Ivacaftor, 그것의 주요 대사 산물, 및 생물 학적 체액의 낭 성 섬유 증 환자에서 Lumacaftor의 임상 샘플의 높은 처리량 분석에 대 한 최적화 된 LC-MS/MS 방법

요약

Ivacaftor와 ivacaftor-lumacaftor는 두 개의 새로운 CF 약물. 그러나, 여전히 그들의 PK/PD 및 약리학에 대 한 이해의 부족이입니다. 우리는 주요 대사 산물, ivacaftor 및 lumacaftor의 동시 분석에 대 한 최적화 된 HPLC MS 기법 제시.

초록

결함은 낭 성 섬유 증 횡단 막 전도도 레 귤 레이 터 (CFTR)에 낭 성 섬유 증 (CF), 폐 발현 생명을 위협 하는 질병의 원인입니다. Ivacaftor (IVA)와 ivacaftor-lumacaftor (루마) 조합 활동과 결함이 CFTR 단백질의 밀매를 직접 변조 하는 새로운 획기적인 CF 약 두 있습니다. 그러나, 거기 이다 아직도 pharmacokinetic pharmacodynamic 매개 변수에 대 한 이해의 부족 및 ivacaftor 및 lumacaftor의 약리학 Ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-카복실산, 및 lumacaftor 표준 ivacaftor 또는 ivacaftor lumacaftor 조합 받는 환자에서 생물 학적 체액에서의 농도의 동시 분석을 위한 HPLC MS 기술 치료 이전 되었습니다 우리의 그룹에 의해 개발 및 부분적으로 FDA 표준 유효성 검사. 그러나, 환자 샘플의 많은 수의 높은 처리량 분석을 수 있도록, 우리의 그룹은 최적화 된 작은 기 공 크기 역 상 크로마토그래피 컬럼을 통해 보고 방법 (2.6 µ m, C8 100 Å; 50 x 2.1 m m)와 그라데이션 용 매 시스템 ( 0-1 분: 40 %B; 1-2 분: 40-70 %B; 2-2.7 분: 70 %B;에서 개최 2.7-2.8 분: 70-90 %B; 2.8-4.0 분: 90 %B 세척; 4.0-4.1 분: 90 40 %B; 4.1-6.0 분: 40 %B 개최) isocratic 차입 대신. 이 연구의 목표는 샘플은 많은 양의 환자 샘플의 분석을 위해 필수적인 당 6 분만에 극적으로 ~ 15 분에서 샘플 당 HPLC MS 분석 시간을 단축 했다. 이러한 획기적인 CF 약물의 노출-반응 관계에 연구에 대 한 상당한 유틸리티 편법 방법이 될 것입니다.

서문

낭 성 섬유 증 (CF)는 폐, 간, 췌 장 및 췌 장 불충분^1, 및 폐 기능 감소 등 진보적인 다 기관 실패를 일으키는 원인이 되는 내장의 외 분 비 점액 분 비와 관련 된 일반적인 유전자 질환 ^2,3. Ivacaftor (IVA)는 첫 번째 식품 및 의약품 안전 청 (미국 FDA) 및 유럽 의약품 청 (EMA) 승인 낭 성 섬유 증 횡단 막 전도도 레 귤 레이 터 (CFTR) potentiator 마약, 중요 한 생산 입증된 임상 효능 CF 환자 G551D CFTR 베어링의 작은 하위 집합에 위약을 통해 폐 기능에 있는 개선 [위치 551에에서 글리신 (G)은 aspartic 산 (D)로 대체] missense 돌연변이 (CF 인구의 4 ~ 5%)^4,5. 이 구두 약 증가 CFTR 채널을 열고, 따라서 염화 이온 흐름을 증가 하 고 CF^4,6의 임상 발현에 지도 기본 결함에 관리. 불행히도, IVA monotherapy [위치 508에서 페닐알라닌 (F)의 손실 귀착되는 CFTR 유전자의 프레임 삭제]에서 더 일반적인 homozygous F508del 돌연변이 함께 환자에서 효과적 이다 misfolded CFTR의 50%에서 볼 수 있는 결과 CF 인구^7,8.

최근에, FDA 마약 lumacaftor CFTR 교정기 IVA 결합에 대 한 승인을 부여 했습니다. CFTR 채널 활동, potentiates 변조기 (IVA)와 세포 표면에 F508del-CFTR 구출 CFTR 교정기 (lumacaftor, 루마) 결합의 영리한 전략 효과적으로 CF 인구⁵ 의 대부분 치료 창 확장 . 질문 충돌 보고서의 숫자가 그 캐스트 의심 그들의 임상 효능^9,10시 등장으로 이러한 약물 그들의 약속을 이행할 것입니다 여부에 남아 있습니다. 또한, 폐 기능에 향상 했다만 겸손 (2.6-4% ivacaftor lumacaftor 조합) 환자 G551D 돌연변이 (10.6-12.5%)⁸베어링에 IVA monotherapy 달성 성공에 비해. 잠재적인 대립 약물-약물 상호작용 IVA 및 루마 잠재적으로 ivacaftor lumacaftor 조합의 임상 효능을 제한 하는 이상적 미만 pharmacokinetic 속성^7,11에서 왔습니다. IVA은는 활성 대사 산물 hydroxymethyl-IVA (IVA M1, M1)를 비활성 양식 IVA-카복실산 (IVA M6, M6)^7,12주로 시 토 크롬 P450 효소 (CYP)에 의해 광범위 하 게 대사 된다. CYP3A4 유도 루마, 다른 한편으로, 광범위 하 게 대사 되지 하 고 크게 배설물¹¹에서 변하지 않게 배설 된다. CYP3A4 inducers 유도 시 토 크롬 물질 대사로 ivacaftor (CYP3A4 기판) 농도 감소 될 수 있었다. 또한, IVA 및 루마는 매우 소수 성 분자 그리고 ~ 99%에 바인딩된 플라스마 단백질을 크게 제한 하는 무료 (활성) 약물 농도^1,13.

샨 다, 이러한 요소는 ivacaftor lumacaftor 조합의 임상 효능을 제한 하 함께 올 수 있습니다. Ivacaftor-lumacaftor 조합에 대 한 현재 투여에서 최적의 플라즈마 농도 달성 여부 또는 치료 임계값⁸유지 됩니다 그것은 알 수 없습니다. 현재, 피크 pharmacokinetic 매개에 관한 정보의 부족 및 ivacaftor 또는 ivacaftor lumacaftor의 정상 상태 플라스마 농도 있다. Ivacaftor와 lumacaftor의 유명한 대사를 감안할 때, 노출 응답 관계의 모니터링 ivacaftor 또는 ivacaftor lumacaftor 치료에 대 한 최적의 복용량 식이요법을 달성 하기 위해 필수입니다. 우리의 그룹은 최근 IVA 및 루마¹⁴노출-반응 관계의 모니터링에 대 한 첫 번째 HPLC/LC-MS 방법 게시. 아니 대체 기술은 ivacaftor, 그것의 대사 산물, 및 lumacaftor의 농도 측정의 날짜에 보고 되었습니다. 우리의 그룹은 작은 기 공 크기 역 상 크로마토그래피 열 그라데이션 용 매 시스템을 사용 하 여 보고 된 방법 최적화 큰 환자 집단의 높은 처리량 분석을 허용 하 고 극적으로 분석 시간을 단축 하는 비용 및 실행 시간을 감소 시킨다.

프로토콜

에서 모나 쉬 대학 인간 연구 윤리 위원회 (MUHREC) 윤리에 대 한 승인을 얻은.

1. 분석 결과의 응용 프로그램: 환자 샘플 컬렉션

1. 때 환자 150 mg ivacaftor 또는 ivacaftor 125 mg /lumacaftor의 그들의 표준 복용량을 소요 하는 시간을 기록 200 밀리 그램.
2. 참고 아래 환자 혈액 샘플 수집 하는 때 정확한 시간.
   참고: 24 시간 시간 걸쳐 4-5 샘플을 수집 것이 좋습니다. 안정 상태에서 C _최대 농도 후 달성 될 것입니다 표시 시간 포인트는 2.5-4 h 게시물 ivacaftor 또는 ivacaftor lumacaftor 조합 주입 한 샘플 컬렉션은 가능 하면 > 연속 치료 5 일.
3. 상용 치료 블루 튜브에 혈액의 4-5 mL 수집.
4. 전체 혈액의 수집, 후 실 온에 그대로 두면 응고 혈액 수.
   참고:이 일반적으로 15-30 분 걸립니다
5. 냉장된 원심 분리기에 4 ° C에서 10 분 1000-2000 x g에서 centrifuging 여 혈전을 제거 합니다. 플라즈마로 결과 상쾌한 지정.
6. 원심 분리, 다음 즉시 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 깨끗 한 폴 리 프로필 렌 튜브에 상쾌한 (플라즈마)를 전송. 레이블 플라즈마 환자 ID (예를 들어, 환자 1), (예를 들어, ivacaftor-lumacaftor 조합), 관리 약물 튜브 시간과 환자 샘플 수집 (예를 들어, 2.5 h 후 복용량) 했다.
7. 유지 샘플 2-8 ° C에서 처리 하는 동안. 처리 완료 되 면 저장 샘플에서 – 20 ° c.
8. 필요한 경우 샘플 분석 연구소 승인된 택배 발송.
   참고: 샘플을 드라이 아이스에 도착까지 운송 해야 하 고에 지켜져야 한다 – 분석까지 80 ° C.

2. 준비와 발생 샘플의 처리 및 표준

참고: ivacaftor/lumacaftor 치료에 건강 한 기증자 순진한에서 플라즈마 호주 적십자에서 얻은. 무결성을 보장 하기 위해, 모든 샘플/표준 수집 및 처리 하는 동안 2-8 ° C에 보관 한다. 처리 완료 되 면 저장 샘플에서 – 20 ° C.

1. IVA, IVA 카복실산, hydroxymethyl IVA 및 루마 내부 기준에 대 한 참조 될 것입니다 밖으로 무게.
2. LC MS 학년 메탄올 100 µ g/mL와 10 µ g/mL에서에서 각 분석 (IVA, M1, m 6와 루마)의 두 개의 독립적인 재고 솔루션 준비.
   참고: 화합물 벤치탑에 10 일 후에 만료 됩니다.
3. 갓 준비 각 분석 실행 전에 LC MS 교정 표준 교정 표준 희석에 의해 재고 솔루션 농도 따라 달성 하기 위해 인간 플라스마로: 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 및 10.0 µ g/mL. 이 샘플을 표준 이라고 합니다.
4. 단백질 침전, 이기 (ACN, LC-MS 학년)에서 0.1% 개미 산 (FA)를 준비 하 고 필요한 때까지 냉장고에 두고 하.

3. 발생 샘플 및 표준의 전처리

1. 실내 온도에 equilibrate를 모두 환자와 빈 플라즈마 샘플 수.
2. 15 각 플라즈마 샘플 혼합 소용돌이 샘플 당 s.
3. 폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 표준에 대 한 어느 빈 플라즈마 또는 분석에 대 한 환자 샘플의 100 µ L 약 수 전송.
4. 표준 튜브의 각각에 내부 표준 IVA 추가 (예를 들어, 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 및 잠재적인 농도 범위를 커버 하 10.0 µ g/mL), 뚜껑을 닫고 2-3 미 참고 내부 표준에 대 한 소용돌이입니다만 빈 플라즈마에 추가 없고 내부 표준 환자 샘플에 추가 됩니다.
5. 반복 단계 3.4. 다른 내부 표준 M1, M6, 및 루마.
6. 뚜껑에 아무 방울은 되도록 짧게 각 튜브 아래로 회전.
7. 0.1%의 혼합의 추가 200 µ L 플라스마 단백질 침전을 각 관으로 ACN에 FA.
8. 소용돌이 약 15에 대 한 적극적으로 혼합물 s.
9. 튜브 냉장고에 10 분 동안 서 서 허용.
10. 가능 하면 4 ° C에서 10 분 동안 10000 x g에서 원심.
11. 1.5 mL HPLC 유리병에는 상쾌한의 200 µ L 약 수 13 mm 주사기 필터를 통해 필터링.
12. HPLC MS 분석에 대 한 LC MS 유리병에 상쾌한의 전송 100 µ L.

4. HPLC MS 분석

참고: 트리플 4 극 자 질량 분석기 (표 1)와 결합 하는 LC-MS 시스템에는 HPLC-MS 분석 수행.

1. 설정 LC-MS 시스템에 자동 샘플러에 예제와 함께 트레이에 놓습니다.
2. 가드 열에 열을 연결 하 고 LC-MS 시스템에 연결.
3. 모바일 단계의 두 병을 연결 (a: 병 100 %ACN; 병 b: 0.1% 개미 산 성 물에서) 및 LC-MS 시스템 equilibrate.
4. LC MS 프로토콜에는 다음 매개 변수를 통합.
   1. 2:1 비율에서 질량 분 서 계에 들어가기 전에 모바일 단계 흐름을 분할 (낭비: MS 입구).
   2. 수행 물에 100 %ACN 0.1% 개미 산으로 구성 된 모바일 단계를 사용 하 여 0.5 mL/min의 유량에 그라데이션 차입 (시작 지점에서과, v/v). 분석을 통해 모바일 단계의 볼륨 % 변경 유의.
   3. 긍정적인 분무 이온화 모드에서 질량 분 서 계 운영.
   4. LC MS 설정이 다음과 같습니다 있는지 확인: 이온 스프레이 전압 4.5 kV, 충돌 에너지 295.9 V, 가스 nebulizing: 3 L/min에서 질소; 충돌 가스: 아르곤, 건조 가스 20 L/min 흐름, 전압 3 분기 렌즈:-22 V, desolvation 온도 250 ° C 열 블록 400의 온도 ° c.
   5. 주사 10 µ L 볼륨 샘플 당.
   6. 여러 반응 감시 (MRM)를 사용 하 여 검색 analytes. 모니터 m/z 392.49의 이온 전환 → 393, m/z 408.49 → 409, m/z 422.47 → 423 및 m/z 452.40 → IVA, IVA M1, IVA M6 및 루마, 453 각각.
      참고: 새로 최적화 된 메서드는 아직 FDA 기준에 따라 유효성을 완전히 검사.

5. 보정 곡선

1. 내부 표준 4 개의 analytes의 각각의 피크 면적 비율의 교정 표준 명목상 농도 사이의 관계를 사용 하 여 각 분석 실행 전에 구문 LC-MS 보정 곡선 LC MS 설정 프로그램 내에서 ivacaftor (IVA M1, IVA M6 또는 루마).
   참고: 보정 곡선의 건설에 대 한 정확한 단계는 LC MS 장비 사용 중인 모델에 의존 합니다. 이 정보는 장치 설명서에서 사용할 수 있습니다.
2. 1/C ² 농도의 상호에 따라 가중치에 의해 선형 최소 제곱 회귀 분석을 수행.

결과

우리는 최근 보고 부분적으로 트리플 4 중 극 LC-MS와 HPLC 검출기 시스템에 FDA 기준에 따라 유효성을 검사 하는 방법 (과 물에 100 %ACN 0.1% 포 름 산으로 구성 된 모바일 단계와 C8 열 (5 µ m, 3.9 m m x 50 m m 아이디)를 사용 하 여 v/v) 1 mL/min의 유량에서. 봉우리의 선형 상관 관계는 모든 대사 산물, ivacaftor, Iva M1, Iva-M6, 및 lumacaftor¹⁴에 대 한 인간의 플라즈마에 0.01에서 10 µ g/mL의 농도 범위 관...

토론

이전에 보고 된, 우리의 그룹은 처음으로 개발 및 신속한 검출 및 ivacaftor 및 hydroxymethyl IVA M1 (활성) 및 IVA 카복실산 M6 (비활성); 그것의 주요 대사 산물의 정량화를 위한 HPLC 및 LC MS 메서드를 유효성 검사에 대 한 그리고 lumacaftor 플라즈마와 CF 환자¹⁴의 래. 우리의 그룹에 의해 이전 보고 분석 결과 성공적으로 루마, IVA, IVA M1 및 IVA-M6 플라즈마에서의 농도 CF 환자 IVA 150 mg /q12 h와 정?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
IVA (Cat#S114)	SelleckChem (USA).
LUMA (Cat#S1565)	SelleckChem (USA).
IVA-carboxylate (Cat# 510242247CS)	Clearsynth (Canada).
hydroxymethyl-IVA (Cat# 510240849CS)	Clearsynth (Canada).
Methanol (MeOH, LC-MS grade),	Sigma-Aldrich
acetonitrile (ACN, LC-MS grade)	Sigma-Aldrich
formic acid (FA)	Sigma-Aldrich
triple-quadrupole Shimadzu 8030 LC-MS
Phenomenex Kinetex (2.6 µm C8 100 Å; 50 × 2.1mm)
(KrudKatcher Ultrea HPLC In-Line Filter 0.5 m Depth Filter x 0.004inID).
1.5 mL polypropylene microcentrifuge tube (VWR).
Eppendorf Centrifuge 5430
13-mm syringe filter (0.45 µm nylon, GRACE, USA)
[Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 µL, PTFE/Silicone septa].