في فيفو القياس الكهربية للعصب الزندي الفئران مع اختبار استثارة محواري

Brandon M. Wild; Renée Morris; Mihai Moldovan; Christian Krarup; Arun V. Krishnan; Ria Arnold

doi:10.3791/56102

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

توفر تقنيات استثارة محواري أداة قوية لدراسة الفيزيولوجيا المرضية والتغيرات الفيزيائية الأحيائية التي تسبق الأحداث التنكسية لا رجعة فيه. هذه المخطوطة يوضح استخدام هذه التقنيات في العصب الزندي تخديره من الفئران.

Abstract

تمكن الكهربية التقييم الموضوعي لوظيفة الأعصاب الطرفية في فيفو. تدابير التوصيل العصبية التقليدية، مثل السعة والكمون اكتشاف فقدان إكسون المزمنة وديمييلينيشن، على التوالي. تقنيات استثارة محواري "بالعتبة التي تتبع" توسيع هذه التدابير بتوفير المعلومات المتعلقة بالنشاط قنوات أيون ومضخات والمبادلات التي تتصل بوظيفة الحادة وقد تسبق الأحداث التنكسية. على هذا النحو، قد يوفر استخدام استثارة محواري في نماذج حيوانية للاضطرابات العصبية مقياسا مفيداً في فيفو لتقييم التدخلات العلاجية الرواية. هنا يصف لنا إعداد تجريبية لتدابير متعددة لتقنيات السيارات استثارة محواري في الفئران العصب الزندي.

الحيوانات تخديره مع isoflurane ورصدها بعناية لضمان عمق ثابت وكاف من التخدير. يتم باستمرار رصد درجة حرارة الجسم ومعدل التنفس ومعدل ضربات القلب وتشبع الأكسجين في الدم. دراسات استثارة محواري تتم باستخدام التحفيز عن طريق الجلد على العصب الزندي وتسجيل من عضلات هيبوثينار مخلب فوريليمب. مع التنسيب الكهربائي الصحيح، يتم تسجيل إمكانية عمل العضلات مجمع واضحة أن الزيادات في السعة ومع تزايد كثافة التحفيز. ثم يستخدم برنامج الآلي لتقديم سلسلة من النبضات الكهربائية التي تولد تدابير محددة استثارة 5 في التسلسل التالي: تحفيز استجابة السلوك، اليكتروتونوس عتبة العتبة الحالية، قوة مدة وقت ثابت العلاقة ودورة الانتعاش.

البيانات المقدمة هنا الإشارة إلى أن هذه التدابير هي قابلة للتكرار، وإظهار التشابه بين اليسار واليمين الزندية الأعصاب عند تقييمها في نفس اليوم. حد من هذه التقنيات في هذا الإعداد هو تأثير الجرعة والوقت تحت التخدير. ينبغي الاضطلاع برصد وتسجيل هذه المتغيرات للنظر فيها في الوقت لتحليل دقيق.

Introduction

باستخدام تقنيات الكهربية أداة أساسية للتحقيق في فيفو في وظيفة الأعصاب الطرفية في الاضطرابات العصبية. طرق التوصيل العصبية التقليدية استخدام المحفزات سوبراماكسيمال لتسجيل السيارات إمكانات العمل السعة والكمون. ولذلك هذه التقنيات توفر معلومات مفيدة عن عدد إجراء الألياف وعلى سرعة التوصيل من الألياف أسرع. أداة تكميلية قيمة اختبار استثارة محواري. ويستخدم هذا الأسلوب أنماط التحفيز الكهربية متطورة لتقييم الخصائص الفيزيائية للأعصاب المحيطية، مثل نشاط قنوات أيون مضخات تعتمد على الطاقة وعمليات التبادل الأيوني وغشاء المحتملة غير مباشر ¹.

ويستخدم اختبار استثارة محواري عادة في الإعداد السريرية للتحقيق في العمليات الفيزيولوجية المرضية وآثار التدخلات العلاجية على مختلف الاضطرابات العصبية. الأهم من ذلك، تدابير استثارة محواري حساسة للتدخلات العلاجية التي تؤثر على وظيفة الأعصاب الطرفية مثل العلاج الغلوبولين المناعي الوريدي (IVIg)²، العلاج الكيماوي المانع (سي)³ وكالسينيورين ⁴-على الرغم من أن هذه الدراسات قدمت أفكاراً هامة، الدراسات السريرية غالباً ما يحول دون التحقيق في أوائل المرض السمات والخيارات العلاجية رواية⁵. ولذلك، استخدام هذه الأساليب في نماذج حيوانية من اضطرابات عصبية قد اكتسبت في الآونة الأخيرة الجر⁶^،⁷^،^،من⁸⁹. والواقع أن هذه الأساليب تتيح فرصة لفهم التغييرات استثارة العصب المحددة المرتبطة بهذه الاضطرابات، وبالتالي النهوض بالبحوث متعدية الجنسيات.

الإجراء الموضح هنا طريقة بسيطة وموثوق بها لتدابير استثارة محواري سجل على الأعصاب الزندية للفئران سليمة.

Protocol

تمتثل للعناية بالحيوان ولجنة الأخلاقيات في سيدني UNSW جميع الإجراءات التجريبية الموصوفة هنا وأجريت وفقا "الوطنية للصحة" ومجلس البحوث الطبية (NHMRC) من لوائح أستراليا للتجارب الحيوانية.

1-التجريبية إعداد

ملاحظة: استخدمت الفئران منذ فترة طويلة-إيفانز الأسبوع 12 من العمر، والنساء في هذا الإجراء.

تخدير الفئران في دائرة التعريفي لاستخدام إيسوفلوراني 4% و 1 لتر كل دقيقة س₂معدل التدفق. تأكيد التخدير كافية عن طريق اختبار لرد الفعل رايتينج وضمان عدم وجوده قبل إزالة الحيوان من قاعة التعريفي. علما أن مختلف عوامل مخدر آثار تفاضلية على استثارة العصب¹⁰.
أمن مكان آنف الحيوان في المرفق مخروط الآنف وتقديم جرعة صيانة isoflurane 2.5% ول 1 دقيقة س₂معدل التدفق.
تأكيد التخدير الكافي بالتحقق من انسحاب دواسة وردود الفعل القرنية معسر أصابع الحيوان ولمس بلطف العين.
ملاحظة: تطبيق مرهم البيطرية في العيون، لمنع جفاف بينما تحت التخدير، الموصى به ولكنه ليس أساسيا كما يستغرق الإجراء عادة 30 دقيقة للحيوان الواحد.
الحفاظ على درجة حرارة الجسم من الفئران في 37 درجة مئوية مع استخدام حصيرة تدفئة التغذية مرتدة التي تسيطر ومجس حرارة المستقيم. تعيين حصيرة تدفئة واستشعار درجة حرارة الجسم المتكاملة إلى 40 درجة مئوية، لمنع أي تلف الجلد الذي يحدث مع ارتفاع درجات الحرارة.
ملاحظة: من المستحسن لرصد وتسجيل التدابير الفسيولوجية (معدل ضربات القلب، وتشبع الأكسجين، ودرجة حرارة الجسم ومعدل التنفس) كل 10s باستخدام نظام رصد الفيزيولوجية الحيوانية. ينبغي أن تشمل إجراءات التسجيل الأمثل المحلية قياس درجة حرارة أطرافهم كما يمكن أن تكون درجة الحرارة المحيطية أكثر برودة مقارنة بدرجة الحرارة الأساسية¹¹ (الشكل 1).
ارتداء قفازات مطهر ودائما استخدام الصكوك التي قد تم تنظيف مع الإيثانول 70%، للحفاظ على بيئة خالية من مسببات المرض طوال فترة الإجراءات.

2-الكهربية إعداد

استخدام أقطاب الإبرة البلاتين للالكهربائي (EEG) مقاومة منخفضة لهذا الإجراء.
تحضير أقطاب إبرة التسجيل عن طريق إدراج مسرى إبرة تسجيل (الشكل 1؛ الأرجواني المشار إليها في) عن طريق العضلات هيبوثينار ومسرى الإشارة من خلال الجانب الظهرية للرقم 4 (الشكل 1؛ والمشار إليه في أورانج) لتسجيل مجمع العضلات إمكانات العمل (CMAPs).
مكان القطب الأرضي عن طريق الجلد على الجانب متفوقة من الساعد بين تنشيط وتسجيل كهربائي (الشكل 1؛ الأخضر المشار إليه في). العناية عند إدخال أقطاب كهربائية تفادي أنسجة العضلات.
تحضير أقطاب إبرة تحفيز عن طريق الجلد بإدراج الكاثود (الشكل 1؛ والمسمى باللون الأزرق) حوالي 4 مم القاصي المرفقي نفق عند الكوع. إدراج اﻷنود (الشكل 1؛ الأحمر المسمى في) 1 سم تقريبا بروكسيمالي عن طريق جلد منطقة أكسيلار.

figure-protocol-2863
رقم 1: رسم تخطيطي للمواضع القطب إبرة في فوريليمب الفئران. الكاثود (الأزرق) يتم إدراج القاصي إلى النفق المرفقي عند الكوع حوالي 4 مم ويتم إدراج اﻷنود (أحمر) حوالي 1 سم بروكسيمالي عن طريق جلد منطقة أكسيللار. يتم إدراج مسرى إبرة الأرض (الأخضر) من خلال الجلد على جوانب الساعد بين تنشيط وتسجيل أقطاب متفوقة. تسجيل (أرجواني) والمرجعية (برتقالي) إبرة كهربائية يتم إدراجها عن طريق العضلات هيبوثينار والجانب الظهرية الرقم^ال 4. يتم وضع مسبار درجة الحرارة (رمادي) على جانب العضلات الرانفه متفوقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

3-محواري استثارة الإجراءات

أداء الأعصاب الحركية القوارض بروتوكول تروندنف باستخدام شبه الآلي، الكمبيوتر التي تسيطر عليها استثارة محواري البرنامج (انظر الجدول للمواد) ترتبط مشجعا الحالي مستمر ومكبر للصوت. إزالة الضوضاء الكهربائية 50 هرتز الزائدة باستخدام مزيل ضوضاء تردد 50/60 هرتز.
1. تسجيل CMAP من العضلات هيبوثينار في نفس الوقت تصور مورفولوجية CMAP وتطبيق 1 نبضة مربعة-موجه للعصب الزندي مع مسرى إبرة الكاثود.
  1. لتحقيق الأمثل التسجيلات، وضبط زاوية و/أو موقف الكاثود بعناية حتى منحنى استجابة ثنائية الطور أمثل مع السعة المستمر تحقيق (الشكل 2A.). حالما يتم تحديد الوضع الأمثل، استقرار الكاثود مع حامل ريبوسيتيونابل كهربائي.
    ملاحظة: البرامج المستخدمة تلقائياً يسلم المحفزات الاختبار، المبينة أدناه، ويزيد أو يقلل الحالية اللازمة لبلوغ العتبة.
2. تسجيل منحنى استجابة لحوافز بزيادة كثافة التحفيز 1 دفعة ms 1 mA حتى يتم تحقيق استجابة الحد أقصى.
  ملاحظة: الخط الأرجواني والأخضر في الشكل 2 (ب) و 2 (ج) يمثل الزيادة التدريجية من شدة التحفيز والنظام الآلي على التوالي. يتم تعيين السعة المستهدفة لعتبة تتبع تلقائياً إلى 40 في المائة السعة القصوى المقابلة لمنطقة المنحدر أشد على منحنى الاستجابة للحوافز. التغيير في 'عتبة' (أي الحوافز المطلوبة للحصول على 40% CMAP) الناجمة عن مختلف المحفزات الاختبار هو المتغير للحصول عليها طوال ما تبقى البروتوكول.
3. تسجيل المعلمات استثارة محواري متعددة، بما في ذلك عتبة اليكتروتونوس (TE)، العتبة الحالية (أنا/V) العلاقة واستعادة دورة (اتفاقية روتردام) كما هو موضح في مرجع¹².
  ملاحظة: البرنامج استثارة محواري التي تسيطر عليها الكمبيوتر يقيم العتبة (TE) مع مرض التصلب العصبي المتعدد 100 سوبثريشولد ديبولاريزينج وهايبربولاريزينج التيارات التي تم تعيينها في ±20% و ±40% من عتبة التحكم الحالية. تغيير عتبة بعد التيارات سواء ديبولاريزينج أو هايبربولاريزينج يتم تسجيلها تلقائياً في 14 من النقاط الزمنية خلال 100 مللي الاستقطاب الحالي و 12 نقطة بعد الاستقطاب الحالي. اليكتروتونوس عتبة غير مباشر ويقيم كوندوكتانسيس internodal وهو علامة على غشاء المحتملة. الأول/هو تقييم العلاقة الخامس مع التيارات تكييف سوبثريشولد 200 مرض التصلب العصبي المتعدد أن البديل في كثافة من + 50%-100% من عتبة التحكم في تزايدات 10 في المائة. I/يختلف عن العلاقة الخامس للشركة المصرية للاتصالات حيث أن التيارات أطول في المدة، ويتم تغيير كثافة الاستقطاب تدريجيا من + 50%-100% وتغيير عتبة وتقدر على كثافة كل 1 مللي ثانية بعد الاستقطاب الحالي لم يعد. I/العلاقة الخامس يقدم نظرة ثاقبة تصحيح خصائص إكسون¹. يتم تقييم اتفاقية روتردام مع نموذج نبض المزدوجة، حيث يتم تطبيق حافز تكييف سوبراماكسيمال أولى تليها سلسلة من المحفزات الاختبار في فترات زمنية محددة من 2.5 مللي ثانية إلى 200 السيدة اختبارات هذه المعلمة سلسلة محددة من الأحداث التي تحدث العقدي المنطقة من محور عصبي بعد التحفيز سوبراماكسيمال. وتشمل هذه الأحداث، المنظمة قنوات Na⁺ عن طريق بوابة الجهد الذي يجعل من الصعب أكثر للحصول على رد لاحقة وهو الكمية التي ريفراكتورينيس و الفترة صهر النسبي ¹. هذا هو متبوعة تقاضي internode وفترة من زيادة استثارة توسط قنوات البوتاسيوم سريع، كمياً سوبيريكسسيتابيليتي. وأخيراً، التوسط ببطء تفعيل قنوات البوتاسيوم أواخر فترة استثارة مخفضة، كمياً سوبيكسسيتابيليتي.

figure-protocol-6813
رقم 2: البيانات الخام من استثارة محواري test. الفريق A يوضح منحنى استجابة CMAP أبيفاسيك بعد الزيادة التدريجية للتحفيز للعصب الزندي. لوحات B و C تمثل الحافز كثافة (mA) والسعة من CMAP (mV)، على التوالي. المكون الأخضر ب وج يصور انخفاض كثافة التحفيز تزايدي الآلي وانخفاض CMAP المطلوبة لعتبة تتبع شكل سينية المرتبطة بها.

4-نشر الإجراءات الكهربية

نقل الفئران في قفص منفصل حتى قد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية. لا تترك حيوان غير المراقب وفي الشركة من الحيوانات الأخرى حتى أنه تعافي تماما من التخدير. بمجرد الفئران تعافي تماما من التخدير، نقل العودة إلى قفصة الأصلي.
عند الانتهاء من هذه الدراسة، euthanize الفئران دون ألم للحيوان وفتاكة مثل حقن داخل المسكنة التي يصفها الطبيب (مثلاً ليثابارب).

النتائج

وتم الحصول على تدابير الكهربية للعصب الزندي الفئران مع هذا البروتوكول. يوضح الشكل 3 ممثل تسجيل من العصب الزندي الأيسر من الفئران "إيفانز طويلة" الإناث 12 أسبوع من العمر. إمكانات العمل مجمع العضلات تتصل بعدد الألياف التي يتم تنشيطها في الوقت نفسه إجراء. رد ذ?...

Discussion

يوضح الإجراء وصف بسيطة وموثوق بها، تقنية مينيملي التي يسمح تقييم الخصائص الفيزيائية-الحيوية وإمكانات غشاء إكسون في فترة قصيرة من الزمن. مقارنة مع تقنيات أكثر الغازية الأخرى، التي تتطلب التعرض للعصب، يستحث الأسلوب الحالي لاختبار استثارة محواري تلف الأنسجة الحد الأدنى مما يمكن في فيفو

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

وأيد المشروع مؤسسة Lundbeck، مؤسسة نوفو نورديسك، المجلس الدانمركي للبحوث الطبية، لودفيج ومؤسسة السس سارة، كاي مؤسسة داهلبومس ومؤسسة البحوث في علم الأعصاب وجايتي. R.A معتمد من قبل "أوائل الوظيفي شواغر الزمالة الوطنية للصحة" و "مجلس البحوث الأسترالي الطبية" (#1091006)

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
QTracS Program	Digitimer Ltd.		Axonal excitability program
AM-Systems 2200, Analog Stimulus Isolator, 2200V/50Hz	SDR Scientific	850005	Stimulator
High Performance AC Amplifier Model LP511	Grass Technologies		Amplifier
Humbug 50/60Hz Noise eliminator	Quest Scientific Instruments	726310	Noise eliminator
Low Impedance Platinum Monopolar Subdermal Needle Electrodes	Grass Technologies	F-E2-24	Recording electrodes, 10 mm length, 30 gauge
Low Impedance Platinum Electroencephalography Needle Electrodes	Cephalon	9013L0702	Stimulating electrodes, 10 mm length, 30 gauge
Multifunction I/O Device Model USB-6341	National Instruments		Multifunction input/output device
Iron Base Plate IP	Narishige Scientific Instrument Laboratory		Used for holding stimulating needle electrode in place
Rotating X-block X-4	Narishige Scientific Instrument Laboratory		Used for holding stimulating needle electrode in place
Magnetic Stand GJ-8	Narishige Scientific Instrument Laboratory		Used for holding stimulating needle electrode in place
Micromanipulator M-3333	Narishige Scientific Instrument Laboratory		Used for holding stimulating needle electrode in place

References

Krishnan, A. V., Lin, C. S. -. Y., Park, S. B., Kiernan, M. C. Axonal ion channels from bench to bedside: a translational neuroscience perspective. Prog neurobiol. 89 (3), 288-313 (2009).
Lin, C. S. -. Y., Krishnan, A. V., Park, S. B., Kiernan, M. C. Modulatory effects on axonal function after intravenous immunoglobulin therapy in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Arch neurol. 68 (7), 862-869 (2011).
Park, S. B., Goldstein, D., Lin, C. S. -. Y., Krishnan, A. V., Friedlander, M. L., Kiernan, M. C. Acute abnormalities of sensory nerve function associated with oxaliplatin-induced neurotoxicity. J. Clin. Oncol. 27 (8), 1243-1249 (2009).
Arnold, R., Pussell, B. A., Pianta, T. J., Lin, C. S. -. Y., Kiernan, M. C., Krishnan, A. V. Association between calcineurin inhibitor treatment and peripheral nerve dysfunction in renal transplant recipients. Am. J. Transplant. 13 (9), 2426-2432 (2013).
Boërio, D., Greensmith, L., Bostock, H. Excitability properties of motor axons in the maturing mouse. J. Peripher. Nerv. Syst. 14 (1), 45-53 (2009).
Boërio, D., Kalmar, B., Greensmith, L., Bostock, H. Excitability properties of mouse motor axons in the mutant SOD1(G93A) model of amyotrophic lateral sclerosis. Muscle & Nerve. 41 (6), 774-784 (2010).
Alvarez, S., Calin, A., Graffmo, K. S., Moldovan, M., Krarup, C. Peripheral motor axons of SOD1(G127X) mutant mice are susceptible to activity-dependent degeneration. Neurosci. 241, 239-249 (2013).
Fledrich, R., et al. Soluble neuregulin-1 modulates disease pathogenesis in rodent models of Charcot-Marie-Tooth disease 1A. Nat. Med. 20 (9), 1055-1061 (2014).
Vianello, S., et al. Low doses of arginine butyrate derivatives improve dystrophic phenotype and restore membrane integrity in DMD models. FASEB J. 28 (6), 2603-2619 (2014).
Osaki, Y., et al. Effects of anesthetic agents on in vivo axonal HCN current in normal mice. Clin Neurophysiol. 126 (10), 2033-2039 (2015).
Biessels, G. J., et al. Phenotyping animal models of diabetic neuropathy: a consensus statement of the diabetic neuropathy study group of the EASD (Neurodiab). J. Peripher. Nerv. Syst. 19 (2), 77-87 (2014).
Boërio, D., Greensmith, L., Bostock, H. A model of mouse motor nerve excitability and the effects of polarizing currents. J. Peripher. Nerv. Syst. 16 (4), 322-333 (2011).
Arnold, R., Moldovan, M., Rosberg, M. R., Krishnan, A. V., Morris, R., Krarup, C. Nerve excitability in the rat forelimb: a technique to improve translational utility. J. Neurosci. Methods. 275, 19-24 (2017).
Moldovan, M., Alvarez, S., Krarup, C. Motor axon excitability during Wallerian degeneration. Brain. 132 (Pt 2), 511-523 (2009).
Madison, R. D., Robinson, G. A., Krarup, C., Moldovan, M., Li, Q., Wilson, W. A. In vitro electrophoresis and in vivo electrophysiology of peripheral nerve using DC field stimulation. J. Neurosci. Methods. 225, 90-96 (2014).
Moldovan, M., Krarup, C. Evaluation of Na+/K+ pump function following repetitive activity in mouse peripheral nerve. J. Neurosci. Methods. 155 (2), 161-171 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

132

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: