Método otimizado de LC-MS/MS para a análise do elevado-throughput de amostras clínicas de Ivacaftor, seus principais metabolitos e Lumacaftor em fluidos biológicos de pacientes de fibrose cística

Resumo

Combinação de Ivacaftor e ivacaftor-lumacaftor são duas novas drogas CF. No entanto, ainda há uma falta de entendimento sobre sua PK/PD e farmacologia. Apresentamos uma técnica de HPLC-MS otimizada para a análise simultânea de ivacaftor e seus principais metabolitos e lumacaftor.

Resumo

Defeitos no regulador de condutância trans-membrana de fibrose cística (CFTR) são a causa da fibrose cística (CF), uma doença com manifestações pulmonares fatais. Ivacaftor (IVA) e a combinação de ivacaftor-lumacaftor (LUMA) são duas novas drogas descoberta CF que modulam diretamente a atividade e o tráfico da proteína CFTR defeituosa. No entanto, ainda há uma falta de entendimento sobre os parâmetros farmacocinéticos/farmacodinâmicos e a farmacologia do ivacaftor e lumacaftor. A técnica de HPLC-MS para a análise simultânea das concentrações de hidroximetil-ivacaftor, ivacaftor, ivacaftor-carboxilato e lumacaftor em fluidos biológicos em pacientes recebendo a combinação padrão de ivacaftor ou ivacaftor-lumacaftor terapia já havia sido desenvolvido pelo nosso grupo e parcialmente validado para padrões do FDA. No entanto, para permitir a análise da elevado-produção de um maior número de amostras de doentes, nosso grupo otimizou o método relatado com o uso de uma coluna de cromatografia de fase reversa de tamanho de poro menor (2,6 µm, C8 100 Å; 50 x 2.1 mm) e um sistema de solvente gradiente ( 0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: realizada em 70% B; 2,7-2,8 min: 70-90% B; 2.8-lavagem de B 4,0 min: 90%; 4.0-4,1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: realizada em 40% B) em vez de uma eluição isocrática. O objetivo deste estudo foi reduzir o tempo de análise de HPLC-MS por amostra dramaticamente de ~ 15 min para apenas 6 min, por exemplo, que é essencial para a análise de uma grande quantidade de amostras de doentes. Esse método conveniente será de considerável utilidade para estudos nas relações de exposição-resposta dessas drogas de CF de avanço.

Introdução

Fibrose cística (CF) é uma doença genética comum, que envolve as glândulas exócrinas muco do pulmão, fígado, pâncreas e intestino causando insuficiência de múltiplos órgão progressiva, como um declínio na função pulmonar e insuficiência pancreática^{1, 2,3}. Ivacaftor (IVA) é o primeiro Food and Drug Administration (FDA-EUA) e a Agência Europeia de medicamentos (EMA) aprovou a droga de potenciador do regulador (CFTR) de condutância de trans-membrana fibrose cística, com eficácia clínica evidenciada, produzindo uma significativa melhora na função pulmonar sobre placebo em um pequeno subconjunto de pacientes com FC tendo o G551D-CFTR [glicina (G) na posição 551 é substituída pelo ácido aspártico (D)] mutação missense (~ 4-5% da população CF)^4,5. Esta administrada por via oral a droga aumenta o canal CFTR, abrindo, assim, aumentar o fluxo de íons cloreto e agindo sobre o defeito primário que leva para as manifestações clínicas da CF^4,6. Infelizmente, o IVA em monoterapia não é eficaz em pacientes com a mutação mais comum de F508del homozigota [na exclusão de quadro do gene CFTR que resulta na perda de fenilalanina (F) na posição 508] que resulta em misfolded CFTR, o que é visto em ~ 50% de o CF população^7,8.

Recentemente, o FDA concedeu aprovação para a combinação de IVA com o corrector CFTR lumacaftor de drogas. A estratégia inteligente de combinar um corrector CFTR (lumacaftor, LUMA) que resgata F508del-CFTR à superfície da célula com um modulador (IVA), que potencializa a atividade de canais CFTR, efetivamente expande a janela de tratamento para a maioria da população CF⁵ . Dúvidas sobre se essas drogas vão cumprir sua promessa como um número de relatos conflitantes surgiram dúvidas sobre sua eficácia clínica^9,10elenco. Além disso, melhorias na função pulmonar foram apenas modesta (2.6-4% para a combinação de ivacaftor-lumacaftor) em comparação com o sucesso alcançado com IVA monoterapia em pacientes tendo um G551D mutação (10.6-12,5%)⁸. Potenciais interacções medicamentosas antagônica entre IVA e LUMA que potencialmente limitam a eficácia clínica da combinação de ivacaftor-lumacaftor vem de suas propriedades farmacocinéticas ideal menos de^7,11. IVA é extensivamente metabolizada pelas enzimas de citocromo P450 (CYP), principalmente para um metabólito ativo hidroximetil-IVA (IVA-M1, M1) e uma forma inactiva IVA-carboxilato (IVA-M6, M6)^7,12. O indutor de CYP3A4 LUMA, por outro lado, não é extensivamente metabolizado e é largamente excretado inalterado na fezes¹¹. Como indutores de CYP3A4 induzem o metabolismo do citocromo, concentrações de ivacaftor (substrato de CYP3A4) poderiam ser reduzidas. Além disso, tanto o IVA e LUMA são moléculas muito hidrofóbicas e são ~ 99% ligado às proteínas plasmáticas, que limita significativamente a concentração de droga livre (ativa)^1,13.

Coletivamente, esses fatores podem estar chegando juntos para limitar a eficácia clínica da combinação de ivacaftor-lumacaftor. Não se sabe se as concentrações plasmáticas ideais são alcançadas sob o regime de dosagem atual para combinação de ivacaftor-lumacaftor ou se o limiar terapêutico é mantido⁸. Atualmente, há uma escassez de informações sobre parâmetros farmacocinéticos, como o pico e concentrações plasmáticas de estado estacionário de ivacaftor ou ivacaftor-lumacaftor. Tendo em conta o metabolismo notável de ivacaftor e lumacaftor, monitoramento das relações de exposição-resposta é indispensável para alcançar regimes de dosagem ideal para terapia de ivacaftor ou ivacaftor-lumacaftor. Nosso grupo publicou recentemente o primeiro método HPLC/LC-MS para o monitoramento das relações de exposição-resposta de IVA e LUMA¹⁴. Não há técnicas alternativas de medir as concentrações de ivacaftor, seus metabólitos e lumacaftor foram relatadas até à data. Para permitir a análise do elevado-throughput de um coletivo maior do paciente e reduzir drasticamente o tempo de análise, o nosso grupo otimizou o método relatado com o uso de uma coluna de cromatografia de fase reversa de tamanho de poros menor e um sistema de solvente gradiente que reduz custos e tempos de corrida.

Protocolo

aprovação ética foi obtida da Monash University humano pesquisa ética Comissão (MUHREC).

1. aplicação do ensaio: coleta de amostra de paciente

1. registrar o tempo quando o paciente toma sua dose padrão de 150 mg ivacaftor ou /lumacaftor de 125 mg de ivacaftor 200 mg.
2. Nota para baixo o tempo exato quando a amostra de sangue do paciente é recolhida.
   Nota: Recomendamos que a coleta de amostras de 4-5 sobre um curso de tempo de 24 h. Se a coleta de única amostra é possível, o ponto do tempo indicado é 2.5-4 h post ivacaftor ou ivacaftor-lumacaftor combinação de dosagem como C _máx concentrações no estado estacionário será realizáveis após > 5 dias de tratamento consecutivo.
3. Coletar 4-5 mL de sangue em tubos de azuis não tratados comercialmente disponíveis.
4. Após a coleta do sangue total, permitem que o sangue a coagular, deixando-a intacta à temperatura ambiente.
   Nota: Isto normalmente leva 15-30 min.
5. Remover o coágulo por centrifugação a 1.000-2.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C em uma centrífuga refrigerada. Designar o sobrenadante resultante como plasma.
6. Após centrifugação, imediatamente transferir o sobrenadante (plasma) em um tubo limpo polipropileno usando uma pipeta Pasteur. Rótulo o plasma do tubo com a identificação do paciente (por exemplo, 1 paciente), a droga administrada (por exemplo, combinação de ivacaftor-lumacaftor) e tempo de amostra do paciente foi coletado (por exemplo, pós-dosagem de 2,5 h).
7. Amostras de manter a 2-8 ° C durante a manipulação. Uma vez que o tratamento é concluído, armazenar as amostras em – 20 ° C.
8. , Se necessário, enviamos amostras com um mensageiro aprovado ao Instituto analisando.
   Nota: As amostras estão a ser transferidos em gelo seco até a chegada e devem ser mantidas em – 80° C até análise.

2. Preparação e processamento de amostras efectuadas e normas

Nota: Plasma de doadores saudáveis ingênuo para terapia ivacaftor/lumacaftor foi obtido da Cruz Vermelha australiana. Para garantir a integridade, todas as amostras/padrões devem ser mantidos a 2-8 ° C durante a colheita e o processamento. Uma vez que o tratamento é concluído, armazenar as amostras em – 20 ° C.

1. Pesar IVA, IVA-carboxilato, hidroximetil-IVA e LUMA, que servirá como referência para as normas internas.
2. Preparar duas soluções estoque independentes de cada analito (IVA, M1, M6 e LUMA) em metanol de grau de LC-MS a 100 µ g/mL e 10 µ g/ml.
   Nota: Compostos expirará após 10 dias sobre a bancada.
3. Recém preparar padrões de calibração de LC-MS antes de cada execução analítica por diluição dos padrões de calibração Soluções conservadas em estoque em plasma humano para atingir concentrações na sequência: 0,01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5,0 e 10,0 µ g/mL. Estas amostras são referidas como padrões.
4. De precipitar proteínas, preparar 0,1% de ácido fórmico (FA) em acetonitrila (ACN, grau de LC-MS) e deixar na geladeira até ser necessário.

3. Pré-tratamento de amostras efectuadas e normas

1. permitir que ambas as amostras de plasma do paciente e em branco equilibrar a temperatura ambiente.
2. Vortex para misturar cada amostra de plasma por 15 s por exemplo.
3. Transferir uma alíquota de 100 µ l de qualquer plasma em branco para os padrões ou as amostras para análise em um tubo de polipropileno microcentrifuga 1,5 mL.
4. Acrescentar a IVA de padrão interna em cada um dos tubos padrão (por exemplo, 0,01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 e 10,0 µ g/mL para cobrir o intervalo de concentração potencial), feche a tampa e vórtice para 2-3 s. nota que a norma interna é apenas adicionado ao plasma em branco e sem padrão interno é adicionado das amostras.
5. Repita o passo 3.4. para os outros padrões internos, M1, M6 e LUMA.
6. Spin-down cada tubo brevemente para assegurar que não há nenhum gotículas na tampa.
7. Adicionar 200 µ l da mistura de 0,1% de FA na ACN em cada tubo de precipitar proteínas plasmáticas.
8. Vortex a mistura vigorosamente por cerca de 15 s.
9. Permitir que tubos repousar durante 10 min na geladeira.
10. Centrifugar a 10.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C, se possível.
11. Filtrar num filtro de seringa de 13 mm em um frasco HPLC de 1,5 mL uma alíquota de 200 µ l do sobrenadante.
12. Transferir 100 µ l do sobrenadante dentro do frasco de LC-MS para a análise de HPLC-MS.

4. Análise de HPLC-MS

Nota: HPLC-MS a análise foi realizada em um sistema de LC-MS, juntamente com o espectrômetro de massa triplo quadrupolo (tabela 1).

1. Transformar o sistema de LC-MS, coloque a bandeja com as amostras no autoamostrador.
2. Unir a coluna a uma coluna de guarda e se conectar ao sistema de LC-MS.
3. Anexar as duas garrafas de fases móveis (frasco r: 100% do Grupo ACN; garrafa b: 0,1% de ácido fórmico na água) e equilibrar o sistema de LC-MS.
4. Incorporar os seguintes parâmetros do protocolo de LC-MS.
   1. Dividir o fluxo de fase móvel antes de entrar o espectrômetro de massa na proporção de 2:1 (resíduos: entrada de MS).
   2. Realizar uma gradiente eluição com um caudal de 0,5 mL/min usando uma fase móvel composta de 100% do Grupo ACN e 0,1% ácido fórmico em água (inicio em 40: 60, v/v). Note-se que a porcentagem de volume de fase móvel muda ao longo da análise.
   3. Operar o espectrômetro de massa em um modo de ionização electrospray positivo.
   4. Certifique-se de que as configurações de LC-MS são os seguintes: tensão de pulverizador de íon 4,5 kV, energia de colisão 295.9 V, gás de nebulização: nitrogênio em 3 L/min; gás de colisão: argônio; secagem gás vazão 20 L/min, lente tensão Q3:-22 V, desolvation temperatura 250 ° C, com um bloco de calor temperatura de 400 ° C.
   5. Volume de injectar 10 µ l por exemplo.
   6. Detectar analitos usando múltiplas reação monitoramento (MRM). Monitorar as transições do íon de m/z 392.49 → 393, m/z 408.49 → 409, m/z 422.47 → 423 e m/z 452.40 → 453 para IVA, IVA-M1, IVA-M6 e LUMA, respectivamente.
      Nota: O método recém otimizado ainda tem que ser totalmente validado conforme normas FDA.

5. As curvas de calibração

1. as curvas de calibração de construção o LC-MS antes de cada corrida analítica, usando a relação entre as proporções de área do pico de cada uma das substâncias a quatro analisar de padrão interno e as concentrações nominais padrão de calibração de ivacaftor (M1-IVA, IVA-M6 ou LUMA) dentro do programa de configurações de LC-MS.
   Nota: As etapas exatas para a construção da curva de calibração é dependente do modelo de equipamento de LC-MS sendo usado. Essas informações podem estar disponíveis no manual do equipamento.
2. Realizar a análise de regressão linear menos-quadrados por ponderação 1/C ², de acordo com a recíproca das concentrações.

Resultados

Temos recentemente relatado um método validado parcialmente às normas da FDA, em um triplo-quadrupolo LC-MS e um sistema detector HPLC, usando uma coluna C8 (5 µm, identificação de 3,9 mm x 50 mm) com a fase móvel composta de 100% do Grupo ACN e 0,1% ácido fórmico em água (40: 60 v/v) em uma taxa de fluxo de 1 mL/min. Uma correlação linear dos picos observou-se uma faixa de concentração de 0,01 a 10 µ g/mL no plasma humano para todos os metabólitos, ivacaftor, Iva-M1, Iva-M6 e lumacaftor^1...

Discussão

Como relatado anteriormente, o nosso grupo tem para primeira vez desenvolvido e validado um método HPLC e LC-MS para a rápida detecção e quantificação de ivacaftor e seus principais metabolitos M1 hidroximetil-IVA (ativo) e IVA-carboxilato M6 (inativo); e lumacaftor no plasma e escarro de CF pacientes¹⁴. O ensaio relatado anteriormente pelo nosso grupo foi usado com sucesso para quantificar a concentração de LUMA, IVA, IVA-M1 e IVA-M6 no plasma e escarro de pacientes com FC submetidos à t...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
IVA (Cat#S114)	SelleckChem (USA).
LUMA (Cat#S1565)	SelleckChem (USA).
IVA-carboxylate (Cat# 510242247CS)	Clearsynth (Canada).
hydroxymethyl-IVA (Cat# 510240849CS)	Clearsynth (Canada).
Methanol (MeOH, LC-MS grade),	Sigma-Aldrich
acetonitrile (ACN, LC-MS grade)	Sigma-Aldrich
formic acid (FA)	Sigma-Aldrich
triple-quadrupole Shimadzu 8030 LC-MS
Phenomenex Kinetex (2.6 µm C8 100 Å; 50 × 2.1mm)
(KrudKatcher Ultrea HPLC In-Line Filter 0.5 m Depth Filter x 0.004inID).
1.5 mL polypropylene microcentrifuge tube (VWR).
Eppendorf Centrifuge 5430
13-mm syringe filter (0.45 µm nylon, GRACE, USA)
[Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 µL, PTFE/Silicone septa].