Caractérisation de la Migration cellulaire dans les trois dimensions In Vitro plaie environnements

Résumé

Ce protocole vise à évaluer l’effet des facteurs pro - et anti - migratory sur la migration cellulaire dans une matrice de fibrine en trois dimensions.

Résumé

Actuellement, la plupart in vitro des modèles de la cicatrisation, notamment des essais de gratter bien établies, impliquent l’étude cell migration plaie fermeture et sur une surface à deux dimensions. Cependant, l’environnement physiologique dans lequel in vivo de cicatrisation se déroule est en trois dimensions plutôt que deux dimensions. Il devient de plus en plus évident que le comportement cellulaire diffère grandement en deux dimensions par rapport à des environnements en trois dimensions ; par conséquent, il y a un besoin pour plus physiologiquement pertinents en vitro modèles pour l’étude des comportements de migration cellulaire dans la fermeture de la plaie. La méthode décrite ici permet l’étude de la migration cellulaire dans un modèle en trois dimensions qui reflète mieux les conditions physiologiques que tests gratter deux dimensions précédemment établies. Ce modèle vise à évaluer l’excroissance cellulaire par l’intermédiaire de l’examen de la migration cellulaire loin un sphéroïde de corps incorporé dans une matrice de fibrine en présence de facteurs de pro - ou anti - migratory. En utilisant cette méthode, excroissance cellulaire du corps sphéroïdes dans une matrice tridimensionnelle peut être observée et est facilement quantifiable au fil du temps via fond clair microscopie et analyse d’une partie du corps sphéroïde. L’effet de facteurs pro-migrateurs et/ou inhibitrices sur la migration cellulaire peut également être évaluée dans ce système. Cette méthode fournit aux chercheurs avec une méthode simple d’analyse de la migration cellulaire dans la plaie tridimensionnelle associée matrices in vitro, ce qui accroît la pertinence de in vitro cellule études avant l’utilisation d’in vivo de l’animal modèles.

Introduction

La cicatrisation est un processus complexe qui se traduit par la restauration de l’intégrité des tissus après une blessure. Cette démarche est subdivisée en quatre étapes qui se chevauchent par hémostase, inflammation, prolifération et le remodelage, qui font chacun l’objet par une combinaison complexe de signaux solubles, interactions cellule-matrice et les cellules communications. ^{1 , 2} l’orchestration de ces repères gère une multitude de réactions cellulaires dans la cicatrisation des plaies dont, surtout, la migration cellulaire. ^{3 , 4} la migration cellulaire est un processus très dynamique dépendant sur les propriétés biochimiques et biophysiques du milieu extracellulaire et les phénotypes cellulaires. ⁵ cellules sonder en permanence leur environnement de matrice extracellulaire par des voies induite par l’intégrine ; Ce processus permet aux cellules de détecter une large gamme de propriétés de la matrice dont la topographie, de rigidité et de confinement. Bidimensionnelle (2D) analyse de la migration cellulaire démontre que la migration est entraînée par formation de lamellipodia à la pointe grâce à la génération de faisceaux de filaments d’actine. Formation subséquente des adhérences focales à la fine pointe, en combinaison avec l’actomyosine piloté par la contraction et la rentrée sur le bord de fuite, pousse la cellule vers l’avant. ⁶ la migration cellulaire tridimensionnelle (3D) n’est actuellement pas bien comprise, cependant, des études récentes démontrent que la migration 3D est nettement différente de l’afore décrit le mécanisme en 2D et est probablement entraînée par des mécanismes altératif. Par exemple, des études récentes par Petrie et al. démontré que, en fonction des propriétés de l’ECM, cellules dans des matrices 3D peuvent basculer entre lamellipodium et lobopodium par les mécanismes de la migration. ⁷ migration cellulaire étant un élément essentiel de la réponse de cicatrisation, des modèles 3D de la migration cellulaire sont essentiels pour la compréhension des réponses physiologiques à divers stimuli pendant la cicatrisation. Bien que le comportement migrateur cellule sur une surface 2D s’est avéré varient considérablement d’un migration dans des matrices 3D, des modèles in vitro plus actuels de la migration cellulaire durant la processus, y compris le dosage zéro bien établi, de cicatrisation utilisent 2D cultures monocouches. ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14} tests développés plus récemment ont utilisé une matrice 3D, mais encore la culture des cellules dans une monocouche sur le dessus de la matrice, ce qui limite la possibilité de véritablement récapituler la tridimensionnalité de l’environnement de la cellule in vivo. ¹⁵

Le but de la méthode décrite ici est d’étudier la migration cellulaire dans un modèle 3D physiologiquement pertinent, plutôt que sur une surface 2D, afin d’acquérir une compréhension plus robuste de réponses de migration associés avec les stimuli appliqués. Cette méthode permet l’évaluation de la migration cellulaire dans une matrice de caillot de fibrine 3D en présence de facteurs qui activer ou inhiber les voies associés à la migration cellulaire. Une matrice de fibrine a été choisie pour cette méthode en raison du rôle critique fibrine joue dans les premiers stades de la cicatrisation des plaies ; après une blessure, un caillot de fibrine est formée dans les environnements de la plaie pour enrayer la perte de sang et sert comme un échafaudage pour l’infiltration de la cellule initiale au cours de la réparation des tissus et le remodelage. ^{2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} en outre, fibrine est utilisé en clinique comme mastic chirurgical et la composition de l’étanchéité a été liée à la migration cellulaire et ultimate résultats de guérison. Une étude antérieure par Cox et al. a étudié la migration des fibroblastes avec caillots de fibrine composés de fibrine variable et des concentrations de thrombine pour optimiser une fibrine. Dans ces études, la migration des cellules hors les caillots de fibrine sur la vaisselle en plastique a été quantifiée. ²⁰ nous présentons ici une méthode qui permet à la quantification de la migration des cellules dans l’environnement 3D de fibrine. Tandis que la méthode décrite dans le présent protocole spécifiquement utilise fibrine, ce modèle peut facilement être modifié pour utiliser des matériaux à matrice alternative comme vous le souhaitez, comme le collagène ou d’autres matrices 3D. En outre, nous présentons l’utilisation des sphéroïdes de fibroblastes dans ce test parce que la migration des fibroblastes dans le lit de la plaie est d’une importance primordiale à la synthèse de la matrice extracellulaire et réparation/remodelage des tissus. Cependant, au cours de la réparation processus neutrophiles sont le premier type de cellule à migrer dans le lit de la plaie, suivi par les macrophages. Fibroblastes commencent alors à s’infiltrer dans l’environnement de la plaie environ 48 heures après la lésion initiale, au début de la phase proliférative de la processus de cicatrisation. ¹⁹ ce dosage peut être facilement modifié pour inclure les neutrophiles, les macrophages ou autres types de cellules afin d’évaluer l’incidence des altérations de structure de caillot de fibrine sur migration de ces types de cellules. ²¹

Pour implémenter ce dosage, tout d’abord, un sphéroïde de fibroblastes se forme à l’aide d’une modification des techniques décrites précédemment pour la culture de cellules souches. ²² la sphéroïde de fibroblastes est transférée par la suite dans une matrice de fibrine 3D et excroissance ensuite facilement surveiller et quantifié sur plusieurs jours. Ce protocole prend en compte la 3D des systèmes physiologiques en incorporant des sphéroïdes cellule 3D au sein d’une matrice de fibrine, évitant ainsi les limitations en pertinence provoquée par un en utilisant une surface de croissance 2D avec une monocouche de cellules au comportement migratoire de modèle, tandis que en permettant l’évaluation du comportement des cellules dans un milieu hautement contrôlé en vitro .

Protocole

1. jour 1 : cellule et préparation du réactif

Remarque : toutes les préparations cellulaires et réactif doivent être effectuée sous une hotte pour prévenir la contamination des échantillons de sécurité biologique.

1. Chaud filtré Dulbecco ' s Modified Eagle ' s moyen (DMEM), sérum fœtal (SVF), L-glutamine et la pénicilline/streptomycine dans un bain-marie à 37 ° C.
2. Médias néonatale fibroblastes dermiques humains (HDFn) Prepare par complétant réchauffement DMEM avec 10 % FBS, pénicilline/streptomycine de 1 % et 1 % L-glutamine.
3. Décongeler un flacon de gelée HDFns et centrifuger pendant 8 min à 200 x g à éliminer le milieu de la cryoconservation. Remettre en suspension des cellules dans des milieux de HDFn préparés à une densité de 1 x 10 ⁶ cellules/mL et graines dans un flacon de culture de T-75.
4. Ballon de Place dans un incubateur (37 ° C, 5 % de CO ₂) pour permettre la prolifération cellulaire.
5. Store HDFn médias à 4 ° C.
6. Préparer les pro - et anti - migratory réactifs si nécessaire.

2. Jour 3 : Préparation de sphéroïde

1. effectuez les opérations suivantes dans une hotte de culture pour éviter la contamination des échantillons de.
2. Lorsque les cellules atteignent 80 % confluence, aspirer les médias et ajouter 5 mL de 0,25 % trypsine-EDTA. Fiole de magasin dans un incubateur à 37 ° C pendant 5 min détacher complètement les cellules de la surface de la fiole.
3. Ajouter 5 mL de médias réchauffée dans le ballon pour neutraliser la trypsine.
4. Dans un tube de microcentrifuge, mélanger 10 μL de bleu Trypan et 10 μl de la suspension cellulaire.
5. Centrifuger la suspension cellulaire original pendant 8 min à 200 x g.
6. Tandis que la suspension cellulaire est être centrifugée, ajouter 10 μL de la suspension cellulaire bleu Trypan à un hémocytomètre et effectuer un comptage cellulaire.
7. Après centrifugation, aspirer les médias sans déloger le culot cellulaire. Resuspendre le culot de cellules à une concentration de 1,25 x 10 ⁵ cellules/mL.
8. Ajouter 5 mL de sérum physiologique stérile tamponnée au phosphate (PBS) au fond d’une boîte de Pétri pour maintenir un environnement hydraté durant la croissance de sphéroïde de 10 cm.
9. Inverser le couvercle de la boîte de Pétri. Ajouter quelques 20 μL gouttes de la suspension de cellules sur la surface intérieure du couvercle de la boîte de Pétri.
10. Rapidement inverser le couvercle à nouveau et remettez-la sur le fond du plat, en veillant à ne pas déloger les gouttes de pendaison. la figure 1 illustre les gouttes suspendues correctement formé.
11. Soigneusement placer la capsule dans un incubateur à 37 ° C et laisser les sphéroïdes à grandir dans un accrochage déposer culture pendant une période de 72 h.

3. Jour 6 : Intégrer les sphéroïdes dans matrice 3D

1. effectuez les opérations suivantes dans une hotte de culture pour éviter la contamination des échantillons de.
2. Pour la formation de la première couche de fibrine, créez une solution de caillot d’un volume suffisant d’ajouter 100 μL de solution caillot / puits puits autant que nécessaire (1 sphéroïde / puits). Les caillots sont composés de 10 % 10 X HEPES tampons par volume (250 mM HEPES, 1500 mM NaCl, 50 mM CaCl ₂, pH 7,4), fibrinogène humain 2 mg/mL et thrombine alpha humain de 0,1 U/mL. Le reste du volume caillot se compose de l’eau ultrapure.
   1. Ajouter la thrombine dernière et rapidement ajouter solution aux puits désirées dans une plaque de 48 puits afin d’empêcher la polymérisation avant d’être ajouté aux puits de caillots.
3. Doucement agiter/robinet plaque puits pour s’assurer que mélange de caillot de fibrine est enduit tout le bien et puis placez la plaque bien dans l’incubateur pendant 1 h permettre à la couche inférieure de caillot à polymériser. Ne secouez pas la plaque bien assez dur pour induire la formation de bulles ; plaque de roche simplement que nécessaire jusqu'à ce que l’intégralité du puits est enduite. Si de plus grands volumes de caillot sont utilisées, cette étape n’est peut-être pas nécessaire.
4. Transfert des sphéroïdes à la couche de fibrine. Plaque
   1. enlever le puits et la boîte de Pétri contenant des sphéroïdes à la pendaison abandonner la culture de l’incubateur et examinez les sphéroïdes sous un microscope. Puis placez le plat sur le capot de la culture.
   2. Inverser soigneusement le couvercle de la boîte de Pétri pour permettre l’accès à la pendaison drop cultures.
   3. à l’aide d’une aiguille de 21 G attachée à une seringue de 1 mL, transvaser avec soin une goutte du couvercle inversé dans le centre de chaque bien, en prenant soin de ne pas pour percer la couche de fibrine polymérisée revêtement du fond du puits. Pour transférer efficacement la chute, tirez lentement sur la chute dans l’aiguille. Arrêter de tirer le piston arrière dès que la chute de l’ensemble est à l’intérieur de l’aiguille ; tirant la baisse trop loin peut introduire des bulles d’air, qui peuvent perturber le transfert efficace de sphéroïde ou imagerie ultérieure.
   4. Examiner la plaque bien sous microscope pour s’assurer que les sphéroïdes ont correctement transférées dans des puits tout désirées.
5. Pour la formation de la deuxième couche de fibrine, créez une autre solution de caillot à l’aide de la même préparation que ci-dessus pour la création de la première couche de fibrine (étape 3.2). Soigneusement distribuer 100 μL sur chaque goutte contenant du sphéroïde et examiner sous un microscope pour vérifier que les sphéroïdes sont toujours intacts et n’ont pas été poussés jusqu’aux bords des puits.
6. Retourner la plaque bien dans l’incubateur et autoriser la deuxième couche polymériser pendant 1 h.

4. Jour 6 : Ajout de Pro-migrateurs ou de facteurs inhibiteurs

1. médias HDFn chaud à 37 ° C.
2. Effectuez les opérations suivantes dans une cagoule pour éviter la contamination.
3. Préparer les milieux pour chaque groupe, y compris les concentrations appropriées d’agents pro/anti-migratory à évaluer.
4. Enlever la plaque bien de l’incubateur et le placer dans une hotte de culture.
5. Ajouter 500 μl de support standard dans chaque puits du groupe témoin sphéroïde, 500 μL d’inhibiteur médias dans chaque puits du groupe inhibées par migration sphéroïde et 500 μL des médias pro-migrateurs dans chaque puits du groupe migration améliorée sphéroïde.
6. Remettez la plaque bien dans l’incubateur.
7. Médias de changement chaque 48 h.

5. Jours 6-9 : évaluation de la Migration cellulaire et la prolifération

1. Image sphéroïdes microscope à fond clair immédiatement après l’ajout de médias (0 h) et ensuite toutes les 24 h pendant 72 h. facultatif : à chaque point dans le temps, prendre une image de z-pile afin de déterminer si migration se produit dans des plans à l’extérieur le principal domaine d’activité. Dans notre expérience, cela ne fonctionne pas ; Toutefois, il est utile de s’assurer que c’est le cas dans chaque expérience.
2. Utilisation ImageJ pour déterminer l’excroissance cellulaire dans chaque puits en analysant les pourcentages d’augmentation dans la zone pour chaque ellipsoïde en traçant la bordure de cellule pour chaque ellipsoïde à chaque point de temps successifs et en utilisant la " mesure " fonction pour obtenir le domaine.

Résultats

Culture de l’ellipsoïde peut être utilisée pour évaluer correctement l’effet d’agents pro et anti-migrateurs sur la migration des fibroblastes in vitro
Sphéroïdes de fibroblastes 3D peuvent être formés par chute de culture en suspension sur une période de 72 h (Figure 1). Après la période de culture, sphéroïdes sont intégrés au sein de la matrice de caillot et imagés microscope à fond clair (Figu...

Discussion

Ce protocole permet l’examen de la migration cellulaire dans la cicatrisation des plaies entraînées SEGDA via un modèle 3D in vitro . Une étape cruciale dans la bonne exécution de la procédure est le bon développement des sphéroïdes de fibroblastes ; la concentration cellulaire au cours de la préparation a été optimisée pour donner une concentration initiale de 2 500 cellules/drop, permettant des sphéroïdes à forme fiable sur une période d’incubation de 72 h. Si un nombre suffisant de cellu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine	VWR	VWRL0148-0500	DMEM already containing L-glutamine can also be used
100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic	VWR	10861-594	Dishes of any size can be used for hanging drop culture
Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested	Sigma-Aldrich	12306C-500ML
L-glutamine	Fisher Scientific	ICN1680149	Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine
Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Human Dermal Fibroblasts, neonatal	Thermo Fisher	C0045C	Can be replaced with other cell type of interest
21 G x 1 1/2' needle	BD	305167	22 G x 1 1/2 needles will also work
1 mL syringe	VWR	89174-491	Syringes of any volume can be used
Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells)	VWR	82051-004
Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted	Enzyme Research Laboratories	FIB 3	Can be replaced with matrix protein of interest
Human Alpha Thrombin	Enzyme Research Laboratories	HT 1002a	May not be necessary depending on matrix protein of interest
Equipment
BSL2 cell culture hood
Cell culture incubator
Inverted microscope with 10X objective
Centrifuge compatibile with 15 mL tubes