Caracterización de la migración de la célula en tres dimensiones In Vitro herida ambientes

Resumen

El objetivo de este protocolo es evaluar el efecto de los factores pro y anti migratory en migración de la célula dentro de una matriz tridimensional de fibrina.

Resumen

Actualmente, mayoría en vitro de los modelos de cicatrización, como ensayos de rayado bien establecidos, implican estudiar celular migración herida cierre en superficies bidimensionales. Sin embargo, el ambiente fisiológico en que en vivo de cicatrización se lleva a cabo es tridimensional en lugar de dos dimensiones. Es cada vez más claro que el comportamiento celular difiere enormemente en dos dimensiones vs entornos tridimensionales; por lo tanto, hay una necesidad de más fisiológico relevantes en vitro modelos para estudiar comportamientos de migración celular en el encierro de la herida. El método aquí descrito permite el estudio de la migración celular en un modelo tridimensional que mejor refleja las condiciones fisiológicas que ensayos cero dos dimensiones previamente establecidos. El propósito de este modelo es evaluar consecuencia de células mediante el examen de la migración de la célula de un cuerpo esferoide incrustado dentro de una matriz de fibrina en presencia de factores de pro o anti migratory. Usando este método, fruto de célula del cuerpo esferoide en una matriz tridimensional puede ser observado y es fácilmente cuantificable en el tiempo mediante microscopía brightfield y análisis de la zona del cuerpo esferoide. El efecto de factores pro-migratorias o inhibitorios sobre migración de la célula puede también ser evaluado en este sistema. Este método ofrece a los investigadores con un método sencillo de análisis de migración de la célula en matrices tridimensionales herida asociada en vitro, aumentando la relevancia de in vitro células estudios previo a la utilización de animales en vivo modelos.

Introducción

La cicatrización es un proceso complejo que resulta en la restauración de la integridad del tejido después de lesión. Este proceso se divide en cuatro etapas superpuestas de hemostasia, inflamación, proliferación y remodelación, que son cada uno regulado por una compleja combinación de señales solubles, las interacciones célula-matriz y célula-célula comunicaciones. ^{1 , 2} la orquestación de estas señales controla multitud de respuestas celulares en la cicatrización de heridas incluyendo, importantemente, migración de la célula. ^{3 , 4} migración celular es un proceso dinámico dependiente de fenotipos celulares y las propiedades bioquímicas y biofísicas de la medio de la matriz extracelular. ⁵ células sonda continuamente su entorno matriz extracelular a través de vías mediadas por integrinas; Este proceso permite a las células detectar una amplia gama de propiedades de la matriz incluyendo topografía, rigidez y aislamiento. Dos dimensiones (2D) el análisis de migración de la célula demuestra que la migración es impulsada por lamellipodia formación a la vanguardia a través de la generación de haces de filamentos de actina. Posterior formación de adherencias focales a la vanguardia, en combinación con actomyosin por contracción y retracción en el borde de fuga, unidades de la célula hacia adelante. ⁶ migración celular tridimensional (3D) en la actualidad no se entiende bien, sin embargo, estudios recientes demuestran que la migración 3D es marcadamente diferente a la anteriormente descrito mecanismo en 2D y es probablemente por mecanismos alterativo. Por ejemplo, estudios recientes por Petrie et al. demostró que, dependiendo de las propiedades de la ECM, las células matrices 3D pueden cambiar entre lamellipodium y lobopodium por mecanismos de la migración. ⁷ debido a migración de la célula es un componente crítico de la respuesta de cicatrización, modelos 3D de migración de la célula son críticos para la comprensión de respuestas fisiológicas a diferentes estímulos durante la cicatrización de heridas. Aunque el comportamiento migratorio de la célula en las superficies de la 2D se ha demostrado que varían mucho de la migración en matrices 3D, modelos en vitro más actuales de la migración celular durante el proceso, incluyendo el ensayo de rayado bien establecido, de cicatrización utilizan 2D cultivos de monocapa. ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14} más recientemente desarrollado análisis han utilizado una matriz 3D, pero aún las células en una monocapa sobre la matriz, lo que limita la capacidad de realmente recapitular la tridimensionalidad del entorno de la célula de la cultura en vivo. ¹⁵

El propósito del método descrito en este documento es estudiar la migración de células en un modelo 3D fisiológicamente relevante, en lugar de en una superficie 2D, para tener una comprensión más robusta de las respuestas de migración asociados con los estímulos aplicados. Este método permite la evaluación de la migración de la célula dentro de una matriz del coágulo de fibrina 3D en presencia de factores que activan o inhiben vías asociadas con la migración de la célula. Una matriz de fibrina fue elegida para este método debido al papel crítico que desempeña fibrina en las primeras etapas de la cicatrización de heridas; siguientes lesiones, un coágulo de fibrina se formaron dentro de los entornos de la herida para detener la pérdida de sangre y sirven como un andamio para la infiltración de la célula inicial durante la reparación del tejido y remodelación. ^{2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} además, fibrina se utiliza clínicamente como un sellante quirúrgico y la composición de los selladores ha estado ligada a la migración de la célula y el último los resultados de curación. Un estudio previo por Cox et al. investigado la migración de fibroblastos con coágulos de fibrina compuestos de fibrina variable y concentraciones de trombina con el fin de optimizar un sellante de fibrina. En estos estudios, se cuantificó la migración de células de coágulos de fibrina en platos de plástico. ²⁰ aquí presentamos un método que permite la cuantificación de la migración de las células en el entorno 3D de la fibrina. Aunque el método descrito en el presente Protocolo específicamente utiliza fibrina, este modelo puede ser modificado fácilmente para utilizar materiales alternativos de matriz como se desee, como el colágeno u otras matrices 3D. Además, presentamos el uso de esferoides de fibroblastos en este ensayo debido a la migración de fibroblastos en el lecho de la herida es de suma importancia para la síntesis de matriz extracelular y tejido reparación/remodelación. Sin embargo, durante la reparación proceso neutrófilos son el primer tipo de células a migrar en el lecho de la herida, seguido por los macrófagos. Fibroblastos comienzan entonces a infiltrarse en el entorno de la herida aproximadamente 48 horas después de lesión inicial, al comienzo de la fase proliferativa del proceso de cicatrización. ¹⁹ este ensayo podría ser fácilmente modificado para incluir neutrófilos, macrófagos y otros tipos de células para evaluar cómo alteraciones en la estructura del coágulo de fibrina afectan la migración de estos tipos celulares. ²¹

Para aplicar este análisis, en primer lugar, un esferoide del fibroblasto se forma utilizando una modificación de las técnicas descritas para el cultivo de células madre. ²² el esferoide del fibroblasto se transfiere posteriormente en una matriz de fibrina 3D, y consecuencia puede entonces fácilmente supervisar y cuantificar durante varios días. Este protocolo tiene en cuenta el 3D de sistemas fisiológicos incrustando esferoides celulares 3D dentro de una matriz de fibrina, evitando así las limitaciones en relevancia provocada por usar una superficie de crecimiento 2D con una monocapa de células al comportamiento migratorio de la modelo, mientras que que permite para la evaluación del comportamiento de la célula en un ambiente altamente controlado en vitro .

Protocolo

1. día 1: la célula y preparación de los reactivos

Nota: toda la preparación de la célula y el reactivo debe realizarse en un gabinete para prevenir la contaminación de las muestras de seguridad biológica.

1. Caliente filtrada Dulbecco ' s Modified Eagle ' s medio (DMEM), suero bovino fetal (FBS), L-glutamina y penicilina/estreptomicina en un baño de agua de 37 ° C.
2. Prepare medios de fibroblastos dérmicos humanos neonatales (HDFn) complementando calentado DMEM con 10% FBS, penicilina/estreptomicina de 1% y 1% L-glutamina.
3. Descongelar un vial de congelados HDFns y centrifugue durante 8 min a 200 x g para eliminar medio criopreservación. Resuspender las células en medios de HDFn preparados a una densidad de 1 x 10 ⁶ células/mL y semilla en un frasco de cultura T-75.
4. Matraz de lugar en una incubadora (37 ° C, 5% CO ₂) para permitir la proliferación celular.
5. Tienda HDFn media a 4 ° C.
6. Preparar los pro y anti migratory reactivos según sea necesario.

2. Día 3: Esferoide preparación

1. haga lo siguiente en una campana para prevenir la contaminación de las muestras de cultura.
2. Cuando las células alcanzan el 80% de confluencia, aspirar los medios de comunicación y añadir 5 mL de 0.25% tripsina-EDTA. Frasco de tienda en una incubadora de 37 ° C por 5 min separar completamente las células de la superficie del frasco.
3. Añadir 5 mL de medio caliente al matraz para neutralizar la tripsina.
4. En un tubo de microcentrífuga, mezclar 10 μL de azul tripán y 10 μL de la suspensión celular.
5. Centrifugar la suspensión de la célula original durante 8 min a 200 x g.
6. Mientras que la suspensión de células es ser centrifugada, añadir 10 μL de la suspensión de células de azul de tripano a un hemocitómetro y realizar un conteo de.
7. Después de centrifugación, aspirar los medios de comunicación sin el desalojamiento de la pelotilla de la célula. Resuspender el precipitado de células en una concentración de 1,25 x 10 ⁵ células/mL.
8. Añadir 5 mL de tampón de fosfato estéril salino (PBS) en la parte inferior de una placa de Petri para mantener un ambiente hidratado durante el crecimiento del esferoide de 10 cm.
9. Invertir la tapa de la caja Petri. Añadir varias 20 gotas de μL de la suspensión de células en la superficie interna de la tapa de la caja de Petri.
10. Rápidamente invertir la tapa nuevamente y colocar en el fondo de la fuente, teniendo cuidado de no desplazar las gotas de la suspensión. la figura 1 ilustra correctamente formados colgante gotas.
11. Cuidadosamente coloque el plato en una incubadora de 37 ° C y esferoides en colgante gota cultura durante un período de 72 h.

3. Día 6: Incorporación de esferoides en matriz 3D

1. haga lo siguiente en una campana para prevenir la contaminación de las muestras de cultura.
2. Para la formación de la primera capa de fibrina, crear una solución de coágulo de volumen suficiente para añadir 100 μL de solución de coágulo por pozo para tantos pozos como necesaria (1 esferoide por pozo). Coágulos se componen de 10% 10 X HEPES del almacenador intermediario por volumen (250 mM HEPES, 1500 mM NaCl, 50 mM CaCl ₂, pH 7,4), fibrinógeno humano 2 mg/mL y 0,1 U/mL humano alfa de la trombina. El resto del volumen del coágulo se compone de agua ultrapura.
   1. Añadir trombina última y rápidamente agregue una solución a pozos deseadas en una placa de 48 pozos para impedir que coágulos de polimerizarse antes de ser añadido a los pozos.
3. Agitar suavemente/tap bien placa para asegurar que la mezcla del coágulo de fibrina es capa todo el bien y luego colocar la placa bien en la incubadora durante 1 hora permitir que la capa inferior de clot polimerizar. No sacuda la placa bien dura inducir la formación de burbujas; simplemente la placa de roca como sea necesario hasta que la totalidad del pozo es revestida. Si se utilizan volúmenes de coágulos más grandes, este paso puede no ser necesario.
4. Transferencia esferoides a la capa de fibrina.
   1. Quitar bien la placa y la placa de Petri que contiene esferoides en el colgante gota de cultivo de la incubadora y examinan esferoides bajo un microscopio. Luego coloque el plato en la campana de cultura.
   2. Invertir cuidadosamente la tapa de la caja Petri para permitir el acceso al colgante gota culturas.
   3. Cuidadosamente con una aguja de 21 G conectada a una jeringa de 1 mL, transferir una gota de la tapa invertida en el centro de cada bien, teniendo cuidado de no para perforar la capa de fibrina polimerizada cubriendo el fondo del pozo. Para transferir efectivamente la gota, Jale lentamente la caída en la aguja. Dejar de tirar el émbolo hacia atrás tan pronto como la caída de toda está dentro de la aguja; tirando la caída hacia atrás demasiado lejos puede introducir burbujas de aire, que pueden alterar imágenes posteriores o transferencia efectiva esferoide.
   4. Examinar la placa bien bajo un microscopio para asegurarse de que esferoides han transferido correctamente en pocillos todo deseados.
5. Para la formación de la segunda capa de fibrina, crear otra solución de coágulo, con la misma preparación que el anterior para la creación de la primera capa de fibrina (paso 3.2). Cuidadosamente Pipetee 100 μL en cada gota que contiene el esferoide y examinar bajo el microscopio para asegurarse de que los esferoides están todavía intactos y no han empujado a los bordes de los pozos.
6. Devolver la placa bien a la incubadora y permitir que la segunda capa polimerizar por 1 h.

4. Día 6: Adición de factores inhibitorios o Pro migratorias

1. medios de HDFn caliente a 37 ° C.
2. Siga los siguientes pasos en una campana para evitar la contaminación.
3. Preparar los medios de comunicación para cada grupo incluyendo las concentraciones adecuadas de agentes pro/anti-migratory evaluarse.
4. Quitar la placa de la pozo de incubadora y el lugar en una campana de cultura.
5. Añadir 500 μL de medio estándar a cada pocillo del grupo control esferoide, 500 μL de inhibitoria media a cada pocillo del grupo inhibe migración esferoide y 500 μL de medios pro migratorias en cada pocillo del grupo de mayor migración esferoide.
6. Devolver la placa de la pozo a la incubadora de.
7. Medios de cambio cada 48 h.

5. Días 6-9: evaluación de la migración celular y la proliferación

1. imagen esferoides mediante microscopía brightfield inmediatamente después de la adición de medios (0 h) y luego cada 24 h por 72 h. opcional: en cada momento, tomar una imagen de z-stack para determinar si migración es que ocurre en planos fuera del área principal de enfoque. En nuestra experiencia esto no ocurre; sin embargo, es útil para asegurarse de esto es el caso en todos los experimentos.
2. Uso de ImageJ para determinar extensión de células en cada pozo analizando por ciento aumento de superficie para cada esferoide trazar la frontera de la célula para cada esferoide en cada momento sucesivo y utilizando la " medida " función para obtener el área de.

Resultados

Cultura de esferoide puede ser utilizada para evaluar con éxito el efecto de agentes profesionales y anti migratorios sobre la migración de fibroblastos in vitro
Esferoides 3D del fibroblasto pueden ser formados vía colgante gota cultura durante un periodo de 72 h (figura 1). Tras el período de la cultura, esferoides se encajan dentro de la matriz del coágulo y reflejada mediante microscopía de campo luminoso (fi...

Discusión

Este protocolo permite el examen de la migración celular en la cicatrización de heridas asociadas ECMs a través de un modelo 3D en vitro . Un paso crucial en la correcta ejecución del procedimiento es el correcto desarrollo de esferoides de fibroblastos; concentración celular durante la preparación se optimizó para dar una concentración inicial de 2.500 células/drop, permitiendo esferoides de forma fiable durante un período de incubación de 72 h. Si se usa un número insuficiente de células esferoide...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine	VWR	VWRL0148-0500	DMEM already containing L-glutamine can also be used
100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic	VWR	10861-594	Dishes of any size can be used for hanging drop culture
Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested	Sigma-Aldrich	12306C-500ML
L-glutamine	Fisher Scientific	ICN1680149	Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine
Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Human Dermal Fibroblasts, neonatal	Thermo Fisher	C0045C	Can be replaced with other cell type of interest
21 G x 1 1/2' needle	BD	305167	22 G x 1 1/2 needles will also work
1 mL syringe	VWR	89174-491	Syringes of any volume can be used
Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells)	VWR	82051-004
Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted	Enzyme Research Laboratories	FIB 3	Can be replaced with matrix protein of interest
Human Alpha Thrombin	Enzyme Research Laboratories	HT 1002a	May not be necessary depending on matrix protein of interest
Equipment
BSL2 cell culture hood
Cell culture incubator
Inverted microscope with 10X objective
Centrifuge compatibile with 15 mL tubes