Metodo ottimizzato di LC-MS/MS per l'analisi di High-throughput di campioni clinici di Ivacaftor, suoi principali metaboliti e Lumacaftor nei fluidi biologici di pazienti affetti da fibrosi cistica

Riepilogo

Combinazione di ivacaftor e ivacaftor-lumacaftor sono due nuovi farmaci CF. Tuttavia, c'è ancora una carenza di comprensione sulle loro PK/PD e farmacologia. Presentiamo una tecnica ottimizzata di HPLC-MS per l'analisi simultanea di ivacaftor e suoi metaboliti principali e lumacaftor.

Abstract

Difetti nel regolatore di conduttanza del trans-membrana di fibrosi cistica (CFTR) sono la causa della fibrosi cistica (CF), una malattia con le manifestazioni polmonari mortali. Ivacaftor (IVA) e combinazione di ivacaftor-lumacaftor (LUMA) sono due nuovi farmaci svolta CF che modulano direttamente l'attività e il traffico della proteina CFTR difettosa. Tuttavia, c'è ancora una carenza di comprensione sui parametri di farmacocinetica/farmacodinamica e la farmacologia di ivacaftor e lumacaftor. La tecnica HPLC-MS per l'analisi simultanea delle concentrazioni di ivacaftor, idrossimetil-ivacaftor, ivacaftor-carbossilato e lumacaftor nei fluidi biologici in pazienti che ricevono la combinazione standard di ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor la terapia è stata precedentemente sviluppato dal nostro gruppo e parzialmente convalidata a norme FDA. Tuttavia, per consentire l'analisi di alto-rendimento di un numero maggiore di campioni di pazienti, il nostro gruppo ha ottimizzato il metodo segnalato attraverso l'uso di una colonna di cromatografia a fase inversa di dimensioni dei pori più piccolo (2,6 µm, C8 100 Å; 50 x 2.1 mm) e un sistema solvente gradiente ( 0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: detenuta al 70% B; 2,7-2,8 min: 70-90% B; 2,8-4,0 min: 90% lavaggio B; 4.0-4,1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: detenuta al 40% B) invece di un'eluizione isocratica. L'obiettivo di questo studio era quello di ridurre i tempi di analisi di HPLC-MS per campione drammaticamente da ~ 15 min a solo 6 min per campione, che è essenziale per l'analisi di una grande quantità di campioni di pazienti. Questo metodo vantaggioso sarà di notevole utilità per gli studi di relazioni esposizione-risposta tra queste droghe CF svolta.

Introduzione

Fibrosi cistica (CF) è una comune malattia genetica che coinvolge le ghiandole esocrine muco di polmone, fegato, pancreas e intestino provocando progressiva insufficienza multi-organo, come ad esempio un declino della funzione polmonare e insufficienza pancreatica^{1, 2,3}. Ivacaftor (IVA) è il primo Food and Drug Administration (FDA-US) e Agenzia europea dei medicinali (EMA) ha approvato la fibrosi cistica trans-membrana conduttanza regolatore (CFTR) potenziatore farmaco, con efficacia clinica dimostra producendo un significativo miglioramento nella funzione polmonare rispetto al placebo in un piccolo sottoinsieme dei pazienti CF cuscinetto G551D-CFTR [glicina (G) in posizione 551 è sostituita da acido aspartico (D)] mutazione di senso sbagliato (~ 4-5% della popolazione CF)^4,5. Questo oralmente amministrato droga aumenta il canale CFTR aprire, così aumentando il flusso di ioni cloruro e che agiscono per il difetto primario che conduce alle manifestazioni cliniche di CF^4,6. Purtroppo, l'IVA in monoterapia non è efficace in pazienti con la mutazione F508del omozigote più comune [in omissione della struttura del gene CFTR che provoca la perdita di fenilalanina (F) in posizione 508] che si traduce in misfolded CFTR, che è visto in circa 50% di la popolazione CF^7,8.

Recentemente, il FDA ha concesso l'approvazione per la combinazione di IVA con il correttore CFTR droga lumacaftor. La strategia intelligente di combinare un correttore CFTR (lumacaftor, LUMA) che salva F508del-CFTR alla superficie delle cellule con un modulatore (IVA) che rafforza l'attività canale CFTR, efficacemente si espande la finestra di trattamento per la maggior parte della popolazione CF⁵ . Domande rimangono sopra se queste droghe soddisfare loro promessa come un numero di rapporti conflittuali è emerse che messo in dubbio sulla loro efficacia clinica^9,10. Inoltre, miglioramenti nella funzione polmonare sono stati solo modesti (2.6-4% per la combinazione di ivacaftor-lumacaftor) rispetto al successo raggiunto con IVA in monoterapia in pazienti portatori di una mutazione (10.6-12,5%) di G551D⁸. Potenziali interazioni farmaco-farmaco antagonista tra IVA e LUMA che potenzialmente limitare l'efficacia clinica di ivacaftor-lumacaftor combinazione provengono dalla sua proprietà farmacocinetiche meno ideale^7,11. IVA è ampiamente metabolizzata dagli enzimi del citocromo P450 (CYP), principalmente per un metabolita attivo idrossimetil-IVA (IVA-M1, M1) e una forma inattiva IVA-carbossilato (IVA-M6, M6)^7,12. Induttore del CYP3A4, LUMA, d'altra parte, non è ampiamente metabolizzato e in gran parte viene escreta immodificata nelle feci¹¹. Come induttori di CYP3A4 inducono il metabolismo del citocromo, concentrazioni di ivacaftor (substrato del CYP3A4) potrebbero essere ridotto. Inoltre, sia IVA e LUMA sono molecole molto idrofobe e sono ~ 99% legato alle proteine plasmatiche, che limita notevolmente la concentrazione di farmaco libero (attivo)^1,13.

Collettivamente, questi fattori possono essere venuta insieme a limitare l'efficacia clinica di combinazione di ivacaftor-lumacaftor. Non è noto se le concentrazioni plasmatiche ottimali sono raggiunti sotto l'attuale regime di dosaggio per combinazione di ivacaftor-lumacaftor o se la soglia terapeutica è mantenuta⁸. Attualmente, ci è una scarsità di informazioni per quanto riguarda i parametri farmacocinetici come il picco e le concentrazioni plasmatiche allo steady-state di ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor. Dato il metabolismo noto di ivacaftor e lumacaftor, monitoraggio delle relazioni esposizione-risposta è il requisito per raggiungere regimi di dosaggio ottimale per il trattamento di ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor. Il nostro gruppo ha recentemente pubblicato il primo metodo HPLC/LC-MS per il monitoraggio delle relazioni di esposizione-risposta di IVA e LUMA¹⁴. Nessun tecniche alternative di misurare le concentrazioni di ivacaftor, suoi metaboliti e lumacaftor sono stato segnalato fin qui. Per consentire l'analisi di alto-rendimento di un collettivo più grande paziente e ridurre drasticamente i tempi di analisi, il nostro gruppo ha ottimizzato il metodo segnalato attraverso l'uso di una colonna di cromatografia a fase inversa di dimensioni dei pori più piccola e un sistema solvente gradiente che riduce i costi e tempi di esecuzione.

Protocollo

approvazione per l'etica è stata ottenuta da Monash University umana ricerca etica Comitato (MUHREC).

1. applicazione del dosaggio: raccolta del campione di paziente

1. registrare il momento in cui il paziente prende loro dose standard di 150 mg ivacaftor o /lumacaftor di 125 mg di ivacaftor 200 mg.
2. Nota giù l'ora esatta quando il campione di sangue del paziente è raccolto.
   Nota: Si consiglia la raccolta di campioni di 4-5 sopra un corso di tempo di 24 ore. Se la raccolta di un solo campione è possibile, il punto di tempo indicato è 2.5-4 h post ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor combinazione dosaggio come C _max le concentrazioni allo steady state sarà raggiungibile dopo > 5 giorni di trattamento consecutivo.
3. Raccogliere 4-5 mL di sangue in provette blu non trattati commercialmente disponibile.
4. Dopo la raccolta del sangue intero, permettere al sangue di coagularsi lasciando indisturbati a temperatura ambiente.
   Nota: Questo di solito richiede 15-30 min.
5. Rimuovere il coagulo mediante centrifugazione a 1.000-2.000 x g per 10 min a 4 ° C in una centrifuga refrigerata. Designare il surnatante risultante come plasma.
6. Dopo la centrifugazione, immediatamente trasferire il surnatante (plasma) in una provetta pulita in polipropilene utilizzando una pipetta Pasteur. Etichetta il plasma tube con l'ID del paziente (ad es., 1 paziente), il farmaco somministrato (ad es., combinazione di ivacaftor-lumacaftor) e tempo campione del paziente era raccolti (ad esempio, post-dosaggio 2,5 h).
7. Mantenere i campioni a 2-8 ° C durante la movimentazione. Una volta completata la gestione, conservare i campioni a – 20 ° C.
8. Se necessario, nave campioni con un corriere autorizzato all'Istituto analyzing.
   Nota: I campioni devono essere spediti su ghiaccio secco fino all'arrivo e deve essere tenuti a – 80° C fino all'analisi.

2. Preparazione ed elaborazione di campioni sostenute e standard

Nota: Plasma da donatori sani naive alla terapia di ivacaftor/lumacaftor è stato ottenuto dalla croce rossa australiana. Per garantire l'integrità, tutti campioni/standard dovrebbe essere mantenuto a 2-8 ° C durante la raccolta e l'elaborazione. Una volta completata la gestione, conservare i campioni a – 20 ° C.

1. Pesare IVA, IVA-carbossilato, idrossimetil-IVA e LUMA che servirà come riferimento per le altre norme interne.
2. Preparare due soluzioni di riserva indipendente di ciascun analita (IVA, M1, M6 e LUMA) in metanolo LC-MS a 100 µ g/mL e a 10 µ g/mL.
   Nota: Composti scade dopo 10 giorni sul banco.
3. Appena preparare gli standard di calibrazione di LC-MS prima di ogni esecuzione analitica diluendo gli standard di calibrazione soluzioni stock in plasma umano per realizzare a seguito di concentrazioni: 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 e 10.0 µ g/mL. Questi campioni sono indicati come standard.
4. Di precipitare le proteine, preparare acido formico 0.1% (FA) in acetonitrile (ACN, grado di LC-MS) e lasciare in frigorifero fino a quando necessario.

3. Pretrattamento dei campioni sostenute e standard

1. consentire entrambi campioni di plasma paziente e vuoto stabilizzare a temperatura ambiente.
2. Vortice di mescolare ogni campione di plasma per 15 s per esempio.
3. Trasferire un'aliquota di 100 µ l di entrambi plasma vuoto per standard o campioni per l'analisi in una provetta da 1,5 mL in polipropilene microcentrifuga.
4. Aggiungere l'IVA standard interna in ciascuna delle provette standard (ad es., 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 e 10.0 µ g/mL per coprire la gamma potenziale di concentrazione), chiudere il coperchio e agitare con vortex per 2-3 s. nota che standard interno è solo aggiunto al plasma vuoto e standard interno non è aggiunto ai campioni dei pazienti.
5. Ripetere il punto 3.4. per le altre norme interne M1, M6 e LUMA.
6. Spin giù ogni tubo brevemente per garantire che non ci sono nessun goccioline sul coperchio.
7. Aggiungere 200 µ l della miscela dello 0,1% FA in ACN in ciascuna provetta per precipitare le proteine del plasma.
8. Vortice la miscela vigorosamente per circa 15 s.
9. Consentire tubi riposare per 10 minuti in frigorifero.
10. Centrifugare a 10.000 x g per 10 min a 4 ° C, se possibile.
11. Filtrare un'aliquota di 200 µ l del surnatante attraverso un filtro per siringa 13 mm in una fiala di 1,5 mL HPLC.
12. Trasferire 100 µ l del surnatante nel flaconcino di LC-MS per l'analisi di HPLC-MS.

4. Analisi HPLC-MS

Nota: The HPLC-MS analisi è stata eseguita su un sistema LC-MS accoppiato con lo spettrometro di massa triplo quadrupolo (tabella 1).

1. Girare sul sistema LC-MS, posizionare il vassoio con i campioni nel auto-campionatore.
2. Fissare la colonna a una colonna di guardia e connettersi al sistema LC-MS.
3. Collegare entrambe le bottiglie di fasi mobili (bottiglia r: 100% ACN; bottiglia b: 0,1% acido formico in acqua) ed equilibrare il sistema LC-MS.
4. Incorporare i seguenti parametri del protocollo di LC-MS.
   1. Dividere il flusso della fase mobile prima di entrare lo spettrometro di massa in un rapporto 2:1 (rifiuti: MS inlet).
   2. Eseguire un'eluizione di pendenza ad una portata di 0,5 mL/min utilizzando una fase mobile composto da 100% di acido formico ACN e 0,1% in acqua (partenza alle 40: 60, v/v). Si noti che la percentuale di volume della fase mobile cambia nel corso di analisi.
   3. Operare lo spettrometro di massa in una modalità di ionizzazione electrospray positivo.
   4. Assicurarsi che le impostazioni di LC-MS sono i seguenti: tensione di ioni spray 4,5 kV, energia di collisione 295,9 V, gas di nebulizzazione: azoto a 3 L/min; gas di collisione: argon; essiccazione gas portata 20 L/min, tensione Q3 dell'obiettivo:-22 V, desolvatazione temperatura 250 ° C con un blocco di calore temperatura di 400 ° C.
   5. Iniettare 10 µ l per campione.
   6. Rilevare analiti usando la reazione più monitoraggio (MRM). Monitorare le transizioni dello ione m/z 392.49 → 393, m/z 408.49 → 409, m/z 422.47 → 423 e m/z 452.40 → 453 per IVA, IVA-M1, IVA-M6 e LUMA, rispettivamente.
      Nota: Il metodo appena ottimizzato ha ancora completamente essere convalidati secondo le norme FDA.

5. Curve di calibrazione

1. costrutto la LC-MS curve di calibrazione prima di ogni esecuzione analitica utilizzando il rapporto tra i rapporti di area di picco di ciascuna delle quattro analiti di standard interno e le concentrazioni nominali standard di calibrazione di ivacaftor (IVA-M1, IVA-M6 o LUMA) all'interno del programma di impostazioni di LC-MS.
   Nota: La procedura esatta per la costruzione della curva di taratura dipende dal modello di LC-MS attrezzature utilizzate. Queste informazioni possono essere disponibili nel manuale attrezzature.
2. 1/C ² secondo il reciproco delle concentrazioni di ponderazione per eseguire analisi di regressione di minimi quadrati lineari.

Risultati

Recentemente abbiamo segnalato un metodo convalidato parzialmente ai campioni della FDA, su un triplo quadrupolo LC-MS e un sistema rivelatore HPLC, utilizzando una colonna C8 (5 µm, 3,9 mm x 50 mm di diametro interno) con la fase mobile composto da 100% ACN e 0,1% acido formico in acqua (40: 60 v/v) con una portata di 1 mL/min. Una correlazione lineare dei picchi è stata osservata in un intervallo di concentrazione da 0,01 a 10 µ g/mL in plasma umano per tutti i metaboliti, ivacaftor, Iva-M1, M6 Iva e lumacaftor

Discussione

Come precedentemente segnalato, il nostro gruppo ha per la prima volta sviluppato e convalidato un metodo HPLC e LC-MS per tempestiva rilevazione e quantificazione di ivacaftor e dei suoi principali metaboliti M1 idrossimetil-IVA (attivo) e IVA-carbossilato M6 (inattivo); e lumacaftor nel plasma e dell'espettorato di pazienti CF¹⁴. Il saggio segnalato dal nostro gruppo precedentemente è stato usato con successo per quantificare la concentrazione di LUMA, IVA, IVA-M1 e IVA-M6 nel plasma ed espetto...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
IVA (Cat#S114)	SelleckChem (USA).
LUMA (Cat#S1565)	SelleckChem (USA).
IVA-carboxylate (Cat# 510242247CS)	Clearsynth (Canada).
hydroxymethyl-IVA (Cat# 510240849CS)	Clearsynth (Canada).
Methanol (MeOH, LC-MS grade),	Sigma-Aldrich
acetonitrile (ACN, LC-MS grade)	Sigma-Aldrich
formic acid (FA)	Sigma-Aldrich
triple-quadrupole Shimadzu 8030 LC-MS
Phenomenex Kinetex (2.6 µm C8 100 Å; 50 × 2.1mm)
(KrudKatcher Ultrea HPLC In-Line Filter 0.5 m Depth Filter x 0.004inID).
1.5 mL polypropylene microcentrifuge tube (VWR).
Eppendorf Centrifuge 5430
13-mm syringe filter (0.45 µm nylon, GRACE, USA)
[Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 µL, PTFE/Silicone septa].