三次元培養細胞遊走を特徴付ける傷の環境

要約

このプロトコルの目的は、三次元フィブリン マトリックス内の細胞の移動に及ぼすプロおよび反 migratory 因子を評価するためです。

要約

現在のほとんどの生体外モデルは傷の治癒、老舗スクラッチ アッセイなど、2次元の表面上のセルの移行および創傷閉鎖の勉強を含みます。しかし、どの生体内で創傷治癒が行われる生理学的な環境は二次元ではなく三次元です。セルの動作が大幅に異なることはますます明確になっている二次元三次元環境対したがって、傷の閉鎖の細胞移行挙動を勉強してもっと生理学的関連性の in vitroモデルの必要性があります。記載方法より以前に確立された二次元スクラッチ アッセイより生理学的条件を反映した三次元モデルの細胞移動の調査のためことができます。このモデルの目的は、プロまたは反 migratory 因子存在下でフィブリンのマトリックスに埋め込まれた回転楕円体ボディから細胞遊走の検討を通して細胞伸長を評価することです。このメソッドを使用して、三次元マトリックスの回転楕円体ボディから細胞伸長を観察し、明視野顕微鏡および回転楕円体の本体領域の解析による時間の経過とともに容易に定量化できないです。セル移動に及ぼすプロ渡り鳥あるいは阻害要因は、このシステムでは評価できます。このメソッドは、関連付けられている三次元傷行列の in vitro細胞移動分析の単純なメソッドを持つ研究者を提供します、このように体外の関連性を高める細胞研究生体内で動物を使用する前にモデル。

概要

創傷治癒、組織の整合性の損傷の修復に起因する複雑なプロセスです。このプロセス ステージに分割されます 4 重複止血、炎症、増殖、改造に包まれたそれぞれ規制されている水溶性キューと、細胞マトリックスの相互作用、細胞間コミュニケーションの複雑な組み合わせで。^1,2これらの手がかりのオーケストレーションは、創傷治癒など、重要なは、細胞の移動における細胞応答の多数を制御します。^3,4細胞の遊走、細胞表現型と細胞外マトリックスの環境の生化学的および生物物理学的特性に依存して非常にダイナミックなプロセスです。⁵セル連続プローブ-インテグリンを介する経路; を介して細胞外マトリックス環境このプロセスでは、地形、剛性、閉じ込めなどマトリックス プロパティの広い範囲を感知する細胞をことができます。細胞遊走の二次元 (2 D) 解析は、移行がアクチン フィラメント バンドルの世代を通じてリーディング エッジでケラトサイト形成によって駆動されることを示します。前縁、後縁の収縮と収縮を駆動アクトミオシンとの組み合わせで焦点接着斑の形成は、セルを突き動かします。⁶三次元 (3 D) 細胞の移行は現在よくわかっていない, しかし、最近の研究は示す 3 D 移行は著しく異なること、船首に 2 D のメカニズムを説明し、変化をもたらすメカニズムによって駆動される可能性が高い。たとえば、ピートリーらによる最近の研究。ECM のプロパティ、に応じて 3 D マトリックス内のセルと切り替えることが lamellipodium 移行のメカニズムを駆動 lobopodium を示した。⁷細胞の遊走は創傷治癒応答の重要な要素は、細胞遊走の 3 D モデルは創傷治癒過程における様々 な刺激に対する生理反応を理解すること重要です。3 D マトリックスの移行とは大きく異なる 2D サーフェス上セル回遊行動を示されている、創傷治癒過程、老舗のスクラッチ アッセイを含む中細胞遊走の最新の in vitroモデル利用 2 D単層培養。^{5,6,7,8,9,10,11,12,13,14}より最近開発されたアッセイ 3 D マトリックスを利用してきたが、まだこうして本当に細胞環境の立体感を再現する能力を制限、マトリックス上に単層細胞の培養体内。¹⁵

記載方法の目的は、応用刺激に関連付けられている移行反応のより堅牢な理解を得るために細胞遊走 2D サーフェスではなく生理学的関連性の高い 3 D モデルを勉強することです。このメソッドは、アクティブ化または細胞の移動に関連付けられている経路を阻害する要因の存在下で 3 D フィブリン血栓マトリックス内の細胞の移動の評価できます。創傷治癒の初期段階で重要な役割フィブリンによるこのメソッドの選ばれたフィブリン マトリックス次の傷害、フィブリン血栓が血液の損失を食い止めるため創傷環境で形成される組織の修復と改造の間に初期の細胞浸潤の足場として提供しています。^{2,16,17,18,19,20}はまた、フィブリンが外科シーラントとして臨床的に使用され、シーラントの組成は細胞遊走と究極の成果を癒しに縛られています。コックスらによる前の調査。さまざまなフィブリンと、フィブリンの最適化を目的としてトロンビン濃度フィブリン血栓を線維芽細胞の移行を検討しました。これらの研究では、プラスチック製の食器にフィブリン血栓から細胞の移動の定量化を行った。²⁰ここで 3 D フィブリン環境内で細胞の移動の定量化できる方法を紹介します。具体的にはこのプロトコルで記述されているメソッドは、フィブリンを使用して、このモデルはコラーゲンや他の 3 D の行列など、必要に応じて代替マトリックス材料を使用する簡単に変更できます。さらに、このアッセイで線維芽細胞スフェロイドの使用は, 傷ベッドに線維芽細胞の移行が最も重要な細胞外マトリックスの合成と組織修復/改造するので.ただし、修理中にプロセスの好中球はマクロファージが続く傷のベッドに移行する最初のセルの種類です。線維芽細胞は、約 48 時間後に外傷、創傷治癒過程の増殖期の初めに傷環境に侵入を開始します。¹⁹のこのアッセイは、好中球、マクロファージ、フィブリン血栓構造の変化によるこれらの細胞型の移行の影響を査定する他の細胞型などに簡単に修正できます。²¹

このアッセイを実装するには、最初に、線維芽細胞スフェロイド形成幹細胞培養のために紹介した方法の変更を使用しています。²²は線維芽細胞スフェロイド、3 D フィブリン マトリックスに転送後、伸長する簡単に監視し、数日間定量化します。このプロトコルは、フィブリン マトリックス内 3 D 細胞スフェロイドを埋め込むことによって考慮に生理学的システムの 3 D は中にもたらされるモデル回遊行動に細胞膜の 2次元成長表面を使用して、関連性の制限を避けるため、まだ厳しく体外環境における細胞挙動の評価が可能。

プロトコル

1 です一日 1: セルと試薬調製

注: 生物学的安全キャビネットのサンプルの汚染を防ぐためにすべてのセルと試薬の準備を行わなければならない。

。

1. 暖かいフィルター ダルベッコ ' s 修正イーグル ' s 媒体 (DMEM)、ウシ胎児血清 (FBS)、L-グルタミン、37 ° C の水浴のペニシリン/ストレプトマイシン
。
2. 10 %fbs、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、1% と DMEM を温めて準備新生児ひと真皮線維芽細胞 (HDFn) メディアを補うことで L-グルタミン
。
3. は、凍結保存培地を取り除き冷凍の HDFns と 200 x g で 8 分間、遠心分離のバイアルを解凍します。T-75 培養用フラスコに 1 x 10 ⁶ セル/mL と種子の密度で準備された HDFn メディアで細胞を再懸濁します
。
4. (37 ° C、5% CO ₂) 細胞増殖を許可するインキュベーターで場所フラスコ
。
5. ストア HDFn のメディアで 4 ° C
6. 必要に応じてプロおよび反 migratory 試薬を準備します
。

2。3 日目: 回転楕円体準備

1. サンプルの汚染を防ぐために文化フードで以下を実行します
。
2. 電池が 80% の confluency に達するときメディアを吸引し、0.25 %5 mL を加えてトリプシン-EDTA。ストア フラスコ フラスコ表面から細胞を完全にデタッチするのには 5 分の 37 ° C のインキュベーターで
。
3. 、トリプシンを中和するためにフラスコに暖められたメディアの 5 mL を追加します
。
4. 遠心チューブ ミックス トリパン ブルーの 10 μ L と細胞懸濁液の 10 μ L.
5. 200 x g に 8 分の元の細胞懸濁液を遠心分離
6. 細胞懸濁液を遠心分離されているが、一方、検定にトリパン ブルー細胞懸濁液の 10 μ L を追加し、セル数を数えるためです
。
7. 以下の遠心分離、細胞ペレットをずらすことがなくメディアを吸引します。1.25 x 10 ⁵ セル/mL の濃度で細胞ペレットを再懸濁します
。
8. 10 cm 回転楕円体成長の間に水和環境を維持するためにシャーレの底に滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 5 mL を追加します
。
9. は、シャーレの蓋を反転します。シャーレの蓋の内側の面に細胞懸濁液の 20 μ L を数滴を追加します
。
10. はすぐに蓋を再び反転、ハングの低下が外れないように注意しながら、皿の底に置きます。 図 1 が正常に形成されたハングの低下を示しています
。
11. 慎重に 37 ° C の定温器皿を配置でき、吊りで成長する回転楕円体 72 h の期間文化をドロップ

3。6 日目: 3 D マトリックスへの回転楕円体の埋め込み

1. サンプルの汚染を防ぐために文化フードで以下を実行します
。
2. 最初のフィブリンの層の形成は、血栓のソリューションとして多くの井戸の井戸あたりの 100 μ L を追加する十分なボリュームの血栓ソリューションを作成 (ウェルあたり 1 回転楕円体) 必要です。血栓は、0.1 U/mL 人間 α トロンビン、2 mg/mL フィブリノゲン量 (250 mM HEPES、1500 mM の NaCl、50 mM CaCl ₂、pH 7.4) によってバッファーの 10 X HEPES 10% ので構成されます。血栓ボリュームの残りの部分は、純水で構成されています。
   1. 追加トロンビン最後かつ迅速にソリューションを追加 48 ウェル プレートに希望の井戸井戸に追加される前に重合から血栓を防ぐためにします
   。
3. 優しくシェイク/タップ フィブリン血栓の混合物は全体をよく、コーティングはようにウェル プレートと重合する底凝固層を許可するように 1 h のためのインキュベーターのウェル プレートを配置。ウェル プレート バブル形成を誘導するのに十分なハードを手ふれしません。単に必要に応じてプレートをロックまで井戸の全体をコーティングします。大量の血栓を使用している場合この手順は必ずしも必要です
。
4. フィブリン層に回転楕円体を転送します。
   1. 削除もプレートと絞首刑の回転楕円体を含むペトリ皿インキュベーターから文化をドロップし、顕微鏡下で回転楕円体を調べます。文化フードに料理を配置します
   。
   2. 慎重にアクセスを許可するシャーレのふたを反転吊りする文化にドロップします
   。
   3. 1 mL の注射器に付いている 21 G 針を使用して慎重に井戸の底をコーティング重合フィブリン層を穴をあけるように注意して、各井戸の中心に逆蓋から一滴を転送します。ドロップを効率的に転送するには、針の中にドロップをゆっくりと引き出します。戻るとすぐに針の内部全体のドロップは、プランジャーを取得を停止します。ドロップをあまりにも遠くに引いて効果的な回転楕円体の転送または後続のイメージングを混乱させることができます空気の泡を引き起こす可能性があります
   。
   4. 回転楕円体が必要なすべての井戸に正しく転送されるようにするには顕微鏡下でウェル プレートを調べます
   。
5. 2 番目のフィブリンの層の形成、最初フィブリン層 (ステップ 3.2) の作成については、上記と同じ準備を使用して別の血栓ソリューションを作成します。慎重に各回転楕円体を含むドロップに 100 μ L のピペットし、再び回転楕円体がそのまま残っているし、井戸の端にプッシュされていないことを確認するには顕微鏡下で調べています
。
6. インキュベーターにウェル プレートを返し 1 h. の重合に 2 番目の層を許可します。

4。6 日目: プロ渡り鳥や抑制因子添加

1. 37 暖かい HDFn メディア ° C
2. の汚染を防ぐためにフードで次の手順を実行します
。
3. 評価されるプロ/反 migratory エージェントの適切な濃度を含む各グループのメディアを準備します
。
4. インキュベーターと文化フードの場所からウェル プレートを削除します
。
5. 回転楕円体群の各ウェルに標準的なメディアの追加 500 μ L、回転楕円体の移行抑制グループの各ウェルに抑制メディアの 500 μ L と移行が強化された回転楕円体グループの各ウェルに pro 渡り鳥メディアの 500 μ L.
6. ウェル プレートをインキュベーターに戻ります
。
7. 変化媒体ごとの 48 h.

5。日 6-9: 評価の細胞の遊走や増殖

72 h オプションのメディア (0 h) と 24 h に、添加直後に明視野顕微鏡を用いた

1. 画像回転楕円体: 各時点で z スタックのイメージを取る場合を決定するために移行は、焦点の主な区域の外の平面で発生しています。我々 の経験では、この問題は発生しません。しかし、これはすべての実験の場合ことを確認すると便利です
。
2. 連続時間の各ポイントで各回転楕円体のセルの枠線をトレースして各回転楕円体の面積のパーセントの増加を分析することにより各ウェルの細胞伸長を決定する使用 ImageJ、" 測定 " 領域を取得します
。

結果

正常にプロおよび反渡り鳥エージェントの体外線維芽細胞に及ぼす影響を評価する回転楕円体文化を利用できます。
72 h (図 1) の期間にわたってドロップ文化をぶら下げを介して 3 D 線維芽細胞スフェロイドを形成できます。培養期間が過ぎると、回転楕円体は、血栓のマトリックスに埋め込まれ、対物レンズ (図 2...

ディスカッション

このプロトコルでは、創傷治癒過程で細胞の移動の検討は、生体外で3D モデルを Ecm を関連付けられているをことができます。プロシージャの適切な実行の重要なステップは、線維芽細胞のスフェロイドの適切な開発2,500 セル/ドロップの初期濃度を与える細胞濃度の準備中に最適化されたフォームに回転楕円体を 72 時間の潜伏期間を確実にできます。細胞の数が少ないを使用する場合...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine	VWR	VWRL0148-0500	DMEM already containing L-glutamine can also be used
100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic	VWR	10861-594	Dishes of any size can be used for hanging drop culture
Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested	Sigma-Aldrich	12306C-500ML
L-glutamine	Fisher Scientific	ICN1680149	Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine
Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Human Dermal Fibroblasts, neonatal	Thermo Fisher	C0045C	Can be replaced with other cell type of interest
21 G x 1 1/2' needle	BD	305167	22 G x 1 1/2 needles will also work
1 mL syringe	VWR	89174-491	Syringes of any volume can be used
Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells)	VWR	82051-004
Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted	Enzyme Research Laboratories	FIB 3	Can be replaced with matrix protein of interest
Human Alpha Thrombin	Enzyme Research Laboratories	HT 1002a	May not be necessary depending on matrix protein of interest
Equipment
BSL2 cell culture hood
Cell culture incubator
Inverted microscope with 10X objective
Centrifuge compatibile with 15 mL tubes