G2-seq: 一种基于高通量测序技术的基因组晚期复制区域识别方法

摘要

我们描述了一种将流式细胞术和高通量测序相结合的技术来识别基因组的晚期复制区域。

摘要

许多技术已经开发, 以跟踪 DNA 复制的进展, 通过 S 阶段的细胞周期。这些技术大多用于阐明基因组复制的地点和时间, 而不是完成。然而, 至关重要的是, 我们了解基因组中最后一个完成复制的区域, 因为这些区域的染色体断裂和突变水平较高, 并与疾病和衰老有关。在这里, 我们描述了我们如何扩展了一个技术, 已经被用来监测复制启动, 而不是确定这些区域的基因组最后完成复制。这种方法是基于流式细胞术和高通量测序相结合的。虽然本报告着重于酵母的应用, 该方法可以与任何细胞, 可以排序在流式仪根据 DNA 的内容。

引言

真核基因组复制是在多个离散站点上启动的, 称为复制的起源, 复制分叉在两个方向上进行 (在 Fragkos et、2015¹中进行了复查)。起源在他们的时间和射击的效率不同, 并且开发了几个技术监测复制起源活动并且阐明这变化的起因。个体起源的活动可以从单链 DNA²的水平推断出来, 它形成在活跃起源附近, 或者通过使用2D 凝胶电泳监测特定的复制中间体³, 两者都可以检测到放射性探针。这两种技术在酵母中比在哺乳动物细胞中更容易应用, 因为起源仅限于前者的特定已知序列。随着微阵列的出现, 可以评估全球发射的起源。这首先是通过标记 DNA 与重同位素, 将细胞从 G1 块释放到含有轻同位素的介质中, 然后在基因组⁴中监测重光杂交 dna 的形成。高通量测序的引入允许类似的全基因组监测源活动, 而不需要昂贵的同位素标记。根据 dna 含量及其 dna 进行深度测序, 对细胞进行排列。由于序列覆盖率从1x 到2x 在 s 阶段过程中进行, 因此可以通过比较 s 阶段中单元格的读深度与 G1 或 G2^5、6中的内容来评估相对复制计时。这些技术, 特别是适用于酵母, 导致了更深的理解如何 dna 序列, 染色质结构, 和 dna 复制蛋白调节起源时间和效率。

在细胞增殖过程中, 基因信息的忠实传递不仅需要成功地启动 DNA 复制, 这在起源上发生, 而且复制的成功完成是复制叉相遇的地方。与开始复制一样, 复制完成的时间在整个基因组中都不同, 某些区域甚至在细胞周期的晚期仍未复制。这些区域可能特别远离主动复制的起源, 也可能含有阻碍 DNA 聚合酶的序列或染色质结构。晚期复制区域可以表现为脆弱的站点, 这与染色体断裂和更高的突变率有关, 并且已经牵连到癌症和老化的^7,8,9。然而, 尽管正确完成 DNA 复制在维持基因组稳定性方面的重要性, 但我们对其发生地点和方式的理解远远落后于复制启动。虽然研究了晚期复制与疾病有关的个别基因, 例如, qPCR¹⁰, 但目前还缺乏旨在阐明晚期复制的地点和根本原因的全球研究。在这里, 我们描述了一种技术, 我们称之为 "G2 序列", 我们结合流式细胞术与高通量测序, 以揭示完成的基因组复制在酵母¹¹。随着小的变化, 这个协议可以适应任何细胞, 可以根据 DNA 的内容流排序。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

1. 流式细胞仪分选细胞的制备

1. 接种15毫升试管, 每 YEPD 汤8毫升, 这样, 在隔夜生长后, 每毫升的培养量达到 5 x 10⁶到 1.5 x 10⁷细胞的密度 (见讨论说明 1)。
2. 向下旋转酵母细胞 (1400 x g, 在室温或4°c) 在15毫升螺丝帽离心机管为5分钟, 并用重悬细胞在1.5 毫升70% 乙醇, 并且转移到1.6 毫升离心管, 让这个坐 1 h 在室温或至少 3 h 在冰 (可以无限期地存储在4摄氏度) (参见讨论点 (2))。
3. 在离心的酵母细胞 (1.4万 x g, 4 °c) 为1分钟, 并用重悬在1毫升50毫米柠檬酸钠, pH 7.2, 旋转下来 (1.4万 x g, 4 °c) 为1分钟, 吸出上清, 并用重悬在1毫升50毫米柠檬酸钠, pH 7。2, 含有0.25 毫克/毫升 RNAse 溶液, 1 小时在50摄氏度或隔夜在37°c 在热块或水浴。
4. 添加50µL 蛋白酶 K 溶液 (20 毫克/毫升悬浮10毫米三 pH 7.5, 2 毫米 CaCl₂, 50% 重到容量甘油) 和孵育 1 h 在50°c。
5. 自旋下细胞 (1.4万 x g, 4 °c), 并用重悬细胞在1毫升50毫米柠檬酸钠, pH 值 7.2, 旋转下来 (1.4万 x g, 4 °c), 吸出上清与真空, 并用重悬在1毫升1µM 绿色核酸菌株悬浮在50毫米枸橼酸钠, pH 值 7.2, 在黑暗中孵育1小时室温, 油脂实验 2x, 每2秒 (输出功率2瓦)。

2. 细胞分类

1. 使用细胞分拣器, 根据 DNA 含量将细胞分类为 G1、S、"早期 G2" 和 "晚期 G2", 从每个细胞周期阶段收集至少160万个单倍体细胞, 如图 1 (参见讨论点 (3))。
2. 将细胞转移到离心管, 在 1.4万 x g 离心4摄氏度时, 将细胞旋转20分钟, 并吸进上清, 真空 (颗粒可无限期贮存在-20 °c 处; 参见讨论点 (4))。

3. DNA 提取和测序库的编制

注: 以下步骤是基于 "协议 I" 在酵母基因组 DNA 提取套件 (见材料表)。

1. 添加120µL 的 "消化缓冲", 一个专有的缓冲, 允许酵母溶解酶消化细胞壁, 5 µL 酵母裂解酶, 并用重悬涡流, 孵化37°c 40-60 分钟。
2. 添加120µL 的 "裂解缓冲", 一个专有的缓冲, 其中包含洗涤剂, 和漩涡硬的10二十年代。
3. 添加250µL 氯仿-混合彻底1分钟。
4. 在离心中以最大速度旋转2分钟。
5. 将上清液载入 DNA 结合柱上, 离心机以最大速度在离心1分钟。
6. 添加300µL "DNA 洗涤缓冲器", 一个专有的缓冲, 其中含有乙醇, 和离心机1分钟的最大速度在一个离心。丢弃流量, 添加300µL 的 DNA 洗涤缓冲液, 重复洗涤过程。
7. 将旋转柱转移到新鲜的离心管, 添加60µL (不 TE)-等待 1-3 分钟, 然后离心机十年代洗脱的 DNA。
8. 测量浓度通过添加5µL 的 DNA 到195µL 的 dsDNA 高灵敏度试剂已稀释 1:200 dsDNA 高灵敏度缓冲, 然后测量荧光荧光计, 使用10µL 的提供标准校准;预计10和50的 DNA 总产量。
9. 油脂实验 (峰值事件功率 450, 值班系数 30%, 周期每突发 200, 治疗时间六十年代, 水位 6), 以打破 DNA 成 250-350 bp 碎片。
10. 使用 dna 样本准备套件和序列 (至少 1000万 50 bp 单端读取) 在快速模式下的 dna 测序仪上准备一个库 (参见讨论说明 (5))。

4. 对序列数据的分析和复制配置文件的生成

1. 使用 Gsnap¹²将序列与酿酒酵母sacCer3 基因组对齐 (请参阅讨论说明 (6))。
2. 使用 Bedtools "genomeCoverageBed" 软件¹³确定每基对读取深度。
3. 删除读深度中的 artefactual 峰值 (如果存在) (请参见讨论说明 (7))。
4. 用中线在 20 kb 滑动窗口中使用 "runMean" 函数在 R 包 "caTools" 中, 通过染色体平滑读取深度 (参见讨论说明 (8))。
5. 将 S 阶段、早期 G2 和后期 G2 的读取深度绘制为完全复制的读取深度的百分比 (请参见讨论说明 (9))。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

我们已经使用上面描述的程序来识别在萌芽的酵母中晚期复制的地点。使用已知的晚期复制区域对人工染色体进行测试, 证明该方法准确可靠。我们的结果还表明, 及时完成复制的生物学重要性表明, 7 号染色体上的一个晚期复制区域在我们的 G2-seq 结果的基础上被识别为晚复制, 大约损失了三倍, 比可比较的控制区域¹¹更频繁。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

虽然这项技术是稳健和相对直接的, 但应特别注意以下方面:

(1) 我们建议, 在达到对数阶段之前, 培养至少12小时, 因为在接种后达到所需密度仅为4小时时, 细胞周期分布的差异明显。我们的假设是, 一个已经达到相对稳定的平衡的细胞周期分布比分布在一个饱和的文化最近转移到新鲜的媒介, 更好地代表一个 "真正的" 日志阶段分布。

(2) 通过将100% 乙醇直接?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
YeaStar Genomic DNA kit	Genesee Scientific	11-323
1 µM SYTOX Green	ThermoFisher	57020	resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2
50 mM sodium citrate, pH 7.2
RNase solution (0.25 mg / mL)	Sigma	R6513	0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20°
proteinase K solution (20 mg / mL)	ThermoFisher / Invitrogen	25530-015	resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C
Model 50 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB50A220
BD Biosciences FACSAria II	BD Biosciences	644832
Zymo-spin III columns	Zymo Research	C1005
Qubit dsDNA HS Assay Kit	ThermoFisher	Q32851
Qubit 3.0 Fluorometer	ThermoFisher	Q33216
Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator	Covaris	500219
Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit	Illumina	15026486
Illumina HiSeq 2500 instrument	Illumina	SY–401–2501
gsnap alignment software	open source software / Genentech		http://research-pub.gene.com/gmap