JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы опишем технику для объединения проточной цитометрии и высокая пропускная способность последовательности для определения конца репликации областей генома.

Аннотация

Были разработаны многочисленные методы следить за ходом репликации ДНК через S-фазе клеточного цикла. Большинство из этих методов были направлены на выяснение местоположения и времени начала генома дублирования, вместо того, чтобы его завершения. Однако важно, что мы понимаем областей генома, которые последний для завершения репликации, потому что эти регионы страдают повышенные уровни хромосомных обрыва и мутации, и они были связаны с болезнью и старения. Здесь мы описываем, как мы расширили технику, которая была использована для мониторинга инициации репликации вместо определить те регионы генома последний для полной репликации. Этот подход основан на комбинации проточной цитометрии и высокая пропускная способность последовательности. Хотя настоящий доклад сосредоточен на применение этого метода для дрожжей, этот подход может использоваться с любой клетки, которые могут быть отсортированы в проточный цитометр согласно содержание ДНК.

Введение

Эукариотический геном репликация инициируется в нескольких дискретных сайтов, называется происхождение репликации, от которых репликации вилки действовать в обоих направлениях (обзор в Fragkos et al., 2015-1). Истоки различаются в их сроках и эффективности стрельбы, и были разработаны несколько методы для отслеживания репликации происхождения деятельности и выяснения причин этого изменения. Деятельность отдельных происхождение может быть выведено из уровней одноцепочечной ДНК2, какие формы вокруг активной происхождение, или с помощью электрофореза геля 2D для мониторинга репликации конкретных промежуточных3, оба из которых могут быть обнаружены с радиоактивные датчики. Оба эти методы применяются более легко в S. cerevisiae чем в mammalian клетках, потому что происхождение ограничены конкретным известных последовательностей в бывшем. С появлением microarrays стало возможным оценить происхождения, выпустив глобально. Впервые это было сделано путем маркировки ДНК с тяжелых изотопов, выпуская клетки из блока G1 в средних содержащих легкие изотопы и затем мониторинг формирования тяжелых свет гибридной ДНК через генома4. Введение высокой производительности виртуализации позволило аналогичные генома широкий мониторинг активности происхождения без требования дорогих изотопный маркировки. Клетки были отсортированы в проточный цитометр согласно содержание ДНК и их подвергается глубокой секвенирования ДНК. Потому что охват последовательности продолжается от 1 x до 2 x в течение фазы S, сроки относительной репликации можно оценить путем сравнения чтения глубины клеток в S фазе для тех, кто в G1 или G25,6. Эти методы, особенно применяется для дрожжей, привело к более глубокому пониманию как последовательность ДНК, Структура хроматина и белки репликации ДНК регулировать происхождения сроках и эффективности.

Верным передачи генетической информации в ходе пролиферации требует не только успешно инициации репликации ДНК, который проходит на происхождение, но и успешного завершения репликации, которое происходит, где встречаются репликации вилки. Как начала репликации сроки завершения репликации варьируется генома с некоторых регионов, остальные нереплицированные даже поздно в клеточный цикл. Такие регионы могут быть особенно отдаленные от истоков активной репликации или могут содержать последовательностей или структур хроматина, которые препятствуют полимераз. Поздно репликации регионы могут проявить себя как хрупкие сайтов, которые связаны с хромосомной поломки и более высокие скорости мутации и были причастны к раку и старению7,8,9. Однако несмотря на важность надлежащего завершения репликации ДНК в поддержание стабильности генома, наше понимание того, где и каким образом это происходит значительно отстает в инициации репликации. И хотя отдельные гены, чьи конце репликации был связан с болезнью были изучены с, например, ПЦР10, глобальные исследования, направленные на изучение места и основные причины позднего репликации хватает. Здесь мы опишем технику, которую мы ссылаемся как «G2 seq», в котором мы комбинируем проточной цитометрии с высокой пропускной способностью последовательности пролить свет на завершении репликации генома в дрожжи11. С незначительными изменениями этот протокол может быть адаптирована к любой клетки, которые могут быть потока сортировано согласно содержание ДНК.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка клеток для потока цитометрии сортировки

  1. Прививать 15 мл пробирки, содержащие 8 мл бульона, YEPD, таким образом, что культуры достичь плотности тарелок 5 x 10-6 до 1,5 x 10-7 клеток / мл после ночи роста (см. Примечание 1 обсуждения).
  2. Спин вниз дрожжевых клеток (1400 x g, при комнатной температуре или 4 ° C) в колпачок пластиковых пробирок 15мл за 5 мин, Ресуспензируйте клетки в 1,5 мл 70% этанол и передачи 1.6 mL отцентрифугировать трубки, давая это сидеть в течение 1 ч при комнатной температуре или по крайней мере 3 h на льду ( можно бесконечно храниться при температуре 4 ° C) (см. обсуждение пункта (2)).
  3. Спин вниз дрожжевых клеток в отцентрифугировать (14.000 x g, 4 ° C) 1 мин, Ресуспензируйте в 1 мл 50 мм цитрат натрия, рН 7,2, спин вниз (14.000 x g, 4 ° C) в течение 1 мин, аспирационная супернатант Ресуспензируйте в 1 мл 50 мм цитрат натрия, рН 7,2 , содержащий 0,25 мг/мл РНКазы решение за 1 час при температуре 50 ° C, или на ночь при 37 ° C в блок или водой ванне тепла.
  4. Добавьте 50 мкл протеиназы K решение (высокомобильна в 10 мм трис рН 7,5, 2 мм CaCl2, 50% веса для тома глицерина 20 мг/мл) и инкубировать 1 час при температуре 50 ° C.
  5. Спин вниз клетки (14.000 x g, 4 ° C), Ресуспензируйте клеток в 1 мл 50 мм цитрат натрия, рН 7,2, спина вниз (14.000 x g, 4 ° C), аспирационная супернатант с вакуумом, Ресуспензируйте в 1 мл 1 мкм зеленый нуклеиновой кислоты штамм высокомобильна в цитрат натрия 50 мм , pH 7.2 и инкубировать в темноте за 1 ч при комнатной температуре, sonicate 2 x 2 s каждый (Выходная мощность 2 Вт).

2. ячейку Сортировка

  1. Используя ячейки сортировщик, Сортировка ячеек в зависимости от содержания ДНК в фазы G1, S, «раннего G2» и «конце G2», собирая по крайней мере 1,6 миллиона haploid клетки от каждой фазы клеточного цикла, как показано на рисунке 1 (см. обсуждение пункта (3)).
  2. Передавать трубы отцентрифугировать клетки и спина вниз клетки для 20 минут, 14.000 x g при 4 ° C в отцентрифугировать и аспирационная супернатант с вакуумом (гранулы могут храниться бессрочно заморожены при-20 ° C; см. обсуждение пункта (4)).

3. ДНК добыча и подготовка секвенирования библиотек

Примечание: Следующие шаги основаны на «протокол I» в добыче дрожжи геномной ДНК Kit (см. Таблицу материалы).

  1. Мкл 120 «Пищеварение буфера, «несвободных буфер, который позволяет литических ферментов дрожжей дайджест клеточной стенки и 5 мкл литические фермента дрожжей, Ресуспензируйте vortexing и инкубировать при 37 ° C 40-60 мин.
  2. 120 мкл «Буфера Lysis, «несвободных буфер, содержащий моющего средства и вихрь трудно для 10-20 s.
  3. Добавить 250 мкл хлороформ - тщательно перемешать за 1 мин.
  4. Спина на максимальной скорости в отцентрифугировать на 2 мин.
  5. Загрузите супернатант на ДНК привязки столбцов и центрифуги на максимальной скорости в отцентрифугировать за 1 мин.
  6. Добавьте 300 мкл «ДНК мытья буфера, «несвободных буфер, который содержит этанол и центрифуги за 1 мин на максимальной скорости в отцентрифугировать. Отменить через поток, 300 мкл буфера мытья ДНК и повторить процесс стирки.
  7. Передать трубку свежие отцентрифугировать столбце спин, 60 мкл воды (не TE) - ждать 1-3 мин и затем центрифуги для 10 s элюировать ДНК.
  8. Измерять концентрацию, добавив 5 мкл ДНК 195 мкл Реагента dsDNA высокая чувствительность, которая была разбавленных 1: 200 dsDNA высокая чувствительность буфера, а затем измерения флуоресценции в флуориметр, используя 10 мкл комплект стандартов для калибровки; ожидаете между 10 и 50 нг ДНК всего урожая.
  9. Sonicate (пик инцидента мощность 450, коэффициент 30%, циклов за взрыв 200, лечение время 60 s, уровня воды 6) разорвать на 250-350 bp фрагменты ДНК.
  10. Подготовьте библиотеку с помощью ДНК образца подготовка комплекта и последовательности его (по крайней мере 10 миллионов 50 bp один конец прочтений) на инструменте секвенирования ДНК в быстрый режим (см. Примечание обсуждение (5)).

4. Анализ последовательности данных и генерации репликации профилей

  1. Выравнивание последовательностей генома sacCer3 Saccharomyces cerevisiae , используя Gsnap12 (см. Примечание обсуждения (6)).
  2. Определите, что пара-база читать глубины с использованием программного обеспечения «genomeCoverageBed» Bedtools'13.
  3. Удаление артефакта шипы в глубинах чтения, если присутствует (см. Примечание обсуждения (7)).
  4. Гладкая прочитаны глубины хромосомы, использование медианы в 20 КБ, скользящее окно, с помощью функции «runMean» в R пакет «caTools» (см. Примечание обсуждения (8)).
  5. Участок читать глубины в S фазе, ранние G2 и конце G2 в процентном отношении глубин полностью реплицированных чтения (см. Примечание обсуждения (9)).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Мы использовали процедуру, описанную выше для определения конца репликации сайтов в многообещающий дрожжей. Опробовать этот подход с использованием известных конце репликации региона на искусственных хромосом доказали технику для точной и надежной. Наши результаты...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Хотя этот метод является надежной и довольно прямо вперед, особое внимание следует обратить на следующее:

(1) мы рекомендуем, что культур расти по крайней мере 12 часов прежде чем они достигнут этапа журнала, поскольку различия проявляются в клеточный цикл распределения, е?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана гранта NIH GM117446 а.б.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
YeaStar Genomic DNA kitGenesee Scientific11-323
1 µM SYTOX GreenThermoFisher57020resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2
50 mM sodium citrate, pH 7.2
RNase solution (0.25 mg / mL)SigmaR65130.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20°
proteinase K solution (20 mg / mL)ThermoFisher / Invitrogen25530-015resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C
Model 50 Sonic DismembratorFisher ScientificFB50A220
BD Biosciences FACSAria IIBD Biosciences644832
Zymo-spin III columnsZymo ResearchC1005
Qubit dsDNA HS Assay KitThermoFisherQ32851
Qubit 3.0 FluorometerThermoFisherQ33216
Covaris Model LE220 Focused-UltrasonicatorCovaris500219
Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep KitIllumina15026486
Illumina HiSeq 2500 instrumentIlluminaSY–401–2501
gsnap alignment softwareopen source software / Genentechhttp://research-pub.gene.com/gmap

Ссылки

  1. Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. DNA replication origin activation in space and time. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).
  2. Santocanale, C., Diffley, J. F. A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication. Nature. 395, 615-618 (1998).
  3. Brewer, B. J., Fangman, W. L. A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes. Cell. 55, 637-643 (1988).
  4. Raghuraman, M. K., et al. Replication dynamics of the yeast genome. Science. 294, 115-121 (2001).
  5. Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity. Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).
  6. Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program. Genome Res. 20, 781-790 (2010).
  7. Lang, G. I., Murray, A. W. Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing. Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).
  8. Durkin, S. G., Glover, T. W. Chromosome fragile sites. Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).
  9. Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer. Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).
  10. Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. Very late DNA replication in the human cell cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).
  11. Foss, E. J., et al. SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).
  12. Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality. Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).
  13. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
  14. Langmead, B. Aligning short sequencing reads with Bowtie. Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 11, Unit 11 17(2010).
  15. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
  16. Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 428, 617-624 (2004).
  17. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

133

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены