Zellwanderung in dreidimensionales In Vitro Charakterisierung Wunde Umgebungen

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Wirkung der Pro und anti migratory Faktoren auf Zellwanderung innerhalb einer dreidimensionalen Fibrin-Matrix bewerten.

Zusammenfassung

Derzeit die meisten in-vitro- Modelle der Wundheilung, wie etablierte Scratch-Assays, Studium Zelle Migration und Wunde Schließung auf zweidimensionalen Flächen beinhalten. Allerdings ist die physiologische Umgebung welche in Vivo Wundheilung erfolgt dreidimensional als zweidimensionale. Es wird immer deutlicher, dass Zelle Verhalten unterscheidet sich stark in zweidimensionalen vs. dreidimensionale Umgebungen; Daher gibt es eine Notwendigkeit an mehr physiologisch relevanten in-vitro- Modelle für das Studium Zelle Migration Verhaltensweisen in Wundverschluss. Die hier beschriebene Methode ermöglicht das Studium der Zellwanderung in einem dreidimensionalen Modell, das physiologische Bedingungen besser als vorher festgelegten zweidimensionale Scratch Assays widerspiegelt. Dieses Modell soll Zelle Auswuchs über die Prüfung der Zellmigration Weg ein Sphäroid Körper eingebettet innerhalb einer Fibrin-Matrix im Beisein von Pro oder anti migratory Faktoren zu bewerten. Mit dieser Methode Zelle Auswuchs aus dem Sphäroid Körper in einer dreidimensionalen Matrix beobachtet werden und im Laufe der Zeit durch Brightfield Mikroskopie und Analyse von Sphäroid Körperbereich leicht quantifizierbar ist. Die Wirkung von Pro-wandernde oder hemmende Faktoren auf Zellwanderung kann auch in diesem System ausgewertet werden. Diese Methode bietet eine einfache Methode des Analysierens Zellwanderung in dreidimensionale Wunde verbunden Matrizen in-vitro-Forscher, wodurch sich die Relevanz der in-vitro- Studien Zelle vor der Verwendung von in-Vivo -Tier Modelle.

Einleitung

Wundheilung ist ein komplexer Prozess, der die Wiederherstellung der Gewebe Integrität nach Verletzung führt. Dieser Prozess wird in vier überlappende Phasen Blutstillung, Entzündungen, Verbreitung und Umbau, umgeben aufgeteilt die jeweils geregelt sind durch eine komplexe Kombination von löslichen Queues, Zelle-Matrix Interaktionen und Zell-Zell-Kommunikation. ^{1 , 2} die Orchestrierung dieser Signale steuert eine Vielzahl von zellulären Reaktionen bei der Wundheilung einschließlich allem Zellmigration. ^{3 , 4} Zellwanderung ist ein sehr dynamischer Prozess abhängig von zellulären Phänotypen und die biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften des extrazellulären Matrix Milieus. ⁵ Zellen Sonde kontinuierlich ihre extrazellulären Matrix Umwelt durch Integrin-vermittelte Wege; Dieser Prozess ermöglicht Zellen, eine Vielzahl von Matrixeigenschaften einschließlich der Topographie, der Steifigkeit und der Entbindung zu spüren. Zweidimensionale (2D) Analyse der Zellwanderung zeigt, dass die Migration von Lamellipodia Bildung an der Vorderkante durch die Generierung von Aktin-Filament-Bundles angetrieben wird. Nachträgliche Bildung von fokalen Adhäsionen an der Vorderkante, in Kombination mit Actomyosin getrieben Kontraktion ein- und Ausfahren an der Hinterkante treibt die Zelle. ⁶ dreidimensionale (3D) zelluläre Migration ist derzeit nicht bekannt, jedoch neuere Studien zeigen, dass 3D Migration deutlich anders als die zuvor Mechanismus in 2D beschriebenen und wird wahrscheinlich von alterative Mechanismen gesteuert. Beispiel: neuere Studien von Petrie Et Al. gezeigt, dass je nach den Eigenschaften des ECM, Zellen in 3D Matrizen zwischen Lamellipodium und Lobopodium getrieben Mechanismen der Migration wechseln können. ⁷ da Zellwanderung ein wesentlicher Bestandteil der Wundheilung Reaktion ist, 3D-Modelle von Zellwanderung sind entscheidend für das Verständnis der physiologischer Reaktionen auf verschiedene Reize bei der Wundheilung. Obwohl Zelle Wanderungsverhalten auf 2D Oberflächen stark variieren von Migration in 3D Matrizen nachgewiesen wurde, nutzen die aktuelle in-vitro- Modelle der Zellwanderung während der Wundheilung, einschließlich der etablierten Scratch Test 2D Monolayer-Kulturen. ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14} vor kurzem entwickelt Tests eine 3D Matrix verwendet haben, aber noch Kulturzellen in einer Monolage auf der Matrix begrenzt somit die Fähigkeit, wirklich die Dreidimensionalität der Zelle Umwelt rekapitulieren in-vivo. ¹⁵

Die hier beschriebene Methode soll Zellwanderung in einem physiologisch relevanten 3D-Modell, anstatt auf eine 2D Oberfläche zu studieren, um ein robuster Verständnis von Migration Antworten verbunden sind mit den angewandten reizen. Diese Methode ermöglicht die Bewertung der Zellwanderung innerhalb einer 3D Fibrin-Gerinnsel-Matrix im Beisein von Faktoren, die zu aktivieren oder hemmen Wege Zellwanderung zugeordnet. Für diese Methode durch die kritische Rolle der Fibrin in den frühen Phasen der Wundheilung wurde eine Fibrin-Matrix gewählt; Folgende Verletzungen, ein Fibrin-Gerinnsel entsteht innerhalb der Umgebung der Wunde Blutverlust einzudämmen und dient als Gerüst für die erste Zelle eindringen während der Reparatur von Gewebe und Umbau. ^{2 , 16 , 17 , 18 , 19 ,} Darüber hinaus ²⁰ Fibrin wird klinisch als eine chirurgische Dichtungsmittel verwendet und die Zusammensetzung der Dichtstoffe Zellwanderung und ultimative Heilung Ergebnisse gebunden worden ist. Einer früheren Studie von Cox Et Al. Migration von Fibroblasten mit Fibrin Gerinnsel bestehend aus unterschiedlichen Fibrin und Thrombin Konzentrationen zum Zwecke der Optimierung ein Fibrin Dichtungsmittel untersucht. In diesen Studien wurde die Wanderung von Zellen aus Fibrin Gerinnsel auf Plastikschalen quantifiziert. ²⁰ hier präsentieren wir eine Methode, die zur Quantifizierung der Migration von Zellen innerhalb der 3D Fibrin-Umgebung ermöglicht. Während die Methode, die speziell in diesem Protokoll beschriebenen Fibrin verwendet, kann dieses Modell leicht geändert werden, um alternative Matrixmaterialien zu verwenden, wie gewünscht, z. B. Kollagen oder andere 3D Matrizen. Darüber hinaus präsentieren wir die Verwendung von Fibroblasten Sphäroide in diesem Assay, weil Fibroblasten Migration in das Wundbett für Synthese der extrazellulären Matrix und Gewebe Reparatur/Umbau von höchster Bedeutung ist. Jedoch während der Reparatur sind Prozess Neutrophile die erste Zelle Art in das Wundbett, gefolgt von Makrophagen wandern. Fibroblasten beginnen dann die Wundumgebung ca. 48 Stunden nach der ersten Verletzung zu Beginn der Proliferativen Phase der Wundheilung zu infiltrieren. ¹⁹ dieser Assay kann leicht geändert werden, um zählen Neutrophile, Makrophagen oder anderen Zelltypen zu beurteilen, wie Änderungen in Fibrin Gerinnsel Struktur Migration dieser Zelltypen beeinflussen. ²¹

Um diesen Test zu implementieren, wird zunächst ein Sphäroid Fibroblasten gebildet eine Modifikation der zuvor beschriebenen für Stammzelle-Kultur Techniken. ²² Fibroblasten Sphäroid wird anschließend in einer 3D Fibrin-Matrix übertragen, und Auswuchs kann dann leicht überwacht und über mehrere Tage quantifiziert. Dieses Protokoll berücksichtigt die 3D physiologische Systeme durch das Einbetten von 3D Zelle Sphäroide innerhalb einer Fibrin-Matrix, wodurch die Einschränkungen in Relevanz durch eine mit einer 2D Wachstumsoberfläche eine Zelle Monolage auf Modell Wanderungsverhalten herbeigeführt, zwar noch ermöglicht zur Auswertung der Zelle Verhalten in einer streng kontrollierte in-vitro- Umgebung.

Protokoll

1. Tag1: Zelle und Reagenz Vorbereitung

Hinweis: alle Zell- und Reagenz Vorbereitung sollte in einem biologischen Sicherheitsschrank gegen Kontamination der Proben durchgeführt werden.

1. Warm gefiltert Dulbecco ' s Modified Eagle ' s Medium (DMEM), fetale bovine Serum (FBS), L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin in einem 37 ° C Wasserbad.
2. Vorbereiten Neugeborenen menschlichen dermalen Fibroblasten (HDFn) Medien durch Ergänzung erwärmt DMEM mit 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin und 1 % L-Glutamin.
3. Tauwetter ein Fläschchen mit gefrorenen HDFns und Zentrifuge für 8 min. bei 200 X g Kryokonservierung Medium zu entfernen. Zellen in vorbereitete HDFn Medien bei einer Dichte von 1 x 10 ⁶ Zellen/mL und Samen in einer T-75 Kultur Flasche aufzuwirbeln.
4. Ort Kolben in einem Inkubator (37 ° C, 5 % CO ₂) erlauben Zellproliferation.
5. Store HDFn Media bei 4 ° c
6. Pro und anti migratory Reagenzien vorzubereiten, wie gebraucht.

2. 3. Tag: Sphäroid Vorbereitung

1. führen Sie die folgenden in eine Kultur-Haube, Kontamination der Proben zu verhindern.
2. Wenn Zellen erreichen 80 % Konfluenz aspirieren Sie Medien und Hinzufügen von 0,25 % 5 mL Trypsin-EDTA. Shop-Kolben in einem Inkubator 37 ° C für 5 min, Zellen von der Oberfläche der Küvette vollständig zu lösen.
3. Fügen Sie 5 mL erwärmten Medien in den Kolben, die Trypsin neutralisieren.
4. In einem Microcentrifuge Schlauch mischen, 10 μL Trypan blau und 10 μl Zellsuspension.
5. Zentrifuge der ursprünglichen Zellsuspension für 8 min bei 200 X g.
6. Während die Zellsuspension zentrifugiert wird, ist ein Hemocytometer 10 μl Zellsuspension Trypan Blau hinzu, und führen Sie eine Zellzahl.
7. Nach Zentrifugation, Aspirieren Medien ohne verdrängen die Zelle Pellet. Aufschwemmen der Zelle Pellet in einer Konzentration von 1,25 x 10 ⁵ Zellen/mL.
8. Fügen Sie 5 mL sterilem Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf den Boden einer 10 cm Petrischale Erhalt eine hydratisierte Umgebung während des Wachstums der Sphäroid.
9. Drehen Sie den Deckel der Petrischale. Fügen Sie mehrere 20 μL Tropfen der Zellsuspension auf der inneren Oberfläche des Deckels Petrischale.
10. Schnell den Deckel wieder umkehren und legen Sie sie wieder auf den Boden der Schale, ohne dabei die hängenden Tropfen zu verdrängen. Abbildung 1 zeigt erfolgreich gebildete hängenden Tropfen.
11. Vorsichtig legen Sie die Schale in einem 37 ° C Inkubator und lassen Sphäroide wachsen in einer hängenden Tropfen Kultur für einen Zeitraum von 72 h.

3. 6. Tag: Einbettung Sphäroide in 3D Matrix

1. führen Sie die folgenden in eine Kultur-Haube, Kontamination der Proben zu verhindern.
2. Für die Bildung der ersten Schicht Fibrin, erstellen eine Gerinnsel Lösung ausreichend Volumen hinzufügen 100 μL Gerinnsel Lösung pro Bohrloch für so viele Brunnen wie erforderlich (1 Sphäroid pro Well). Klumpen bestehen aus 10 % 10 X HEPES Puffer nach Volumen (250 mM HEPES, 1500 mM NaCl, 50 mM CaCl ₂, pH 7,4), 2 mg/mL menschlichen Fibrinogen und 0,1 U/mL menschliches alpha Thrombin. Der Rest des Bandes Gerinnsel besteht aus hochreinem Wasser.
   1. Add Thrombin zuletzt und schnell hinzufügen Lösung zur gewünschten Brunnen in einem 48-Well-Platte um Klumpen zu vermeiden dadurch vor dem Brunnen hinzugefügt wird.
3. Sanft schütteln/Tap-well-Platte um sicherzustellen, dass Fibrin Gerinnsel Mischung auch die gesamte Beschichtung ist, und platzieren Sie well-Platte in den Inkubator für 1 h Gerinnsel Unterschicht zu polymerisieren zu ermöglichen. Schütteln Sie well-Platte hart genug, um Blasenbildung zu induzieren nicht; einfach Felsplatte als nötig, bis die Gesamtheit des Brunnens beschichtet ist. Wenn größere Gerinnsel Mengen verwendet werden, kann dieser Schritt nicht notwendig sein.
4. Sphäroide auf die Fibrin-Schicht übertragen.
   1. Entfernen der Brunnen Platte und die Petrischale mit Sphäroide in den hängenden Tropfen Kultur aus dem Inkubator und Sphäroide unter dem Mikroskop zu untersuchen. Legen Sie die Schale in der Kultur-Motorhaube.
   2. Invertieren vorsichtig den Deckel von der Petrischale für den Zugriff auf die hängenden Tropfen Kulturen.
   3. Mit einer Nadel 21 G eine 1 mL Spritze sorgfältig übertragen ein Tropfen aus dem umgekehrten Deckel in der Mitte des jeweils gut kümmert sich nicht um die Beschichtung der Unterseite des Brunnens polymerisierten Fibrin-Schicht zu durchbohren. Um den Tropfen effektiv zu übertragen, ziehen Sie die Tropfen in die Nadel. Ziehen den Kolben zurück, sobald der gesamte Rückgang in der Nadel ist zu stoppen; die Tropfen zu weit zurückziehen kann einführen Luftblasen, die effektive Sphäroid Transfer oder nachfolgenden Bildgebung stören können.
   4. Untersuchen die well-Platte unter dem Mikroskop um sicherzustellen, dass Sphäroide ordnungsgemäß in allen gewünschten Vertiefungen übertragen haben.
5. Für die Bildung der zweiten Schicht von Fibrin, erstellen eine andere Gerinnsel Lösung verwenden die gleiche Vorbereitung wie oben für die Erstellung der ersten Fibrin-Schicht (Schritt 3.2). Sorgfältig pipette 100 μL auf jedem Sphäroid-haltigen Tropfen und untersucht unter dem Mikroskop wieder, um sicherzustellen, dass die Sphäroide sind noch intakt und nicht an den Rändern der Brunnen gerückt.
6. Rückkehr der well-Platte in den Inkubator und die zweite Schicht für 1 h polymerisieren zu ermöglichen

4. 6. Tag: Zugabe von Pro-wandernde oder hemmende Faktoren

1. Warm HDFn Medien auf 37 ° c
2. Führen Sie die folgenden Schritte in eine Haube um Kontaminationen zu vermeiden.
3. Bereiten Sie Medien für jede Gruppe, einschließlich der entsprechende Konzentrationen von Pro/anti-migratory Agenten zu evaluierenden.
4. Entfernen der well-Platte aus Inkubator und in eine Kultur Kapuze.
5. Hinzufügen 500 μL der Standardmedien in jede Vertiefung der Kontrollgruppe Sphäroid, 500 μL der hemmenden Medien in jede Vertiefung des Arbeitskreises Migration gehemmt Sphäroid und 500 μl Pro wandernden Medien in jede Vertiefung des Arbeitskreises Migration-enhanced Sphäroid.
6. Rückkehr der well-Platte in den Inkubator.
7. Änderung Medien alle 48 h.

5. 6-9 Tage: Evaluation of Cell Migration und Proliferation

1. Bild Sphäroide mit Hellfeld Mikroskopieren sofort nach Zugabe von Medien (0 h) und dann alle 24 h für 72 h Optional: zu jedem Zeitpunkt eine Z-Stapel-Bild nehmen, um festzustellen, ob Migration ist in Ebenen außerhalb des primären Fokus auftreten. Erfahrungsgemäß tritt dies nicht auf; Es ist jedoch nützlich, um sicherzustellen, dies ist der Fall bei jedem Versuch.
2. Einsatz ImageJ Zelle Auswuchs in jede Vertiefung durch Analyse Prozent Zuwachs im Bereich für jedes Sphäroid durch Rückverfolgung der Zellenrahmen für jedes Sphäroid an jedem Punkt Mal in Folge und mit bestimmen die " Maßnahme " Funktion, um die Fläche zu berechnen.

Ergebnisse

Sphäroid Kultur kann genutzt werden, um die Wirkung der pro und Anti-wandernde Agenten auf Fibroblasten Migration in-vitro-erfolgreich bewerten
3D Fibroblasten Sphäroide können gebildet werden, über hängende Tropfen Kultur über einen Zeitraum von 72 h (Abbildung 1). Im Anschluss an die Kulturdauer Sphäroide innerhalb der Gerinnsel-Matrix eingebettet sind und abgebildet mit Brightfield Mikroskopie (Abbildung 2

Diskussion

Dieses Protokoll ermöglicht die Prüfung der Zellwanderung in der Wundheilung ECMs über eine in-vitro- 3D Modell zugeordnet. Ein entscheidender Schritt für die ordnungsgemäße Durchführung des Verfahrens ist die richtige Entwicklung der Fibroblasten Sphäroide; Zellkonzentration während der Vorbereitung wurde optimiert, um eine Ausgangskonzentration von 2.500 Zellen/Tropfen, geben so dass Sphäroide zu bilden zuverlässig über eine Inkubationszeit von 72 h. Wenn eine unzureichende Anzahl von Zellen verwen...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine	VWR	VWRL0148-0500	DMEM already containing L-glutamine can also be used
100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic	VWR	10861-594	Dishes of any size can be used for hanging drop culture
Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested	Sigma-Aldrich	12306C-500ML
L-glutamine	Fisher Scientific	ICN1680149	Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine
Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Human Dermal Fibroblasts, neonatal	Thermo Fisher	C0045C	Can be replaced with other cell type of interest
21 G x 1 1/2' needle	BD	305167	22 G x 1 1/2 needles will also work
1 mL syringe	VWR	89174-491	Syringes of any volume can be used
Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells)	VWR	82051-004
Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted	Enzyme Research Laboratories	FIB 3	Can be replaced with matrix protein of interest
Human Alpha Thrombin	Enzyme Research Laboratories	HT 1002a	May not be necessary depending on matrix protein of interest
Equipment
BSL2 cell culture hood
Cell culture incubator
Inverted microscope with 10X objective
Centrifuge compatibile with 15 mL tubes