Método optimizado de LC-MS/MS para el análisis de alto rendimiento de las muestras clínicas de Ivacaftor, sus principales metabolitos y Lumacaftor en fluidos biológicos de pacientes con Fibrosis quística

Resumen

Combinación de ivacaftor y ivacaftor lumacaftor son dos nuevos fármacos de CF. Sin embargo, todavía hay una carencia de entendimiento sobre su PK/PD y farmacología. Presentamos una técnica de HPLC-MS optimizada para el análisis simultáneo de ivacaftor y sus principales metabolitos y lumacaftor.

Resumen

Defectos en el regulador de conductancia trans membrana de fibrosis quística (CFTR) son la causa de la fibrosis quística (FQ), una enfermedad con manifestaciones pulmonares mortales. El ivacaftor (IVA) y combinación de ivacaftor-lumacaftor (LUMA) son dos nuevos medicamentos avance CF que modulan directamente la actividad y el tráfico de la proteína CFTR defectuosa. Sin embargo, todavía hay una falta de entendimiento en los parámetros farmacocinéticos/farmacodinámicos y la farmacología de ivacaftor y lumacaftor. La técnica de HPLC-MS para el análisis simultáneo de las concentraciones de ivacaftor, hidroximetil-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate y lumacaftor en fluidos biológicos en pacientes que reciben la combinación estándar de ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor la terapia ha sido desarrollada por nuestro grupo y validado parcialmente a las normas de la FDA. Sin embargo, para permitir el análisis de alto rendimiento de un mayor número de muestras de pacientes, nuestro grupo ha optimizado el método divulgado a través de una columna de cromatografía de fase inversa de tamaño de poro más pequeño (2.6 μm, C8 100 Å; 50 x 2,1 mm) y un sistema solvente degradado ( 0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: en 70% B; 2.7-2,8 min: 70-90% de B; 2,8-4,0 min: 90% lavado de B; 4.0-4,1 min: 90-40% B; 4.1 6.0 min: en 40% B) en lugar de una elución isocrática. El objetivo de este estudio era reducir el tiempo de análisis HPLC-MS por muestra dramáticamente de ~ 15 minutos a sólo 6 minutos por muestra, que es esencial para el análisis de una gran cantidad de muestras de pacientes. Este método conviene será de gran utilidad para estudios en las relaciones exposición-respuesta de estas drogas de CF de avance.

Introducción

La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad genética común que implica las glándulas exocrinas de la mucosa del pulmón, hígado, páncreas y los intestinos causando insuficiencia multiorgánica progresiva, como una disminución en la función pulmonar y la insuficiencia pancreática^{1, 2,3}. Ivacaftor (IVA) es el primer Food and Drug Administration (FDA-US) y Agencia Europea de medicamentos (EMA) aprobó fibrosis quística trans membrana conductancia regulador (CFTR) potenciador de drogas, con eficacia clínica se manifiesta produciendo un significativo mejora la función pulmonar en comparación con placebo en un pequeño subgrupo de pacientes con FQ teniendo la G551D-CFTR [glicina (G) en posición 551 es reemplazado por ácido aspártico (D)] mutación sin sentido (~ 4-5% de la población de CF)^4,5. Esto administrados por vía oral drogas aumenta el canal CFTR abriendo, así aumentar el flujo de iones de cloruro y actuando sobre el defecto primario que conduce a las manifestaciones clínicas de CF^4,6. Lamentablemente, IVA monoterapia no es eficaz en pacientes con la mutación más común de F508del homocigótica [en canceladura del marco del gen CFTR que se traduce en la pérdida de la fenilalanina (F) en la posición 508] que resulta en mal plegada CFTR, que se observa en ~ 50% de la población de CF^7,8.

Recientemente, la FDA otorgó la aprobación para combinar IVA con el corrector CFTR lumacaftor drogas. La inteligente estrategia de combinar un corrector CFTR (lumacaftor LUMA) que rescata la F508del-CFTR a la superficie de la célula con un modulador (IVA) que potencia la actividad del canal CFTR, efectivamente se expande la ventana de tratamiento a la mayoría de la población de CF⁵ . Sigue habiendo preguntas sobre si estos fármacos cumplirá su promesa como un número de informes contradictorios han emergido poner en duda sobre su eficacia clínica^9,10. Además, mejoras en la función pulmonar fueron sólo modesto (2.6-4% para combinación ivacaftor-lumacaftor) en comparación con el éxito alcanzado con la monoterapia en pacientes con una mutación (10.6-12,5%) de G551D⁸de IVA. Posibles interacciones de fármacos antagonistas entre IVA y LUMA que limitan potencialmente la eficacia clínica de la combinación lumacaftor ivacaftor provienen de sus propiedades farmacocinéticas ideal menos de^7,11. IVA es ampliamente metabolizada por las enzimas del citocromo P450 (CYP), principalmente a un metabolito activo hidroximetil-IVA (IVA-M1, M1) y una forma inactiva de^7,IVA-carboxylate (IVA-M6, M6)¹². El inductor de CYP3A4 LUMA, por otro lado, no se metaboliza extensamente y en gran parte se excreta inalterado en la heces¹¹. Como inductores de CYP3A4 inducen metabolismo del citocromo, se podrían reducir concentraciones ivacaftor (sustrato de CYP3A4). Por otra parte, tanto el IVA como LUMA son moléculas muy hidrofóbicas y están obligado ~ 99% a proteínas plasmáticas, que limita significativamente la concentración de libre de drogas (activo)^1,13.

Colectivamente, estos factores pueden ser que se reúnen para limitar la eficacia clínica de la combinación de ivacaftor-lumacaftor. No se sabe si se alcanzan las concentraciones plasmáticas óptimas bajo el actual régimen de dosificación para el ivacaftor-lumacaftor combinación o si el umbral terapéutico se mantiene⁸. Actualmente, hay una escasez de información sobre los parámetros farmacocinéticos como el pico y las concentraciones plasmáticas de estado estacionario de ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor. Dado el notable metabolismo de ivacaftor y lumacaftor, seguimiento de las relaciones exposición-respuesta es requisito para alcanzar regímenes de dosis óptima para tratamiento ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor. Nuestro grupo ha publicado recientemente el primer método HPLC, LC-MS para la supervisión de las relaciones exposición-respuesta de IVA y LUMA¹⁴. No hay técnicas alternativas de medición de las concentraciones de ivacaftor, sus metabolitos y lumacaftor se han divulgado hasta la fecha. Para permitir el análisis de alto rendimiento de un colectivo de pacientes mayor y para reducir drásticamente el tiempo de análisis, nuestro grupo ha optimizado el método divulgado a través de una columna de cromatografía de fase inversa de tamaño de poro más pequeño y un sistema solvente degradado que reduce costos y tiempos en marcha.

Protocolo

aprobación de ética se obtuvo de Monash University humano investigación ética Comité (MUHREC).

1. aplicación de la prueba: toma de muestras de paciente

1. registrar el tiempo cuando el paciente toma la dosis estándar de 150 mg el ivacaftor o ivacaftor 125 mg /lumacaftor 200 mg.
2. Nota abajo el tiempo exacto cuando se recoge la muestra de sangre del paciente.
   Nota: Se recomienda recoger muestras de 4-5 en un transcurso de tiempo 24 h. Si la colección de solo muestra es posible, el momento indicado es 2.5-4 h post ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor combinación de dosificación como C _máximo las concentraciones en estado estacionario será alcanzables después de > 5 días de tratamiento consecutivo.
3. Recoger 4-5 mL de sangre en tubos azul sin tratamiento disponibles en el mercado.
4. Después de la recolección de la sangre, que la sangre coagule dejando tranquilo a temperatura ambiente.
   Nota: Esto generalmente toma 15-30 minutos
5. Eliminar el coágulo por centrifugación a 1.000-2.000 x g durante 10 min a 4 ° C en una centrífuga refrigerada. Designar el sobrenadante resultante como plasma.
6. Después de centrifugación, inmediatamente transferir el sobrenadante (plasma) en un tubo limpio de polipropileno con una pipeta Pasteur. Etiqueta el plasma del tubo con el ID del paciente (p. ej., paciente 1), el medicamento administrado (por ejemplo, combinación de ivacaftor-lumacaftor) y tiempo de la muestra del paciente fue recogida (p. ej., dosis después de 2,5 h).
7. Mantener las muestras a 2-8 ° C durante la manipulación. Una vez terminado el tratamiento, almacenar las muestras en – 20 ° C.
8. Si es necesario, enviar las muestras con un mensajero aprobado al Instituto análisis.
   Nota: Las muestras deben enviarse en hielo seco hasta su llegada y debe mantenerse en – 80° C hasta análisis.

2. Preparación y procesamiento de muestras efectuados y normas

Nota: Plasma de donantes sanos ingenuos al ivacaftor/lumacaftor tratamiento se obtuvo de la Cruz Roja australiana. Para asegurar la integridad, todas las muestras y normas debe mantenerse a 2-8 ° C durante la recolección y procesamiento. Una vez terminado el tratamiento, almacenar las muestras en – 20 ° C.

1. Pesar IVA, IVA-carboxylate, hidroximetil-IVA y LUMA que servirá como referencia para los estándares internos.
2. Preparar dos soluciones independientes de cada analito (IVA, M1, M6 y LUMA) en metanol de grado LC-MS en 100 μg/mL y 10 μg/ml.
   Nota: Los compuestos expirará después de 10 días en el escritorio.
3. Recién preparar LC-MS, patrones de calibración antes de cada serie analítica mediante la dilución de los estándares de calibración soluciones en plasma humano para lograr a raíz de las concentraciones: 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 y 10.0 μg/mL. Estas muestras se denominan normas.
4. Para precipitar proteínas, preparar 0.1% de ácido fórmico (FA) en acetonitrilo (ACN, grado de LC-MS) y deja en el refrigerador hasta que sea necesario.

3. Tratamiento previo de muestras efectuados y normas

1. tanto muestras de plasma del paciente y en blanco se equilibren a temperatura ambiente.
2. Vortex para mezclar cada muestra de plasma de 15 s por ejemplo.
3. Transfiera una alícuota de 100 μl de cualquiera plasma sin estándares o muestras para análisis en un tubo de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 mL.
4. Añadir el IVA estándar interno en cada uno de los tubos estándar (por ejemplo, 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 y 10.0 μg/mL para cubrir el potencial rango de concentración), cierre la tapa y vortex por 2-3 s. Nota esa norma interna es sólo Añadida al plasma en blanco y no estándar interno se agrega a las muestras del paciente.
5. Repita el paso 3.4. de los otros estándares internos M1, M6 y LUMA.
6. Vuelta abajo cada tubo brevemente para asegurar que hay no hay gotas en la tapa de.
7. Añadir 200 μL de la mezcla de 0.1% FA en ACN en cada tubo para precipitar las proteínas del plasma.
8. Vórtice la mezcla vigorosamente durante 15 s.
9. Tubos reposar 10 minutos en el refrigerador.
10. Centrifugar a 10.000 x g durante 10 min a 4 ° C, si es posible.
11. Filtrar una alícuota de 200 μL del sobrenadante a través de un filtro de la jeringuilla de 13 m m en un frasco HPLC de 1.5 mL.
12. Transferir 100 μl del sobrenadante en el frasco de LC-MS para el análisis de HPLC-MS.

4. El análisis por HPLC-MS

Nota: HPLC-MS el análisis fue realizado en un sistema LC-MS juntado con el espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (tabla 1).

1. Vuelta en el sistema LC-MS, coloque la bandeja con las muestras en el dechado auto.
2. Fijar la columna en una columna de guardia y conectar al sistema LC-MS.
3. Conectar dos botellas de fases móviles (botella A: 100% ACN; botella B: 0,1% ácido fórmico en agua) y equilibrar el sistema LC-MS.
4. Incorporar a los siguientes parámetros en el protocolo de LC-MS.
   1. Divide el flujo de fase móvil antes de entrar en el espectrómetro de masas en una proporción 2:1 (residuos: entrada de MS).
   2. Realizar una elución gradiente a un flujo de 0,5 mL/min utilizando una fase móvil que consiste en 100% ACN y 0.1% de ácido fórmico en agua (40: 60, el punto de partida v/v). Tenga en cuenta que el porcentaje de volumen de la fase móvil cambia a lo largo del análisis.
   3. Operar el espectrómetro de masas en modo de ionización por electrospray positivo.
   4. Asegúrese de que los valores de LC-MS son los siguientes: voltaje de spray ion 4,5 kV, energía de la colisión 295.9 V, nebulización gas: nitrógeno a 3 L/min, gas de colisión: argón; secado gas caudal 20 L/min, voltaje Q3 de la lente:-22 V, desolvation temperatura 250 ° C con un bloque de calor temperatura de 400 ° C.
   5. Volumen de inyectar 10 μl por muestra.
   6. Detectar analitos usando la reacción múltiple (MRM) de monitoreo. Seguimiento de las transiciones del ion de m/z 392.49 → 393, m/z 408.49 → 409, m/z 422.47 → 423 y m/z 452.40 → 453 para IVA, IVA-M1, M6 IVA y LUMA, respectivamente.
      Nota: El método recientemente optimizado aún tiene que ser plenamente validado según estándares de la FDA.

5. Curvas de calibración

1. construir la LC-MS curvas de calibración antes de cada serie analítica usando la relación entre las proporciones de área de pico de cada uno de los cuatro analitos a estándar interno y las calibración estándar nominal las concentraciones de El ivacaftor (IVA-M1, M6 IVA o LUMA) dentro del programa de configuración de LC-MS.
   Nota: Los pasos exactos para la construcción de la curva de calibración es dependiente en el modelo de equipo LC-MS se utiliza. Esta información puede estar disponible en el manual del equipo.
2. Realizar el análisis de regresión lineal de mínimos cuadrados ponderando ² según el recíproco de las concentraciones de.

Resultados

Recientemente hemos reportado un método, validado parcialmente a las normas de la FDA, en un triple cuadrupolo LC-MS y un sistema de detector HPLC, usando una columna C8 (5 μm, 3,9 x 50 mm diámetro interior) con la fase móvil que consiste en 100% ACN y 0.1% de ácido fórmico en agua (40: 60 v/v) con un caudal de 1 mL/min. Se observó una correlación linear de los picos sobre un rango de concentración de 0,01 a 10 μg/mL en plasma humano para todos los metabolitos, ivacaftor, Iva-M1, M6 Iva y lumacaftor

Discusión

Como se informó anteriormente, nuestro grupo tiene por primera vez desarrollado y validado un método de HPLC y LC-MS para la detección y cuantificación de ivacaftor y sus principales metabolitos hidroximetil-IVA M1 (activo) y el IVA-carboxylate M6 (inactivos); y lumacaftor en el plasma y el esputo de pacientes de CF¹⁴. El análisis divulgado previamente por nuestro grupo fue utilizado con éxito para cuantificar la concentración de LUMA, IVA, IVA-M1 y M6 de IVA en el plasma y el esputo de pac...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
IVA (Cat#S114)	SelleckChem (USA).
LUMA (Cat#S1565)	SelleckChem (USA).
IVA-carboxylate (Cat# 510242247CS)	Clearsynth (Canada).
hydroxymethyl-IVA (Cat# 510240849CS)	Clearsynth (Canada).
Methanol (MeOH, LC-MS grade),	Sigma-Aldrich
acetonitrile (ACN, LC-MS grade)	Sigma-Aldrich
formic acid (FA)	Sigma-Aldrich
triple-quadrupole Shimadzu 8030 LC-MS
Phenomenex Kinetex (2.6 µm C8 100 Å; 50 × 2.1mm)
(KrudKatcher Ultrea HPLC In-Line Filter 0.5 m Depth Filter x 0.004inID).
1.5 mL polypropylene microcentrifuge tube (VWR).
Eppendorf Centrifuge 5430
13-mm syringe filter (0.45 µm nylon, GRACE, USA)
[Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 µL, PTFE/Silicone septa].