G2-Seq: Ein hoher Durchsatz Sequenzierung-basierten Methode zur Identifizierung von spät repliziert Regionen des Genoms

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Technik Durchflusszytometrie und Hochdurchsatz-Sequenzierung zu spätere replizierende Regionen des Genoms zu identifizieren, zu kombinieren.

Zusammenfassung

Zahlreiche Techniken wurden entwickelt, um den Fortschritt der DNA-Replikation durch die S-Phase des Zellzyklus folgen. Die meisten dieser Techniken sind in Richtung Aufklärung des Standortes und der Zeitpunkt der Einleitung des Genoms Vervielfältigung, anstatt seine Vollendung verwiesen worden. Es ist jedoch wichtig, dass wir Regionen des Genoms, die letzten Replikation abgeschlossen sind verstehen, weil diese Regionen erhöhten chromosomalen Bruch und Mutation leiden, und sie im Zusammenhang mit Krankheit und Alterung wurden. Hier beschreiben wir, wie wir eine Technik, die verwendet wurde, um die Replikation Einleitung um stattdessen diesen Regionen des Genoms letzte vollständige Replikation identifizieren überwachen ausgedehnt haben. Dieser Ansatz basiert auf einer Kombination der Durchflusszytometrie und Hochdurchsatz-Sequenzierung. Obwohl dieser Bericht konzentriert sich auf die Anwendung dieser Technik auf Hefe, kann der Ansatz mit beliebigen Zellen verwendet werden, die in einem Durchflusszytometer laut DNA-Gehalt sortiert werden können.

Einleitung

Eukaryotische Genom Replikation wird eingeleitet, an mehreren diskreten Standorten, genannt Ursprünge der Replikation, von welchen Replikation Gabeln in beide Richtungen (rezensiert in Fragkos Et Al., 2015¹) gehen. Ursprünge variieren in ihren Zeitplan und die Effizienz der Zündung und verschiedene Techniken wurden entwickelt, um Replikation Herkunft Aktivitäten überwachen und die Ursachen dieser Unterschiede zu erhellen. Die Aktivität der einzelnen Ursprünge kann aus einsträngiger DNA², welche Formulare rund um aktive Ursprung abgeleitet werden oder mithilfe von 2D Gelelektrophorese, um spezielle Replikations Zwischenprodukte³zu überwachen, können beide mit erkannt werden radioaktiven Sonden. Beide Techniken sind leichter in S. Cerevisiae als in Säugerzellen, angewendet, da Ursprünge auf bestimmten bekannten Sequenzen in der ehemaligen beschränkt sind. Mit dem Aufkommen von Microarrays wurde es möglich, die Herkunft weltweit brennen zu beurteilen. Dies geschah zunächst durch Kennzeichnung DNA mit schweren Isotopen, Freisetzung von Zellen aus einem G1 in mittlerer mit leichten Isotope und dann die Bildung von schwer-leicht-Hybrid DNA in das Genom⁴Überwachung. Die Einführung von Hochdurchsatz-Sequenzierung erlaubt ähnliche genomweite Überwachung der Herkunft Aktivität ohne das Erfordernis einer teuren Isotopen Kennzeichnung. Zellen wurden in einem Durchflusszytometer laut DNA-Gehalt und ihre DNA ausgesetzt Tiefe Sequenzierung sortiert. Da Sequenz Abdeckung von 1 X bis 2 X im Laufe der S-Phase verläuft, kann relative Replikation Timing durch Vergleich lesen Sie Tiefen der Zellen in der S-Phase, die in G1 oder G2^5,6bewertet werden. Diese Techniken, vor allem Hefe, führte zu einem tieferen Verständnis der wie DNA-Sequenz, Chromatinstruktur und DNA-Replikation Proteine Herkunft Timing und Effizienz regulieren.

Treue Übertragung der genetischen Information während der Zellproliferation erfordert nicht nur erfolgreiche Initiation der DNA-Replikation, die stattfindet am Ursprung, sondern auch erfolgreichen Abschluss der Replikation, die auftritt, wo Replikations-Gabeln treffen. Wie die Initiation der Replikation variiert der Zeitpunkt der Fertigstellung der Replikation des Genoms mit bestimmten Regionen bleiben bis spät in den Zellzyklus Langzeittransaktionen. Solche Regionen enthalten Sequenzen oder Chromatin Strukturen, die DNA-Polymerasen behindern oder möglicherweise besonders aktive Replikation Ursprünge fern. Spät repliziert Regionen kann als fragile Sites, manifestieren sich die chromosomalen Bruch und höhere Mutationsraten zugeordnet sind, und haben bei Krebs und Altern^7,8,9in Verbindung gebracht. Allerdings hat unser Verständnis von wo und wie dies geschieht trotz der Bedeutung der ordnungsgemäßen Abschluss der DNA-Replikation in der Instandhaltung der Genomstabilität weit hinter der Initiation der Replikation hinterher. Und während einzelner Gene, deren späte Replikation mit Krankheit assoziiert wurde, mit z. B. qPCR¹⁰, globale Studien zur Aufklärung der Standorte und die zugrunde liegenden Ursachen der letzten Replikation gefehlt untersucht worden. Hier beschreiben wir eine Technik, die wir uns beziehen, um als "G2 Seq" Wir Durchflusszytometrie mit Hochdurchsatz-Sequenzierung verbinden Aufschluss über die Vollendung des Genoms Replikation in Hefe-¹¹. Mit geringfügigen Änderungen kann dieses Protokoll auf alle Zellen angepasst werden, die Strömung nach DNA-Gehalt sortiert werden können.

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Protokoll

1. Vorbereitung der Zellen für Flow Cytometry sortieren

1. 15 mL Reagenzgläsern, 8 mL YEPD Brühe enthält, so dass die Kulturen eine Dichte von 5 x 10⁶ bis 1,5 x 10⁷ Zellen pro mL nach Übernachtung Wachstum erreichen zu impfen (siehe Diskussion Hinweis 1).
2. Spin-down Hefezellen (1.400 x g, bei Raumtemperatur oder 4 ° C) in eine Schraubkappe Zentrifugenröhrchen 15 mL für 5 min, Zellen in 1,5 mL 70 % igem Ethanol und Transfer nach einem 1,6 mL Microfuge Rohr, lassen diese Sit für 1 h bei Raumtemperatur oder mindestens 3 h auf Eis (Aufschwemmen können gespeichert werden auf unbestimmte Zeit bei 4 ° C) (siehe Diskussionspunkt (2)).
3. Spin-down Hefezellen in die Microfuge (14.000 x g, 4 ° C) für 1 min in 1 mL 50 mM Natriumcitrat, pH 7,2, Spin-down (14.000 x g, 4 ° C) für 1 min aufzuwirbeln, Aspirieren überstand, Aufschwemmen in 1 mL 50 mM Natriumcitrat, pH 7,2 , mit 0,25 mg/mL RNAse-Lösung für 1 h bei 50 ° C oder über Nacht bei 37 ° C in Hitze Block oder Wasserbad.
4. Fügen Sie 50 µL Proteinase K-Lösung (20 mg/mL Nukleinsäuretablette in 10 mM Tris pH 7.5, 2 mM CaCl₂, 50 % Gewicht, Volumen Glycerin) und 1 h bei 50 ° c inkubieren
5. Spin-down Zellen (14.000 x g, 4 ° C), Aufschwemmen Zellen in 1 mL 50 mM Natriumcitrat, pH 7,2, spin-down (14.000 x g, 4 ° C), überstand mit Vakuum anzusaugen, Aufschwemmen in 1 mL 1 µM grün Nukleinsäure-Stamm Nukleinsäuretablette in 50 mM Natriumcitrat , pH 7,2 und in der Dunkelheit für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren, beschallen 2 X für 2 s (Ausgangsleistung 2 Watt).

(2) Zellsortierung

1. Mit einer Zelle Sorter, sortieren Zellen nach DNA-Gehalt in Phasen G1, S, "frühen G2" und "späten G2", sammeln von mindestens 1,6 Millionen haploiden Zellen von jedem Zellzyklus-Phase wie in Abbildung 1 (siehe Diskussionspunkt (3)).
2. Zellen auf Microfuge Röhren übertragen und spin-down Zellen für 20 min bei 14.000 x g bei 4 ° C in der Microfuge und aspirieren überstand mit Vakuum (das Pellet kann bei-20 ° C eingefroren auf unbestimmte Zeit gespeichert werden, siehe Diskussion Punkt (4)).

3. DNA-Extraktion und die Vorbereitung der Sequenzierung Bibliotheken

Hinweis: Die folgenden Schritte basieren auf "Protokoll I" in der Hefe Genomic DNA Extraktion Kit (siehe Tabelle der Materialien).

1. Fügen Sie 120 µL "Verdauung Puffer," eine proprietäre Puffer, der Hefe lytische Enzyme verdauen die Zellwand und 5 µL Hefe lytische Enzym, Aufschwemmen durch aufschütteln und Inkubation bei 37 ° C für 40-60 min ermöglicht.
2. Fügen Sie 120 µL "Lysis Buffer," eine proprietäre Puffer, Waschmittel und hart für 10-20 s Wirbel enthält.
3. Fügen Sie 250 µL Chloroform - mischen für 1 min.
4. Mit Höchstgeschwindigkeit in einem Microfuge für 2 min drehen.
5. Laden Sie den Überstand auf der DNA-Bindung Spalte und Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit in eine Microfuge für 1 min.
6. Fügen Sie 300 µL "DNA waschen Puffer", ein proprietäres Puffer, Ethanol und Zentrifuge für 1 min bei maximaler Geschwindigkeit in eine Microfuge enthält. Verwerfen der Durchströmung, 300 µL Waschpuffer DNA hinzufügen und wiederholen Sie den Waschvorgang zu.
7. Die Spin-Spalte auf ein frisches Microfuge Rohr übertragen, fügen 60 µL Wasser (nicht TE) - 1-3 min warten und dann Zentrifugieren für 10 s, um die DNA zu eluieren.
8. Konzentration durch Zugabe von 5 µL DNA zu 195 µL DsDNA-hohe Empfindlichkeit-Reagenz, das verdünnt 1: 200 in DsDNA-hohe Empfindlichkeit-Puffer und dann Fluoreszenz-Maßnahme in einem Fluorometer, mit 10 µL der mitgelieferten Standards für die Kalibrierung wurde zu messen; zwischen 10 und 50 ng der DNA Gesamtausbeute erwarten.
9. Beschallen (Peak Vorfall macht 450, Einschaltdauer 30 % Zyklen pro Burst 200, Behandlung Zeit 60 s, Wasserstand 6) DNA in 250-350 bp Fragmente aufzubrechen.
10. Bereiten Sie eine Bibliothek mit DNA-Probe Vorbereitungssatz und es (mindestens 10 Millionen 50 bp Einend-gelesen) auf die DNA-Sequenzierung Instrument im Schnellmodus-Sequenz (vgl. Diskussion (5)).

4. Analyse der Daten und Erstellung von Replikation Sequenzierung Profile

1. Ausrichten von Saccharomyces Cerevisiae sacCer3 Genom mit Gsnap¹² -Sequenzen (siehe Diskussionspapier (6)).
2. Bestimmen Sie, dass pro Basenpaar tiefen mit Bedtools "GenomeCoverageBed" Software¹³lesen.
3. Artifizielle Spikes in Lesen Sie tiefen zu entfernen, falls vorhanden (siehe Diskussionspapier (7)).
4. Glatten Tiefen von Chromosom mit Mittelstreifen in eine 20 kb Schiebefenster mit "RunMean" Funktion in R Paket "CaTools" gelesen (siehe Diskussionspapier (8)).
5. Plot gelesen tiefen in S Phase Anfang G2 und späten G2 als prozentualer Anteil vollständig replizierten lesen Sie tiefen (siehe Diskussionspapier (9)).

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Ergebnisse

Wir haben wie oben beschrieben vor spät replizierenden Standorte in der angehenden Hefe verwendet. Tests dieser Ansatz mit einer bekannten späten replizierende Region auf ein künstliches Chromosom erwies sich die Technik präzise und zuverlässig sein. Unsere Ergebnisse haben auch gezeigt, die biologische Bedeutung der rechtzeitigen Abschluss der Replikation zeigen, dass eine spätere replizierende Region auf Chromosom 7, die wir identifiziert als späte Replikation auf der Grundlage u...

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Diskussion

Während diese Technik robust ist und relativ geradlinig, besondere Aufmerksamkeit werden, an folgende gewidmet sollte:

(1) Wir empfehlen, mindestens 12 h Kulturen wachsen, bevor sie Log-Phase erreichen, da Unterschiede im Zellzyklus Distributionen zu manifestieren, wenn Kulturen geerntet werden, nach dem Erreichen der gewünschten Dichte nur 4 h nach der Inokulation. Unsere Annahme ist, dass eine Zellzyklus-Distribution, die ein relativ stabiles Gleichgewicht erreicht hat besser als eine Vert...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
YeaStar Genomic DNA kit	Genesee Scientific	11-323
1 µM SYTOX Green	ThermoFisher	57020	resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2
50 mM sodium citrate, pH 7.2
RNase solution (0.25 mg / mL)	Sigma	R6513	0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20°
proteinase K solution (20 mg / mL)	ThermoFisher / Invitrogen	25530-015	resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C
Model 50 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB50A220
BD Biosciences FACSAria II	BD Biosciences	644832
Zymo-spin III columns	Zymo Research	C1005
Qubit dsDNA HS Assay Kit	ThermoFisher	Q32851
Qubit 3.0 Fluorometer	ThermoFisher	Q33216
Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator	Covaris	500219
Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit	Illumina	15026486
Illumina HiSeq 2500 instrument	Illumina	SY–401–2501
gsnap alignment software	open source software / Genentech		http://research-pub.gene.com/gmap