وصف الهجرة الخلية في إطار ثلاثي الأبعاد في المختبر الجرح البيئات

Summary

والهدف من هذا البروتوكول تقييم أثر العوامل برو ومكافحة ميجراتوري على الهجرة الخلية داخل مصفوفة فيبرينوجين ثلاثي الأبعاد.

Abstract

حاليا، معظم نماذج في المختبر لالتئام الجروح، مثل فحوصات الصفر الراسخة، تشمل دراسة إغلاق الخلية الهجرة والجرح على السطوح ثنائية الأبعاد. ومع ذلك، البيئة الفسيولوجية في الجرح الذي في فيفو الشفاء يأخذ مكان ثلاثي الأبعاد بدلاً من الأبعاد. أصبح من الواضح بشكل متزايد أن سلوك الخلية يختلف إلى حد كبير في الأبعاد مقابل بيئات ثلاثية الأبعاد؛ ولذلك، هناك حاجة للنماذج ذات الصلة أكثر فسيولوجيا في المختبر لدراسة سلوك الهجرة الخلية في إغلاق الجرح. الأسلوب الموصوفة هنا يسمح لدراسة الهجرة الخلية في نموذج ثلاثي الأبعاد التي تعكس بصورة أفضل الظروف الفسيولوجية من فحوصات الصفر ثنائي الأبعاد المحددة سابقا. والغرض من هذا النموذج تقييم ثمرة الخلية عن طريق فحص الهجرة الخلية بعيداً عن جسم كروي مضمنة داخل مصفوفة فيبرينوجين حضور عوامل برو أو مكافحة ميجراتوري. باستخدام هذا الأسلوب، ثمرة خلية من جسم كروي في مصفوفة ثلاثية الأبعاد يمكن ملاحظتها وهي قابلة للقياس بسهولة مع مرور الوقت عن طريق الفحص المجهري برايتفيلد وتحليل لمنطقة جسم كروي. يمكن أيضا تقييم تأثير العوامل الكثيرة الارتحال برو و/أو المثبطة على الهجرة الخلية في هذا النظام. يوفر هذا الأسلوب الباحثين مع طريقة بسيطة لتحليل الهجرة الخلية في الجرح ثلاثي الأبعاد المرتبطة المصفوفات في المختبر، مما يزيد من أهمية المختبر في الخلية دراسات مسبقة لاستخدام الحيوانات في فيفو نماذج.

Introduction

التئام الجروح هو عملية معقدة مما يؤدي إلى استعادة سلامة الأنسجة بعد الإصابة. يتم تقسيم هذه العملية إلى أربع مراحل متداخلة يشملها الأرقاء والتهاب والانتشار ويعيد البناء، التي يتم تنظيمها بكل بمزيج معقد من الرموز القابلة للذوبان والخلية-مصفوفة التفاعلات والاتصالات خلية. ^{1 , 2} تزامن هذه الرموز يتحكم العديد من الاستجابات الخلوية في التئام الجروح بما في ذلك، الأهم من ذلك، الهجرة الخلية. ^{3 , 4} الهجرة الخلية عملية ديناميكية للغاية تعتمد على تعمل الخلوية والخصائص البيوكيميائية والفيزيائية للوسط المصفوفة خارج الخلية. ⁵ الخلايا باستمرار التحقيق بيئتهم المصفوفة خارج الخلية من خلال مسارات إنتغرين بوساطة؛ تسمح هذه العملية الخلايا بمعنى مجموعة واسعة من خصائص المصفوفة بما في ذلك التضاريس والصلابة، والحبس. ثنائي الأبعاد (2D) تحليل الهجرة خلية يوضح أن الهجرة هو القوة الدافعة وراء تشكيل لاميليبوديا في طليعة من خلال توليد حزم خيوط الأكتين. اللاحقة تشكيل الالتصاقات المحورية في طليعة، في تركيبة مع أكتوميوسين مدفوعة انكماش وتراجع في الحافة، محركات أقراص الخلية إلى الأمام. ⁶ الهجرة الخلوية "ثلاثي الأبعاد" (3D) حاليا ليست مفهومة جيدا، إلا أن الدراسات الأخيرة تبين بأن الهجرة 3D اختلافاً مما ضوئها وصف الآلية في 2D، والمرجح أن تحركها آليات بديلة. على سبيل المثال، الدراسات الحديثة من بيتري وآخرون. أظهرت أن الخلايا في مصفوفات ثلاثية الأبعاد يمكنك التبديل اعتماداً على خصائص إدارة المحتوى في المؤسسة، بين لاميليبوديوم ولوبوبوديوم مدفوعة آليات الهجرة. ⁷ نظراً للهجرة الخلية عنصر حاسم للجرح شفاء استجابة، نماذج ثلاثية الأبعاد للهجرة الخلية ذات أهمية حاسمة لفهم الاستجابات الفسيولوجية للمنبهات المختلفة أثناء التئام الجروح. على الرغم من أن سلوك الخلية المهاجرة على الأسطح 2D ثبت أن تختلف اختلافاً كبيرا من الهجرة في مصفوفات ثلاثية الأبعاد، الأكثر حداثة في المختبر نماذج الهجرة الخلية خلال الجرح شفاء العملية، بما في ذلك الفحص الصفر الراسخة، الاستفادة من 2D أحادي الطبقة الثقافات. ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14} فحوصات أكثر وضعت مؤخرا استخدمت مصفوفة ثلاثية الأبعاد، ولكن لا تزال الثقافة الخلايا في أحادي الطبقة على رأس المصفوفة، مما يحد من القدرة على الخص حقاً ثريديمينسيوناليتي البيئة خلية المجراة في. ¹⁵

وغرض الأسلوب الموصوفة هنا دراسة الهجرة الخلية في نموذج ثلاثي الأبعاد ذات صلة الفيزيولوجية، وليس على سطح ثنائي الأبعاد، بغية التوصل إلى فهم أكثر قوة للردود الهجرة المرتبطة بالمنبهات التطبيقية. يسمح هذا الأسلوب للتقييم للهجرة الخلية داخل مصفوفة 3D فيبرينوجين جلطة حضور عوامل تنشيط أو تمنع المسارات المرتبطة بالهجرة الخلية. مصفوفة فيبرينوجين تم اختياره لهذا الأسلوب بسبب اللعب فيبرينوجين دوراً حاسما في المراحل المبكرة من التئام الجروح؛ الإصابات التالية، جلطة فيبرينوجين تتشكل داخل بيئات الجرح لوقف فقدان الدم ويعمل سقالة لتسلل خلية أولية أثناء إصلاح الأنسجة وإعادة عرض. ^{2 , 16 , 17 , 18 , 19 ,} بالإضافة إلى ذلك، ²⁰ فيبرينوجين يستخدم سريرياً كتسرب جراحية وتكوين السدود قد تم مرتبطة بالهجرة الخلية، وفي نهاية المطاف نتائج الشفاء. دراسة سابقة أجرتها كوكس وآخرون. التحقيق الهجرة تنتجها الخلايا الليفية بجلطات فيبرينوجين تتألف من فيبرينوجين متفاوتة وتركيزات ثرومبين غرض الاستفادة المثلى من تسرب فيبرينوجين. في هذه الدراسات، وكان كمياً هجرة الخلايا من جلطات فيبرينوجين على الأطباق البلاستيكية. ²⁰ هنا نقدم أسلوب يسمح للتحديد الكمي لهجرة خلايا داخل بيئة فيبرينوجين 3D. بينما يستخدم الأسلوب الموصوفة في هذا البروتوكول تحديداً فيبرينوجين، يمكن تعديل هذا النموذج بسهولة استخدام مواد بديلة المصفوفة كما هو مطلوب، مثل الكولاجين أو المصفوفات الأخرى 3D. بالإضافة إلى ذلك، نقدم استخدام تنتجها الخلايا الليفية الماغنيسيوم في هذا التحليل لأن الهجرة تنتجها الخلايا الليفية في السرير الجرح أمر بالغ الأهمية لتوليف المصفوفة خارج الخلية والأنسجة إصلاح/إعادة عرض. ومع ذلك، هي العَدلات العملية خلال الإصلاح نوع الخلية الأولى ترحيل إلى السرير الجرح، وتليها الضامة. ثم تبدأ الليفية للتسلل البيئة الجرح حوالي 48 ساعة بعد الإصابة الأولية، في بداية المرحلة التكاثري للجرح شفاء العملية. ¹⁹ هذا التحليل يمكن تعديلها بسهولة لتضمين العَدلات، الضامة، أو أنواع الخلايا الأخرى لتقييم كيف تؤثر التغييرات في هيكل فيبرينوجين جلطة الهجرة أنواع هذه الخلية. ²¹

لتنفيذ هذا التحليل، أولاً، تتشكل كروي تنتجها الخلايا الليفية استخدام تعديل التقنيات الموضحة سابقا لزراعة الخلايا الجذعية. ²² كروي تنتجها الخلايا الليفية بعد ذلك نقل إلى مصفوفة فيبرينوجين 3D، وثمرة يمكن ثم بسهولة رصدها وقياسها كمياً على مدى عدة أيام. يأخذ هذا البروتوكول في حساب 3D النظم الفسيولوجية عن طريق تضمين الماغنيسيوم خلية ثلاثية الأبعاد داخل مصفوفة فيبرينوجين، وبالتالي تجنب أوجه القصور في الأهمية الناجمة عن استخدام سطح نمو 2D مع أحادي الطبقة خلية للسلوك النموذجي المهاجرة، في حين لا يزال يسمح لتقييم سلوك الخلية في بيئة عالية التي تسيطر عليها في المختبر .

Protocol

1-يوم 1: الخلية وإعداد كاشف

ملاحظة: ينبغي أن يقوم جميع إعداد الخلية وكاشف في سلامة بيولوجية مجلس الوزراء لمنع تلوث العينات.

1. بتصفية الحار دولبيكو ' s النسر التعديل ' s المتوسطة (دميم)، المصل البقري الجنين (FBS)، ل الجلوتامين، والبنسلين/ستربتوميسين في حمام مائي 37 درجة مئوية.
2. إعداد المواليد البشرية عن طريق الجلد تنتجها الخلايا الليفية (هدفن) وسائط الإعلام باستكمال استعد دميم مع 10% FBS والبنسلين/ستربتوميسين 1% 1% لتر-الجلوتامين.
3. ذوبان قنينة مجمدة هدفنس والطرد المركزي لمدة 8 دقائق في 200 x ز لإزالة المتوسطة للواسمات. ريسوسبيند الخلايا في استعداد هدفن الوسائط في كثافة 1 × 10 ⁶ خلايا/مل والبذور في قارورة ثقافة T-75.
4. قارورة مكان في حاضنة (37 درجة مئوية، 5% CO ₂) للسماح بانتشار الخلايا.
5. "هدفن تخزين" الوسائط في 4 ° C.
6. إعداد الكواشف للمحترفين ومكافحة migratory حسب الحاجة.

2. يوم 3: إعداد كروي

1. القيام بما يلي في غطاء ثقافة لمنع تلوث العينات.
2. عندما تصل الخلايا إلى 80% كونفلوينسي، نضح وسائط الإعلام، وإضافة 5 مل من 0.25% يدتا التربسين. قارورة مخزن في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لفصل الخلايا من سطح قارورة كاملة-
3. إضافة 5 مل من وسائل الإعلام المعالجون بقارورة لتحييد التربسين.
4. في أنبوب ميكروسينتريفوجي، خلط 10 ميكروليتر تريبان الأزرق و 10 ميكروليتر من تعليق خلية.
5. أجهزة الطرد المركزي من تعليق خلية الأصلي لمدة 8 دقائق في 200 غ. س
6. بينما هو يجري فصل تعليق خلية، إضافة 10 ميكروليتر من تعليق خلية تريبان الأزرق إلى هيموسيتوميتير وإجراء حساب خلية.
7. عقب الطرد المركزي، نضح وسائل الإعلام دون إزاحة بيليه الخلية. ريسوسبيند بيليه الخلية بتركيز 1.25 × 10 ⁵ خلايا/مل.
8. إضافة 5 مل من الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) إلى الجزء السفلي من 10 سم طبق بيتري الحفاظ على بيئة المائية خلال النمو كروي.
9. عكس غطاء طبق بيتري. إضافة عدة قطرات ميكروليتر 20 من تعليق خلية على السطح الداخلي للغطاء طبق بيتري.
10. بسرعة عكس الغطاء مرة أخرى ووضعه مرة أخرى على الجزء السفلي من الطبق، مع الحرص على عدم إزاحة قطرات معلقة. ويبين الشكل 1 معلقة بنجاح تشكيل قطرات.
11. بعناية وضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية وتسمح الماغنيسيوم تنمو في شنقاً إسقاط ثقافة لمدة 72 h.

3. يوم 6: تضمين الماغنيسيوم في مصفوفة 3D

1. القيام بما يلي في غطاء ثقافة لمنع تلوث العينات.
2. لتشكيل أول طبقة فيبرينوجين، إنشاء حل جلطة من حجم كاف لإضافة 100 ميكروليتر الحل تجلط الواحد جيدا للعديد من الآبار كالمطلوبة (كروي 1 كل بئر). وتتألف من 10% 10 X HEPES المخزن المؤقت جلطات بحجم (250 ملم حبيس، 1500 ملم كلوريد الصوديوم، كاكل 50 مم ₂، الرقم الهيدروجيني 7.4) والفيبرينوجين البشرية 2 مغ/مل U/mL 0.1 البشرية ثرومبين ألفا. ما تبقى حجم جلطة تتكون من الماء عالي النقاوة.
   1. ثرومبين إضافة آخر وبسرعة إضافة الحل إلى الآبار المرغوبة في لوحة 48-جيدا من أجل منع الجلطات مبلمرة قبل إضافتها إلى الآبار.
3. بلطف يهز/والاستفادة من لوحة جيدا لضمان أن فيبرينوجين جلطة الخليط هو دهان الكامل جيدا، ثم ضع لوحة جيدا في الحاضنة ح 1 للسماح للطبقة السفلي تجلط بلمرة. لا تهز لوحة جيدا ما يكفي من الثابت للحث على تشكيل فقاعة؛ لوحة الصخور ببساطة حسب الضرورة حتى يتم المغلفة بأكملها شكل جيد. إذا استخدمت وحدات تخزين أكبر من جلطة، قد لا تكون هذه الخطوة ضرورية.
4. نقل الماغنيسيوم إلى طبقة فيبرينوجين- لوحة
   1. إزالة جيدا وطبق بتري يحتوي على الماغنيسيوم في الشنق إسقاط ثقافة من الحاضنة ودراسة الماغنيسيوم تحت مجهر. ثم ضع الطبق إلى هود الثقافة-
   2. بعناية عكس غطاء صحن بيتري للسماح بالوصول إلى الشنق إسقاط الثقافات.
   3. بعناية باستخدام إبرة ز 21 المرفقة بحقنه 1 مل، نقل قطره واحدة من غطاء مقلوب داخل المركز من كل جيدا، مع الحرص على عدم ثقب طبقة فيبرينوجين مبلمرة طلاء أسفل البئر. فعالية نقل القطرة، سحب ببطء الانخفاض في الإبرة. وقف سحب المكبس مرة أخرى في أقرب وقت إسقاط كامل داخل الإبرة؛ سحب القطرة بعيداً جداً قد يعرض فقاعات الهواء، والتي يمكن أن تعطل نقل كروي فعالة أو تصوير اللاحقة-
   4. دراسة لوحة جيدا تحت مجهر للتأكد من أن الماغنيسيوم قد تحول بشكل صحيح في آبار كل المطلوب.
5. لتشكيل الطبقة الثانية فيبرينوجين، إنشاء حل جلطة آخر باستخدام إعداد نفس النحو الوارد أعلاه لإنشاء طبقة فيبرينوجين الأولى (الخطوة 3، 2). "الماصة؛" 100 ميكروليتر إلى كل قطره المحتوية على كروي بعناية ودراسة تحت مجهر مرة أخرى للتأكد من أن الماغنيسيوم لا تزال على حالها، ولا تم دفعها على حواف الآبار-
6. إرجاع لوحة جيدا للحاضنة والسماح للطبقة الثانية بلمرة حاء – 1

4. يوم 6: إضافة برو المهاجرة أو العوامل المثبطة

1. وسائل الإعلام "هدفن الحارة" إلى 37 درجة مئوية.
2. الخطوات التالية في غطاء لمنع التلوث.
3. إعداد الوسائط لكل مجموعة بما في ذلك تركيزات ملائمة لوكلاء برو-migratory المضادة تقييم-
4. إزالة لوحة جيدا من الحاضنة ومكان في غطاء ثقافة-
5. ميكروليتر 500 إضافة وسائط القياسية لكل بئر من السيطرة على المجموعة كروي و 500 ميكروليتر من وسائل الإعلام المثبطة لكل بئر فريق كروي تثبيط الهجرة 500 ميكروليتر من وسائل الإعلام الموالية المهاجرة لكل بئر فريق كروي تعزيز الهجرة-
6. إرجاع لوحة جيدا للحاضنة.
7. تغير وسائل الإعلام كل حاء 48

5. 6-9 أيام: التقييم للهجرة الخلية وانتشار

الماغنيسيوم

1. الصورة باستخدام الفحص المجهري برايتفيلد فورا بعد إضافة الوسائط (ح 0) وبعد ذلك كل 24 ساعة ل h. 72 اختياري: عند كل نقطة من الزمن، تأخذ صورة z-كومة من أجل تحديد ما إذا كان يتم حدوث الهجرة في الطائرات خارج مجال التركيز الرئيسي. في تجربتنا لا يحدث هذا؛ ومع ذلك، أنها مفيدة لضمان هذا هو الحال في كل تجربة.
2. "استخدام إيماجيج" لتحديد الخلية ثمرة في كل بئر من خلال تحليل الزيادة المئوية في المجال لكل كروي بتتبع الحدود خلية لكل كروي عند كل نقطة الزمنية المتعاقبة واستخدام " التدبير " الدالة للحصول على المجال.

النتائج

ثقافة كروي يمكن أن تستخدم لتقييم أثر العوامل المؤيدة والمناهضة الهجرة على الهجرة تنتجها الخلايا الليفية في المختبر بنجاح
يمكن أن تتكون الماغنيسيوم 3D تنتجها الخلايا الليفية عبر الشنق ثقافة الإفلات على مدى فترة 72 ساعة (الشكل 1). وعقب فترة الثقاف?...

Discussion

يسمح هذا البروتوكول لدراسة الهجرة الخلية في التئام المرتبطة ECMs من خلال في المختبر نموذج الثلاثي الأبعاد. خطوة حاسمة في التنفيذ السليم لهذا الإجراء هو التنمية السليمة الماغنيسيوم تنتجها الخلايا الليفية؛ تركيز خلية أثناء إعداد الأمثل لتعطي بتركيز أولية من الخلايا 2,500 والإفلات، مما ي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine	VWR	VWRL0148-0500	DMEM already containing L-glutamine can also be used
100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic	VWR	10861-594	Dishes of any size can be used for hanging drop culture
Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested	Sigma-Aldrich	12306C-500ML
L-glutamine	Fisher Scientific	ICN1680149	Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine
Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Human Dermal Fibroblasts, neonatal	Thermo Fisher	C0045C	Can be replaced with other cell type of interest
21 G x 1 1/2' needle	BD	305167	22 G x 1 1/2 needles will also work
1 mL syringe	VWR	89174-491	Syringes of any volume can be used
Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells)	VWR	82051-004
Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted	Enzyme Research Laboratories	FIB 3	Can be replaced with matrix protein of interest
Human Alpha Thrombin	Enzyme Research Laboratories	HT 1002a	May not be necessary depending on matrix protein of interest
Equipment
BSL2 cell culture hood
Cell culture incubator
Inverted microscope with 10X objective
Centrifuge compatibile with 15 mL tubes