JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف لنا تقنية للجمع بين التدفق الخلوي وتسلسل الإنتاجية العالية لتحديد مناطق تكرار التأخر الجينوم.

Abstract

وقد وضعت العديد من التقنيات لمتابعة التقدم المحرز في تكرار الحمض النووي من خلال المرحلة S من دورة الخلية. وتم توجيه معظم هذه التقنيات نحو توضيح مكان وتوقيت بدء ازدواج الجينوم بدلاً من إتمامها. ومع ذلك، من المهم أن نفهم مناطق الجينوم التي آخر لإكمال النسخ المتماثل، نظراً لأن هذه المناطق تعاني من مستويات مرتفعة من الكسر الصبغية والطفرات، وأنها كانت مرتبطة بالمرض والشيخوخة. هنا يصف لنا كيف قدمنا تقنية التي استخدمت لرصد بدء النسخ المتماثل بدلاً من ذلك تحديد تلك المناطق للجينوم آخر لإكمال النسخ المتماثل. ويستند هذا النهج مزيجاً من التدفق الخلوي وتسلسل إنتاجية عالية. على الرغم من أن هذا التقرير يركز على تطبيق هذه التقنية على الخميرة، يمكن استخدام هذا النهج مع أي الخلايا التي يمكن تخزينها في سيتوميتير تدفق وفقا لمحتوى الحمض النووي.

Introduction

يتم بدء النسخ المتماثل للجينوم حقيقية النواة في عدة مواقع منفصلة، تسمى أصول النسخ المتماثل للنسخ المتماثل التي تنطلق شوك في كلا الاتجاهين (استعرض في فركوس et al.، 20151). أصول تختلف في التوقيت والكفاءة لإطلاق النار على حد سواء، وقد وضعت العديد من التقنيات مراقبة نشاط المنشأ النسخ المتماثل وتوضيح أسباب هذا الاختلاف. النشاط الفردي إلى أصول يمكن أن يستدل من مستويات واحدة-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي2، الذي يشكل حول أصول نشطة، أو باستخدام هلام 2D التفريد لمراقبة النسخ المتماثل محددة وسيطة3، اللتين يمكن اكتشافه مع المسابر المشعة. كل من هذه التقنيات تطبق بسهولة أكبر في S. cerevisiae مما في خلايا الثدييات، لأن أصول محدودة لمتواليات محددة معروفة في السابق. ومع ظهور [ميكروارس]، أصبح من الممكن لتقييم الأصل يطلقون النار على الصعيد العالمي. وكان ذلك أولاً بوسم الحمض النووي مع النظائر الثقيلة وإطلاق الخلايا من كتلة G1 في النظائر الخفيفة التي تحتوي على المتوسط ثم رصد تشكيل الهجين الخفيفة الثقيلة الحمض النووي عبر الجينوم4. إدخال تسلسل إنتاجية عالية سمح مماثلة على نطاق الجينوم رصد نشاط المنشأ دون اشتراط وسم النظائر باهظة الثمن. تم فرز الخلايا في سيتوميتير تدفق وفقا لمحتوى الحمض النووي وعينات من الحمض النووي تخضع لتسلسل عميق. لأن التغطية تسلسل عائدات من س 1 إلى 2 x خلال المرحلة S، يمكن تقييم توقيت تكرار نسبي بمقارنة قراءة أعماق الخلايا في مرحلة ثانية إلى تلك الموجودة في G1 أو G25،6. وأدت هذه التقنيات، خاصة تطبق على الخميرة، إلى فهم أعمق لكيفية تنظيم تسلسل الحمض النووي وهيكل الكروماتين، والبروتينات النسخ المتماثل الحمض النووي توقيت المنشأ والكفاءة.

المؤمنين انتقال المعلومات الوراثية من خلال انتشار الهاتف الخلوي يتطلب ليس فقط نجاح بدء تكرار الحمض النووي، الذي يقام في أصول، ولكن أيضا إتمام النسخ المتماثل, الذي يحدث حيث يجتمع شوك النسخ المتماثل بنجاح. مثل بدء النسخ المتماثل، يختلف توقيت الانتهاء من النسخ المتماثل عبر الجينوم مع بعض المناطق المتبقية unreplicated حتى وقت متأخر في دورة الخلية. هذه المناطق قد تكون خاصة بعيدة عن أصول النسخ المتماثل النشط أو قد تحتوي على تسلسلات أو هياكل الكروماتين التي تعوق بولمرس الحمض النووي. تأخر النسخ المتماثل المناطق يمكن أن تعبر عن نفسها كالمواقع الهشة، والتي ترتبط بمعدلات الطفرة والكسر الصبغية، وقد تورط في السرطان وشيخوخة7،،من89. ومع ذلك، على الرغم من أهمية الإنجاز السليم لتكرار الحمض النووي في صون الاستقرار الجينوم، فهمنا لاين وكيف يحدث ذلك تخلفت لبدء النسخ المتماثل. وبينما الجينات الفردية النسخ المتماثل المتأخرة التي تم إقرانها مع المرض وقد درست مع، على سبيل المثال، قبكر10، الدراسات العالمية التي تستهدف توضيح المواقع والأسباب في وقت متأخر قد تفتقر إلى النسخ المتماثل. هنا يصف لنا تقنية نشير إليه بوصفه "seq G2" التي نجمع بين التدفق الخلوي مع تسلسل الإنتاجية العالية لتسليط الضوء على إكمال النسخ المتماثل الجينوم في الخميرة11. مع بعض التغييرات الطفيفة، يمكن أن تتكيف مع هذا البروتوكول أي الخلايا التي يمكن فرز التدفق وفقا لمحتوى الحمض النووي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1-إعداد الخلايا للتدفق الخلوي الفرز

  1. تطعيم 15 مل أنابيب الاختبار التي تحتوي على 8 مل من كل من مرق ييبد أن الثقافات تصل كثافة 5 × 106 إلى 1.5 × 107 خلايا كل مل بعد النمو بين عشية وضحاها (انظر مناقشة الملاحظة 1).
  2. تدور أسفل خلايا الخميرة (1,400 س ز، في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجة مئوية) في أنبوب الطرد مركزي ملولبة 15 مل لمدة 5 دقائق، ريسوسبيند الخلايا في الإيثانول 70% 1.5 مل، ونقل إلى 1.6 مل [ميكروفوج] أنابيب، ترك هذا الجلوس ح 1 في درجة حرارة الغرفة أو على الأقل 3 ح على الجليد ( ويمكن تخزين إلى أجل غير مسمى في 4 درجات مئوية) (انظر المناقشة نقطة (2)).
  3. تدور أسفل خلايا الخميرة في [ميكروفوج] (14,000 س ز، 4 درجة مئوية) لمدة 1 دقيقة، ريسوسبيند في 1 مل سترات الصوديوم 50 مم، الرقم الهيدروجيني 7.2، تدور إلى أسفل (س 14,000 ز، 4 درجة مئوية) لمدة 1 دقيقة، نضح المادة طافية، ريسوسبيند في 1 مل سترات الصوديوم 50 مم، الرقم الهيدروجيني 7.2 ، التي تحتوي على 0.25 مغ/مل الحل رناسي ح 1 عند 50 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حمام الحرارة كتلة أو المياه.
  4. إضافة 50 ميليلتر بروتيناز ك حل (20 ملغ/مل حراكه في 10 ملم تريس pH 7.5، كاكل 2 مم2، الوزن 50% لحجم والغليسيرول) واحتضانها ح 1 في 50 درجة مئوية.
  5. تدور أسفل الخلايا (14,000 س ز، 4 درجة مئوية)، ريسوسبيند الخلايا في 1 مل سترات الصوديوم 50 مم، الرقم الهيدروجيني 7.2، تدور إلى أسفل (14,000 س ز، 4 درجة مئوية)، ونضح المادة طافية مع الفراغ، ريسوسبيند في 1 مل 1 ميكرومتر الحمض النووي الأخضر سلالة حراكه في سترات الصوديوم 50 مم ، الرقم الهيدروجيني 7.2 واحتضان في الظلام ح 1 في درجة حرارة الغرفة، sonicate 2 x 2 s كل (إنتاج الطاقة 2 واط).

2-الخلية الفرز

  1. استخدام أرز خلية، فرز الخلايا وفقا لمحتوى الحمض النووي في المراحل G1 و S، "G2 المبكر" و "أواخر G2"، جمع الخلايا فرداني مالا يقل عن 1.6 مليون من كل مرحلة من مراحل دورة الخلية كما هو الحال في الشكل 1 (انظر مناقشة نقطة (3)).
  2. نقل الخلايا إلى [ميكروفوج] أنابيب وتدور أسفل الخلايا لمدة 20 دقيقة في ز س 14,000 في 4 درجات مئوية في [ميكروفوج] ونضح المادة طافية مع فراغ (يمكن تخزين بيليه المجمدة في-20 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى؛ وانظر المناقشة في النقطة (4)).

3. استخراج الحمض النووي وإعداد ترتيب المكتبات

ملاحظة: الخطوات التالية تستند إلى "البروتوكول الأول" في استخراج "الحمض النووي الخميرة" كيت (انظر الجدول للمواد).

  1. إضافة ميليلتر 120 "المخزن المؤقت الهضم," المخزن مؤقت ملكية مما يتيح الخميرة الإنزيم الحال هضم جدار الخلية، و 5 ميليلتر من الخميرة الإنزيم الحال وريسوسبيند فورتيكسينج، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 40-60 دقيقة.
  2. إضافة ميليلتر 120 "تحلل المخزن المؤقت," المخزن مؤقت ملكية التي تحتوي على مواد التنظيف، ودوامه الثابت ل s 10-20.
  3. إضافة 250 ميليلتر كلوروفورم--مزيج دقيق لمدة 1 دقيقة.
  4. تدور بأقصى سرعة ممكنة في [ميكروفوج] لمدة 2 دقيقة.
  5. تحميل المادة طافية على عمود ربط الحمض النووي وأجهزة الطرد المركزي بأقصى سرعة ممكنة في [ميكروفوج] مدة 1 دقيقة.
  6. إضافة 300 ميليلتر "الحمض النووي الغسيل المخزن المؤقت," المخزن مؤقت ملكية التي تحتوي على الإيثانول، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة بأقصى سرعة ممكنة في [ميكروفوج]. تجاهل التدفق من خلال إضافة 300 ميليلتر من "المخزن المؤقت ليغسل الحمض النووي" وكرر عملية الغسيل.
  7. نقل العمود تدور أنبوب [ميكروفوج] جديدة وإضافة 60 ميليلتر من الماء (ليست الشركة المصرية للاتصالات)--الانتظار 1-3 دقيقة وثم الطرد المركزي لمدة 10 ق الوت الحمض النووي.
  8. قياس تركيز بإضافة 5 ميليلتر من الحمض النووي إلى 195 ميكروليتر من دسدنا حساسية عالية الكاشف الذي تم المخفف 1: 200 في المخزن المؤقت لحساسية عالية دسدنا ومن ثم تدبير الأسفار في فلوروميتير، باستخدام 10 ميليلتر من المعايير التي تم توفيرها للمعايرة؛ نتوقع بين 10 و 50 نانوغرام من الحمض النووي العائد الإجمالي.
  9. Sonicate (ذروة الحادث قوة 450، وعامل واجب 30 ٪، دورات الواحدة 200 انفجر، العلاج وقت 60 ثانية، 6 منسوب المياه) تفكك الحمض النووي إلى 250-350 شركة بريتيش بتروليوم شظايا.
  10. إعداد مكتبة باستخدام مجموعة إعداد عينة من الحمض النووي وتسلسل (bp 50 على الأقل 10 مليون واحد في نهاية القراءة) أنه على أداة تسلسل الحمض النووي في الوضع السريع (انظر مذكرة للمناقشة (5)).

4-تحليل تسلسل البيانات وتوليد للنسخ المتماثل بملفات التعريف

  1. محاذاة متواليات الجينوم sacCer3 Saccharomyces cerevisiae باستخدام جسناب12 (انظر مذكرة للمناقشة (6)).
  2. تحديد زوج كل قاعدة قراءة الأعماق باستخدام برنامج "جينوميكوفيراجيبيد" بيدتولس13.
  3. إزالة أرتيفاكتوال من طفرات في أعماق القراءة، إذا كانت موجودة (انظر مذكرة للمناقشة (7)).
  4. قراءة سلسة أعماق كروموسوم استخدام المتوسطات في 20 كيلو بايت انزلاق النافذة باستخدام الدالة "رنمين" في البحث والتطوير حزمة "كاتولس" (انظر مذكرة للمناقشة (8)).
  5. قراءة المؤامرة الأعماق في المرحلة وأوائل G2 G2 أواخر S كنسبة مئوية من أعماق قراءة منسوخة تماما (انظر مذكرة للمناقشة (9)).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

وقد استخدمنا الإجراء الموضح أعلاه لتحديد المواقع تكرار التأخر في مهدها الخميرة. اختبار هذا النهج باستخدام منطقة تكرار تأخر معروفة على كروموسوم اصطناعي أثبتت هذه التقنية أن تكون دقيقة وموثوق بها. لدينا أيضا أظهرت النتائج الأهمية البيولوجية لإكمال النسخ المتماثل في الوق...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في حين أن هذا الأسلوب قوية ومستقيمة نسبيا، ينبغي إيلاء اهتمام خاص لما يلي:

(1) نوصي بأن الثقافات تنمو على الأقل 12 ح قبل أن تصل إلى مرحلة سجل، نظراً لاختلافات واضحة في توزيع دورة الخلية إذا الثقافات يتم حصادها بعد بعد أن بلغت ح الكثافة المطلوب 4 فقط بعد التطعيم. لدينا الافتراض ه?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

بتأييد هذا العمل بمنحه GM117446 المعاهد الوطنية للصحة أن أتال بيهاري

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
YeaStar Genomic DNA kitGenesee Scientific11-323
1 µM SYTOX GreenThermoFisher57020resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2
50 mM sodium citrate, pH 7.2
RNase solution (0.25 mg / mL)SigmaR65130.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20°
proteinase K solution (20 mg / mL)ThermoFisher / Invitrogen25530-015resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C
Model 50 Sonic DismembratorFisher ScientificFB50A220
BD Biosciences FACSAria IIBD Biosciences644832
Zymo-spin III columnsZymo ResearchC1005
Qubit dsDNA HS Assay KitThermoFisherQ32851
Qubit 3.0 FluorometerThermoFisherQ33216
Covaris Model LE220 Focused-UltrasonicatorCovaris500219
Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep KitIllumina15026486
Illumina HiSeq 2500 instrumentIlluminaSY–401–2501
gsnap alignment softwareopen source software / Genentechhttp://research-pub.gene.com/gmap

References

  1. Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. DNA replication origin activation in space and time. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).
  2. Santocanale, C., Diffley, J. F. A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication. Nature. 395, 615-618 (1998).
  3. Brewer, B. J., Fangman, W. L. A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes. Cell. 55, 637-643 (1988).
  4. Raghuraman, M. K., et al. Replication dynamics of the yeast genome. Science. 294, 115-121 (2001).
  5. Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity. Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).
  6. Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program. Genome Res. 20, 781-790 (2010).
  7. Lang, G. I., Murray, A. W. Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing. Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).
  8. Durkin, S. G., Glover, T. W. Chromosome fragile sites. Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).
  9. Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer. Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).
  10. Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. Very late DNA replication in the human cell cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).
  11. Foss, E. J., et al. SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).
  12. Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality. Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).
  13. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
  14. Langmead, B. Aligning short sequencing reads with Bowtie. Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 11, Unit 11 17(2010).
  15. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
  16. Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 428, 617-624 (2004).
  17. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133 Saccharomyces cerevisiae

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved