traitement consécutif.
3. Recueillir 4 à 5 mL de sang dans des tubes bleus non traités commercialement disponibles.
4. Après le prélèvement du sang entier, permettre au sang de coaguler en le laissant intact à température ambiante.
   Remarque : Cela prend habituellement 15 à 30 min.
5. Retirer le caillot par centrifugation à 1 000-2 000 x g pendant 10 min à 4 ° C dans une centrifugeuse réfrigérée. Désigner le surnageant qui en résulte comme plasma.
6. Après la centrifugation, transférer immédiatement le surnageant (plasma) dans un tube en polypropylène nettoyer à l’aide d’une pipette Pasteur. Étiquette le plasma tube avec l’ID du Patient (p. ex., 1 Patient), le médicament administré (par exemple, combinaison ivacaftor-lumacaftor) et le temps de l’échantillon du patient a été collectées (par exemple, dosage après 2,5 h).
7. Échantillons de conserver entre 2 et 8 ° C pendant la manipulation. Une fois que le traitement est achevé, conserver les échantillons à – 20 ° C.
8. Si nécessaire, expédier les échantillons avec un coursier agréé à l’Institut analyse.
   NOTE : Les échantillons doivent être expédiés sur la glace sèche jusqu'à l’arrivée et doivent être maintenus au – 80° C jusqu'à l’analyse.

2. Préparation et traitement des échantillons engagés et normes

Remarque : Plasma provenant de donneurs sains naïfs au traitement ivacaftor/lumacaftor a été obtenue de la Croix Rouge australienne. Afin d’assurer l’intégrité, tous les échantillons/normes doit être entre 2 et 8 ° C au cours de la collecte et le traitement. Une fois que le traitement est achevé, conserver les échantillons à – 20 ° C.

1. Peser IVA IVA-carboxylate, hydroxyméthyl-IVA et LUMA qui servira de référence pour les étalons internes.
2. Préparer les deux solutions indépendantes de chaque analyte (IVA, M1, M6 et luminance) dans le méthanol de qualité LC-MS à 100 µg/mL et à 10 µg/mL.
   Remarque : Composés expirera au bout de 10 jours sur la paillasse.
3. Fraîchement préparer les étalons SM-avant chaque série d’analyses par dilution des normes d’étalonnage solutions dans le plasma humain pour atteindre à la suite des concentrations : 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1.0, 2,5, 5,0 et 10,0 µg/mL. Ces échantillons sont appelées normes.
4. à précipiter les protéines, préparer l’acide formique 0,1 % (FA) dans l’acétonitrile (ACN, SM-grade) et laisser au réfrigérateur jusqu'à ce que nécessaire.

3. Prétraitement des échantillons exposés et des normes

1. laisser les deux échantillons de plasma patient et vierge s’équilibrer à température ambiante.
2. Vortex à mélanger chaque échantillon de plasma pour 15 s par exemple.
3. Transfert d’une quantité de 100 µL de soit plasma Vierge des normes ou des échantillons de patients pour l’analyse dans un tube de microcentrifuge polypropylène de 1,5 mL.
4. Ajouter l’IVA standard interne dans chacun des tubes standards (p. ex., 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1.0, 2,5, 5,0 et 10,0 µg/mL pour couvrir la gamme de concentration possibles), fermer le couvercle et vortexer pendant 2-3 s. Note l’étalon interne est uniquement ajouté au plasma vide et aucun étalon interne n’est ajouté dans les échantillons de patients.
5. Répéter l’étape 3.4. pour les autres normes internes M1, M6 et LUMA.
6. Spin dans chaque tube brièvement pour s’assurer qu’il n’y a pas des gouttelettes sur le couvercle.
7. Ajouter 200 µL du mélange de 0,1 % FA chez ACN dans chaque tube à précipiter les protéines plasmatiques.
8. Vortex le mélange vigoureusement pendant environ 15 s.
9. Autoriser les tubes au repos pendant 10 min dans le réfrigérateur.
10. Centrifuger à 10 000 g pendant 10 min à 4 ° C, si possible.
11. Filtrer une quantité de 200 µL du liquide surnageant à travers un filtre de seringue de 13 mm dans un flacon HPLC de 1,5 mL.
12. Transférer 100 µL de surnageant dans le flacon de LC-MS pour l’analyse HPLC-MS.

4. L’analyse HPLC-MS

Remarque : HPLC-MS l’analyse a été effectuée sur un système de SM-couplé avec le spectromètre de masse quadripolaire triple (tableau 1).

1. Tourner sur le système LC-MS, placez le plateau avec les échantillons à l’échantillonneur automatique.
2. Fixer la colonne sur une colonne de garde et de se connecter au système LC-MS.
3. Fixer les deux bouteilles de phases mobiles (bouteille A: 100 % ACN ; bouteille b : 0,1 % d’acide formique dans l’eau) et équilibrer le système LC-MS.
4. Intégrer les paramètres suivants dans le protocole LC-MS.
   1. Diviser le débit de la phase mobile avant d’entrer dans le spectromètre de masse dans un rapport 2:1 (déchets : MS inlet).
   2. Effectuer une élution gradient à un débit de 0,5 mL/min en utilisant une phase mobile composé de 100 % ACN et 0,1 % d’acide formique dans l’eau (départ à 40 : 60, v/v). Notez que le pourcentage de volume de la phase mobile change tout au long de l’analyse.
   3. Exploiter le spectromètre de masse en mode d’ionisation électrospray positif.
   4. S’assurer que les paramètres de la LC-MS sont les suivants : tension de pulvérisation ionique 4.5 kV, énergie de collision 295,9 V, nébulisation gaz : azote à 3 L/min ; gaz de collision : argon ; séchage gaz débit 20 L/min, tension Q3 de l’objectif :-22 V, désolvatation température 250 ° C avec un bloc chauffant température de 400 ° C.
   5. Volume µL injecter 10 par exemple.
   6. Analytes de détecter à l’aide de plusieurs réaction surveillance (MRM). Surveiller les transitions de l’ion m/z 392.49 → 393, m/z 408.49 → 409, m/z 422.47 → 423 et m/z 452.40 → 453 pour IVA, IVA-M1, IVA-M6 et LUMA, respectivement.
      Remarque : La méthode nouvellement optimisée doit encore être entièrement validée selon les normes FDA.

5. Courbes d’étalonnage

1. Construct la SM-courbes de calibration avant chaque série d’analyses à l’aide de la relation entre les ratios de surface de pic de chacune des quatre analytes à étalon interne et les concentrations nominales standard de calibration de ivacaftor (IVA-M1, IVA-M6 ou LUMA) au sein du programme de réglages de LC-MS.
   Remarque : Les étapes exactes pour la construction de la courbe d’étalonnage est dépendante sur le modèle du SM-matériel utilisé. Cette information peut être disponible dans le manuel de l’équipement.
2. Effectuer une analyse de régression linéaire des moindres carrés en pondérant ² selon la réciproque des concentrations de.

Résultats

Nous avons récemment rapporté une méthode, partiellement validée aux normes FDA, sur un triple-quadripôle LC-MS et d’un système de détecteur CLHP, en utilisant une colonne de C8 (5 µm, i.d. 3,9 x 50 mm) avec la phase mobile, composé de 100 % ACN et 0,1 % d’acide formique dans l’eau (40 : 60 v/v) à un débit de 1 mL/min. Concentrations allant de 0,01 à 10 µg/mL, a observé une corrélation linéaire des pics dans le plasma humain pour tous les métabolites, ivacaftor, Iva-M1, Iva-M6 et lumacaftor

Discussion

Comme indiqué précédemment, notre groupe a pour la première fois élaboré et validé une méthode HPLC et LC-MS pour une détection rapide et la quantification de l’ivacaftor et ses principaux métabolites M1 hydroxyméthyl-IVA (active) et IVA-carboxylate M6 (inactif) ; et lumacaftor dans le plasma et les expectorations de CF patients¹⁴. Le dosage indiqué par notre groupe précédemment a été utilisé avec succès pour quantifier la concentration de LUMA, IVA, IVA-M1 et IVA-M6 dans le p...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
IVA (Cat#S114)	SelleckChem (USA).
LUMA (Cat#S1565)	SelleckChem (USA).
IVA-carboxylate (Cat# 510242247CS)	Clearsynth (Canada).
hydroxymethyl-IVA (Cat# 510240849CS)	Clearsynth (Canada).
Methanol (MeOH, LC-MS grade),	Sigma-Aldrich
acetonitrile (ACN, LC-MS grade)	Sigma-Aldrich
formic acid (FA)	Sigma-Aldrich
triple-quadrupole Shimadzu 8030 LC-MS
Phenomenex Kinetex (2.6 µm C8 100 Å; 50 × 2.1mm)
(KrudKatcher Ultrea HPLC In-Line Filter 0.5 m Depth Filter x 0.004inID).
1.5 mL polypropylene microcentrifuge tube (VWR).
Eppendorf Centrifuge 5430
13-mm syringe filter (0.45 µm nylon, GRACE, USA)
[Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 µL, PTFE/Silicone septa].