אפיון נדידת תאים בתוך תלת מימדי במבחנה פצע סביבות

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא להעריך את ההשפעה של גורמים פרו - ו אנטי - migratory על נדידת תאים בתוך מטריצה תלת מימדי פיברין.

Abstract

כיום, רוב במבחנה מודלים של פצע ריפוי, כגון מבחני מאפס ומבוססת, לערב לומד תא העברה וגמר הסגר על משטחים דו-ממדית. עם זאת, הסביבה פיזיולוגיות אשר ויוו ריפוי הפצע מתקיים הוא תלת מימדי ולא דו מימדי. כעת ברור יותר ויותר בהתנהגות התא משתנה במידה רבה בין מימדי לעומת סביבות תלת-מימדי; לכן, אין צורך יותר מבחינה פיזיולוגית הרלוונטיים במבחנה מודלים עבור לומד התנהגויות ההעברה תא לסגירת הפצע. השיטה המתוארת במסמך זה מאפשר לחקר נדידת תאים במודל תלת-ממדי שמשקף טוב יותר בתנאים פיזיולוגיים מאשר שנקבעו קודם מימדי מבחני מאפס. מטרת מודל זה היא להעריך תא תוצר באמצעות הבחינה של נדידת תאים מהגוף ספרואיד מוטבע בתוך מטריצה פיברין בנוכחות גורמים פרו - או אנטי - migratory. באמצעות שיטה זו, תוצר תא מהגוף ספרואיד במטריצה תלת מימדי יכול להיות שנצפו והוא לכימות בקלות לאורך זמן באמצעות מיקרוסקופ brightfield וניתוח של ספרואיד הגוף באזור. גם ניתן להעריך את ההשפעה של גורמים פרו-נודדים ו/או מעכבות על נדידת תאים במערכת זו. שיטה זו מספקת חוקרים שיטה פשוטה של ניתוח נדידת תאים הפצע תלת ממדי משויכות מטריצות במבחנה, ובכך מגדילים את הרלוונטיות של חוץ גופית בתוך התא מחקרים לפני השימוש ב- vivo חיה מודלים.

Introduction

ריפוי הפצע הוא תהליך מורכב אשר התוצאות השיקום של רקמות תקינות בעקבות פגיעה. תהליך זה מחולק לארבעה שלבים חופפים הקיף על ידי hemostasis, דלקת, התפשטות, שיפוץ, שמווסתים אחד על ידי שילוב מורכב של רמזים מסיסים, תא-מטריקס אינטראקציות ותקשורת תא-תא. ^{1 , 2} העיבוד התזמורתי של רמזים אלה שולט שפע של תגובות הסלולר ב ריפוי הפצע כולל, חשוב, נדידת תאים. ^{3 , 4} נדידת תאים הוא תהליך דינמי מאוד תלויה פנוטיפים הסלולר והן את המאפיינים הביוכימי ו ביופיזיקלי של הסביבה שבה התרחשה מטריצה חוץ-תאית. ⁵ תאים ללא הרף לחקור את סביבתם מטריצה חוץ-תאית בתיווך אינטגרין מסלולים; תהליך זה מאפשר תאים לחוש מגוון רחב של נכסים מטריקס כולל הטופוגרפיה, קשיחות של כליאה. ניתוח דו מימדי (2D) של נדידת תאים מדגים כי ההעברה הוא מונע על ידי היווצרות lamellipodia בחוד דרך הדור של אקטין פילמנט חבילות. לאחר מכן היווצרות הידבקויות מוקד בחוד, בשילוב עם actomyosin מונע הכחשה להתכווצות בקצה נגרר, כונני התא קדימה. ⁶ ההעברה סלולרית תלת מימדי (3D) כיום אינה מובנת היטב, אולם מחקרים אחרונים מדגימים כי ההעברה 3D הוא שונה במידה ניכרת מאשר שצויינו תיאר מנגנון בדו מימד, והוא ככל הנראה מונע על ידי מנגנונים alterative. לדוגמה, מחקרים שנעשו לאחרונה על ידי פיטרי ואח. הפגינו, בהתאם, את המאפיינים של ה-ECM תאים ב- 3D מטריצות באפשרותך לעבור בין lamellipodium לבין lobopodium מונע מנגנונים של הגירה. ⁷ כיוון נדידת תאים הוא מרכיב קריטי של הפצע ריפוי התגובה, דגמי תלת-ממד של נדידת תאים הם קריטיים להבנת תגובות פיזיולוגיות לגירויים שונים במהלך ריפוי הפצע. למרות בהתנהגות התא נודדים על משטחים 2D הוכח שפתרון של ההעברה ב- 3D מטריצות, ביותר במבחנה המודלים הנוכחיים של נדידת תאים במהלך תהליך, כולל assay מאפס, ומבוססת על ריפוי הפצע לנצל 2D טפט תרבויות. ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14} יותר לאחרונה פיתח מבחני נעזרו מטריצה תלת-ממד, אך עדיין התרבות תאים חד שכבתי על גבי המטריצה, ובכך יגביל את היכולת באמת לסכם את אתמהא של הסביבה תא ויוו. ¹⁵

מטרת השיטה המתוארת כאן היא ללמוד נדידת תאים דגם תלת-ממד רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, ולא על משטח דו-מימדית, על מנת להשיג הבנה עמידים יותר של תגובות ההעברה המשויך הגירויים יישומית. שיטה זו מאפשרת על ההערכה של נדידת תאים בתוך מטריצה קריש פיברין 3D בנוכחות גורמים להפעיל או לעכב מסלולים הקשורים עם נדידת תאים. מטריצה פיברין נבחרה עבור שיטה זו עקב הפעלת פיברין תפקיד קריטי בשלבים המוקדמים של ריפוי הפצע; פגיעה הבאים, קריש פיברין נוצר בתוך הפצע סביבות לבלום את אובדן הדם ומשמש לפיגום חדירה לתא ההתחלתי במהלך שיפוץ ותיקון רקמות. ^{2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} . בנוסף, פיברין משמש קלינית כמו איטום כירורגי, ההרכב של אוטמים היתה קשורה נדידת תאים ו- ultimate ריפוי תוצאות. מחקר קודמות מאת קוקס ואח. חקר פיברובלסט הגירה עם קרישי פיברין מורכבת פיברין משתנות ובתמצית תרומבין לצורך מיטוב של פיברין. במחקרים אלה, נדידה של תאים מחוץ קרישי פיברין על גבי כלים פלסטיק הייתה לכמת. ²⁰ . אנו מציגים שיטה המאפשרת על כימות של נדידה של תאים בתוך הסביבה פיברין תלת-ממד. בעוד השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה באופן ספציפי משתמשת פיברין, מודל זה יכול בקלות להיות שונה להשתמש בחומרים אלטרנטיביים מטריקס כרצונכם, כגון קולגן או אחרים מטריצות תלת-ממד. בנוסף, אנו מציגים את השימוש פיברובלסט spheroids assay הזה כי ההעברה פיברובלסט. לתוך המיטה הפצע היא בעלת חשיבות עליונה סינתזה מטריצה חוץ-תאית, רקמות תיקון/שיפוץ. עם זאת, במהלך התיקון תהליך נויטרופילים הם סוג התא הראשון להעביר לתוך המיטה הפצע, ואחריו מקרופאגים. Fibroblasts אז מתחיל לחדור את הסביבה הפצע כ- 48 שעות לאחר הפגיעה, בתחילת השלב המקדימות תהליך ריפוי הפצע. ¹⁹ assay הזה יכול בקלות לשנות כדי לכלול נויטרופילים, מקרופאגים או סוגי תאים אחרים כדי להעריך כיצד שינויים במבנה קריש פיברין משפיעים על ההעברה אחד מסוגי התאים. ²¹

כדי ליישם את assay, ראשית, ספרואיד פיברובלסט נוצר באמצעות שינוי של טכניקות שתואר קודם לכן לתרבות תאי גזע. ²² ספרואיד פיברובלסט לאחר מכן מועבר לתוך מטריצה פיברין 3D ואז תוצר יכול להיות בקלות תחת פיקוח לכמת על פני מספר ימים. פרוטוקול זה לוקח בחשבון את מימד של מערכות פיזיולוגיות על-ידי הטבעת תא 3D spheroids בתוך מטריצה פיברין, וכך להימנע המגבלות ב רלוונטיות הביא על ידי באמצעות משטח צמיחה דו-מימדית טפט תא מודל להתנהגות הנדידה, בזמן מתן אפשרות להערכת בהתנהגות התא בסביבה מבוקרת מאוד במבחנה .

Protocol

1-יום 1: תא והכנות ריאגנט

הערה: הכנה התא ואת ריאגנט יש לבצעו בבטיחות הביולוגי הקבינט למניעת זיהום של דגימות.

1. חמים מסונן Dulbecco ' s נשר שונה ' s בינוני (DMEM), סרום שור עוברית (FBS),-גלוטמין ו פניצילין/סטרפטומיצין באמבט מים 37 ° C.
2. הכן מדיה neonatal פיברובלסט עורי אנושי (HDFn) על ידי שכשהם חימם DMEM עם 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 1%-גלוטמין.
3. להפשיר בקבוקון של מוקפאים HDFns ולא צנטריפוגה במשך 8 דקות ב- 200 גרם x כדי להסיר הקפאה קריוגנית בינוני. Resuspend תאים בתקשורת HDFn מוכן-צפיפות של עונה 1 פרק 10 ⁶ תאים למ"ל ו זרע לתוך בקבוקון התרבות T-75.
4. המקום את הבקבוק בתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂) כדי לאפשר התפשטות תא.
5. HDFn חנות המדיה ב- 4 מעלות צלזיוס
6. להכין ריאגנטים pro - ו אנטי - migratory לפי הצורך.

2. יום 3: ספרואיד הכנה

1. לבצע את הפעולות הבאות בברדס תרבות למניעת זיהום של דגימות.
2. כאשר תאים להגיע 80% confluency, תשאף מדיה ולהוסיף 5 מ של 0.25% טריפסין-EDTA. חנות את הבקבוק בתוך חממה 37 ° C עבור 5 דקות להתנתק באופן מלא תאים מפני השטח את הבקבוק.
3. הוסף 5 מ של מדיה ומחוממת הבקבוק כדי לנטרל את טריפסין.
4. בשפופרת microcentrifuge, לערבב μL 10 של Trypan Blue μL 10 של התליה תא.
5. צנטריפוגה ההשעיה תא המקורית במשך 8 דקות ב- 200 g. x
6. בעוד הוא להיות centrifuged התליה תא, להוסיף 10 μL של התליה תא Trypan Blue hemocytometer ולבצע ספירת תא.
7. בעקבות צנטריפוגה, תשאף מדיה ללא הם מוציאים בגדר התא. Resuspend בגדר תא-ריכוז של 1.25 x 10 ⁵ תאים למ"ל.
8. הוסף 5 מ ל תמיסת סטרילית פוספט buffered (PBS) לתחתית של 10 ס מ פטרי כדי לשמור על סביבה רטוב במהלך צמיחה ספרואיד.
9. היפוך את מכסה צלחת פטרי. הוסף מספר טיפות μL 20 של התליה תא אל השטח הפנימי של מכסה פטרי.
10. במהירות להפוך שוב את המכסה ומניחים אותו בתחתית של המנה, נזהר לא לנתק את הטיפות לתלייה. איור 1 מדגימה תלוי בהצלחה בנוי טיפות.
11. בקפידה למקם את המנה חממה 37 ° C ולאפשר spheroids לגדול תלייה טיפה תרבות לתקופה של ה 72

3. יום 6: הטבעה Spheroids לתוך מטריצה תלת-ממד

1. לבצע את הפעולות הבאות בברדס תרבות למניעת זיהום של דגימות.
2. על היווצרות שכבת פיברין הראשון, ליצור פתרון קריש הדם של נפח מספיק כדי להוסיף 100 μL של קריש דם פתרון לכל טוב של בארות רבות ככל הנדרש (1 ספרואיד לאדם טוב). קרישי דם מורכבות של 10% 10 X HEPES מאגר נפח (250 מ מ HEPES, 1500 מ"מ. NaCl, CaCl 50 מ מ ₂, pH 7.4), פיברינוגן האנושי 2 מ"ג/מ"ל ו 0.1 U/mL תרומבין אלפא אנושי. השארית של אמצעי האחסון קריש הדם מורכבת מים אלקטרופורזה.
   1. תרומבין הוספה אחרונה ובמהירות להוסיף פתרון וולס הרצוי לתוך צלחת 48-טוב כדי למנוע קרישי דם polymerizing לפני להתווסף וולס.
3. בעדינות לנער/ברז צלחת טוב על מנת להבטיח כי תערובת קריש פיברין ציפוי כולו טוב, ולאחר מכן מקם טוב צלחת בחממה עבור h 1 כדי לאפשר התחתון קריש לשכבה פולימריזציה. אל תלחץ חזק מספיק לגרום היווצרות בועה; טוב צלחת פשוט רוק צלחת לפי הצורך עד מצופה מכלול של הבאר. אם נעשה שימוש אחסון קריש דם גדולים יותר, צעד זה לא יהיה נחוץ.
4. העברת spheroids על שכבת פיברין.
   1. הסר הבאר צלחת הפטרי המכיל spheroids ב התליה ירידה תרבות מן החממה, לבחון spheroids תחת מיקרוסקופ. ואז למקם את המנה וחטף תרבות.
   2. להפוך בזהירות את מכסה הפטרי כדי לאפשר גישה כדי התליה שחרר תרבויות.
   3. בזהירות באמצעות מחט 21 G המצורפת מזרק 1 מ"ל, להעביר טיפה אחת מן המכסה הפוך לתוך המרכז של כל טוב, מקפיד לא לנקב את שכבת פיברין polymerized ציפוי בתחתית הבאר. להעביר ביעילות את המסירה, לאט לאט למשוך את הירידה לתוך המחט. תפסיק למשוך את הבוכנה בחזרה ברגע הירידה כולו נמצא בתוך המחט; מושך את הירידה בחזרה לכת עשוי להציג בועות אוויר, אשר יכול לשבש העברה ספרואיד יעיל או על יצירת תמונות עוקבות.
   4. לבחון את הצלחת היטב תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח כי spheroids העבירו כראוי לתוך וולס הרצוי כל.
5. להיווצרות שכבת פיברין השני, ליצור פתרון קריש דם אחר באמצעות הכנת אותו לעיל עבור יצירה של השכבה הראשונה פיברין (שלב 3.2). פיפטה 100 μL על גבי כל טיפה המכילות ספרואיד ובזהירות לבדוק תחת מיקרוסקופ שוב כדי לוודא spheroids עדיין לא נדחקו על הקצוות של הבארות.
6. להחזיר את הצלחת היטב את החממה, לאפשר לשכבה השנייה פולימריזציה עבור ה 1

4. יום 6: תוספת של Pro-נודדים או גורמים מעכבים

1. HDFn חמים למדיה-37 מעלות צלזיוס.
2. לבצע את הפעולות הבאות בברדס למניעת זיהום.
3. להכין מדיה עבור כל קבוצה כולל המתאים ריכוזי pro/אנטי-migratory סוכנים להערכה.
4. הסר את לוחית טוב של חממה ומקום בשכונה תרבות.
5. ΜL להוסיף 500 של מדיה סטנדרטי בכל טוב של קבוצת הביקורת ספרואיד μL 500 של מדיה מעכבות כל טוב של הקבוצה ספרואיד עכבות ההעברה, μL 500 של מדיה פרו-נודדת כל טוב של הקבוצה ספרואיד משופרת ההעברה.
6. להחזיר את הצלחת היטב החממה.
7. שינוי מדיה בכל ה 48

5. ימים 6-9: הערכה של נדידת תאים והתפשטות

spheroids

1. התמונה באמצעות מיקרוסקופ brightfield מיד לאחר תוספת של תקשורת (0 h), ואז כל 24 שעות עבור ה 72 אופציונלי: בכל נקודה בזמן, לקחת תמונה z-מחסנית כדי לקבוע אם ההעברה מתרחש במישורים מחוץ לאזור הראשי של המוקד. מניסיוננו זה אינו מתרחש; עם זאת, זה שימושי להבטיח זה המקרה בבכל ניסוי.
2. שימוש ImageJ כדי לקבוע תא תוצר כל היטב על-ידי ניתוח הגדלת אחוז באזור עבור כל ספרואיד על ידי מעקב גבול התא עבור כל ספרואיד בכל נקודה בזמן רצופים באמצעות " מידה " פונקציה כדי להשיג את האזור.

תוצאות

ספרואיד תרבות יכול להיות מנוצל כדי להעריך את ההשפעה של סוכנים pro אנטי הנדידה על ההעברה פיברובלסט במבחנה בהצלחה
Spheroids פיברובלסט 3D יכול להיווצר באמצעות תלוי תרבות טיפה על פני תקופה של 72 h (איור 1). בעקבות תקופת תרבות, spheroids מוטמעים בתוך המטריצה קריש ...

Discussion

פרוטוקול זה מאפשר הבחינה של נדידת תאים בריפוי הפצע הקשורים ECMs באמצעות מודל במבחנה תלת-ממד. צעד מכריע בביצוע תקין של ההליך הוא התפתחות נאותה של פיברובלסט spheroids; תא ריכוז במהלך ההכנה היה אופטימיזציה לתת של ריכוז הראשונית של תאים 2,500/שחרור, ומאפשר spheroids לטופס באופן אמין על תקופת דגירה של 72...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine	VWR	VWRL0148-0500	DMEM already containing L-glutamine can also be used
100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic	VWR	10861-594	Dishes of any size can be used for hanging drop culture
Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested	Sigma-Aldrich	12306C-500ML
L-glutamine	Fisher Scientific	ICN1680149	Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine
Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Human Dermal Fibroblasts, neonatal	Thermo Fisher	C0045C	Can be replaced with other cell type of interest
21 G x 1 1/2' needle	BD	305167	22 G x 1 1/2 needles will also work
1 mL syringe	VWR	89174-491	Syringes of any volume can be used
Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells)	VWR	82051-004
Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted	Enzyme Research Laboratories	FIB 3	Can be replaced with matrix protein of interest
Human Alpha Thrombin	Enzyme Research Laboratories	HT 1002a	May not be necessary depending on matrix protein of interest
Equipment
BSL2 cell culture hood
Cell culture incubator
Inverted microscope with 10X objective
Centrifuge compatibile with 15 mL tubes