G2-seq: 높은 처리량 시퀀싱 기반 기술을 늦게 게놈의 복제 확인

요약

Cytometry 및 높은 처리량 연속 게놈 늦게 복제 영역을 식별 하는 기술을 설명 합니다.

초록

DNA 복제는 세포 주기의 S 단계의 진행에 따라 수많은 기술 개발 되었습니다. 이러한 기술의 대부분의 위치 및 게놈 중복 보다는 그것의 완료의 개시의 타이밍으로 지시 되어 있다. 그러나, 그것은 우리가이 지역 돌연변이, 염색체 파손의 높은 수준의 고통 때문에 마지막 복제를 완료 하는 게놈의 지구를 이해 하 고 그들은 질병과 노화와 연관 된 중요 한. 여기 우리는 어떻게 우리가 대신 마지막 완전 한 복제에 게놈의 그 영역을 식별에 복제 개시를 모니터링 하는 데 사용 된 기술 확장을 설명 합니다. 이 방법은 cytometry 및 높은 처리량 시퀀싱의 조합을 기반으로 합니다. 이 보고서에서는 효 모에이 기술 적용, 접근 교류 cytometer DNA 내용에 따라 정렬 될 수 있는 모든 세포와 함께 사용할 수 있습니다.

서문

진 핵 게놈 복제 복제, 복제에서 포크 (Fragkos 그 외 여러분, 2015¹에서 검토) 두 방향에서 진행의 기원 이라고 하는 여러 개별 사이트에서 시작 됩니다. 기원 그들의 타이밍 및 발사의 효율성에서 변화 하 고 몇 가지 기술을 복제 원점 활동을 모니터링 하 고이 변화의 원인 명료 하도록 개발 되었습니다. 개별 근원의 활동의 단일 가닥 DNA², 활성 기원, 주위는 양식 수준에서 추정 될 수 있다 또는 특정 복제 중간체³모니터를 2 차원 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 둘 다로 검출 될 수 있다 방사성 조사 합니다. 이러한 기술을 모두 기원 전에 특정 알려진된 시퀀스에 제한 때문에 더 쉽게 S. cerevisiae 보다 포유류 세포에 적용 됩니다. Microarrays의 도래와 함께 세계적으로 발사 하는 근원 평가 수 되었다. 이 하 여 무거운 동위 원소와 DNA 라벨, 셀 g 1 블록에서 중간 포함 가벼운 동위 원소에 다음 무거운-가벼운 하이브리드 DNA 게놈⁴에 걸쳐 형성 모니터링 처음 이루어졌다. 높은 처리량 시퀀싱의 소개 허용 비슷한 게놈 넓은 비싼 동위 원소 라벨의 요구 없이 원산지 활동의 모니터링. 세포는 DNA 내용에 따라 교류 cytometer 및 깊은 시퀀싱을 복종 하는 그들의 DNA에 정렬 했다. 시퀀스 범위 S 단계에 걸쳐 2 x 1 x에서 진행, 때문에 상대 복제 타이밍 G1 또는 g 2^5,6에 S 단계에 있는 세포의 읽기 깊이 비교 하 여 평가 될 수 있습니다. 특히 효 모에 적용 되는 이러한 기술을 어떻게 DNA 순서, chromatin 구조, 그리고 DNA 복제 단백질 근원 타이밍 및 효율성 규제에 대 한 깊은 이해로 이끌어 냈다.

세포질 확산 중 유전 정보의 충실 한 전송 기원에 이루어지는 DNA 복제의 성공 뿐만 아니라 개시 뿐만 아니라 발생 하는 복제 포크 만나는 복제 성공적으로 완료 해야 합니다. 복제의 개시, 같은 복제의 완료의 타이밍 남은 세포 주기에서 늦게도 복제 되지 않은 특정 지역으로 게놈에 걸쳐 다릅니다. 이러한 지역 특히 활성 복제 기원에서 멀리 떨어져 있을 수 있습니다 또는 시퀀스 또는 DNA polymerases를 방해 하는 염색 질 구조를 포함할 수 있습니다. 늦게 영역 복제 염색체 파손 및 높은 돌연변이 속도와 연결 하 고 암과 노화^7,,89에 연루 되어 연약한 사이트로 자신을 나타날 수 있습니다. 그러나, 게놈 안정성의 유지 보수에 DNA 복제의 적절 한 완료의 중요성에도 불구 하 고이 일어난 어디서 및 어떻게의 우리의 이해는 복제 개시의 뒤에 멀리 느껴 지. 그리고 개별 유전자의 늦은 복제 질병과 연관 되었습니다 동안 연구 함께, 예를 들어 정량¹⁰, 글로벌 연구 elucidating 위치 및 기본 복제는 부족의 원인에서 감독. 여기는 우리가 "G2 seq"는 우리가 결합 cytometry에 게놈 복제의 완료에 빛을 발산 하는 높은 처리량 시퀀싱으로 효 모¹¹을 참조 하는 기술에 설명 합니다. 사소한 변경,이 프로토콜 흐름 DNA 내용에 따라 정렬 될 수 있는 모든 셀에 적응 될 수 있다.

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프로토콜

1. 셀에 대 한 준비 흐름 Cytometry 정렬

1. 15 mL 문화 하룻밤 성장 후 1.5 mL 당 10⁷ 셀 x 5 x 10⁶ 의 밀도 도달 되도록 각 YEPD 국물의 8 mL를 포함 하는 시험관에 접종 (참조 토론 참고 1).
2. 효 모 세포 (1400 x g, 실 온 또는 4 ° C에서) 5 분에 대 한 15 mL 스크류 캡 원심 관에 다운 스핀, 1.5 mL 70% 에탄올, 실 온에서 1 h 또는 얼음 (에 적어도 3 h이이 앉아 시키는 1.6 mL microfuge 관에 전송 셀 resuspend 4 ° C에서 무기한 저장할 수) (토론 포인트 (2) 참조).
3. 1 분 동안 microfuge (14000 x g, 4 ° C)에서 효 모 세포를 스핀, 1 분 1 mL 50 m m 나트륨 구 연산 염, pH 7.2, 스핀 (14000 x g, 4 ° C) 아래에 resuspend, 상쾌한 발음, 1 mL 50 m m 나트륨 구 연산 염, pH 7.2에서 resuspend 0.25 mg/mL 1 시간 또는 밤새 껏 열 블록 또는 물 목욕에서 37 ° C에서 50 ° C에서 RNAse 솔루션 포함.
4. 50 µ L 성분을 K 솔루션 (20 mg/mL 10 mM Tris pH 7.5, 2mm CaCl₂, 볼륨 글리세롤을 50% 무게에에서 resuspended)를 추가 하 고 50 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어
5. 셀 (14000 x g, 4 ° C) 다운 스핀, 1 mL 50 m m 나트륨 구 연산 염, pH 7.2 셀 resuspend, 스핀 다운 (14000 x g, 4 ° C), 진공 상쾌한 발음, 1 mL 1 µ M 녹색 핵 산 피로 50 m m 나트륨 구 연산 염에 resuspended resuspend pH 7.2 및 실 온에서 1 h에 대 한 어둠 속에서 품 어, 2 x 2를 sonicate s 각 (출력 2 와트).

2. 셀 정렬

1. 그림 1 과 같이 각 세포 주기 단계에서 적어도 1.6 백만 단일 세포를 수집 단계로 G1, S, "초기 g 2는,"와 "늦은 g 2", DNA 내용에 따라 셀 정렬 셀 정렬을 사용 하 여 (토론 포인트 (3) 참조).
2. Microfuge 관으로 셀을 전송 하 고 14000 x g는 microfuge에서 4 ° C에 20 분에 대 한 셀 아래로 회전 진공 상쾌한 발음 (-20 ° C에서 무기한 동결 펠 릿을 저장할 수 있습니다; 토론 포인트 (4) 참조).

3. DNA 추출 및 라이브러리 시퀀싱의 준비

참고: 다음 단계는에 따라 "의정서 I" 효 모 게놈 DNA 추출 키트에에서 ( 재료의 표참조).

1. "소화 버퍼," 독점 수 있는 버퍼를 효 모 세포 벽, 그리고 효 모 용균성 효소의 5 µ L를 소화, vortexing에 의해 resuspend 및 40-60 분 동안 37 ° C에서 품 어 용균성 효소의 120 µ L를 추가 합니다.
2. "세포의 용 해 버퍼," 세제, 그리고 10-20 s 하드 소용돌이 포함 하는 독점 버퍼의 120 µ L를 추가 합니다.
3. 250 µ L 클로 프롬을 추가-믹스 철저 하 게 1 분.
4. 2 분 동안 microfuge에서 최대 속도로 회전 합니다.
5. DNA 바인딩 열과 1 분 대는 microfuge 최대 속도에서 분리기에 상쾌한 로드.
6. "DNA 세척 버퍼," 에탄올, 그리고는 microfuge 최대 속도에서 1 분 동안 원심 분리기를 포함 하는 독점 버퍼의 300 µ L를 추가 합니다. 흐름을 통해 삭제, DNA 워시 버퍼의 300 µ L을 추가 하 고 세척 과정을 반복.
7. 신선한 microfuge 관 스핀 열 전송, 물 (안 테)의 60 µ L-1-3 분을 기다릴 더하고 다음 10 원심 elute DNA를 s.
8. DNA의 5 µ L dsDNA 높은 감도 버퍼에 희석된 1: 200 그리고 교정;에 대 한 제공 된 표준의 10 µ L를 사용 하는 fluorometer에서 측정 형광 되었습니다 dsDNA 높은 감도 시 약의 195 µ L을 추가 하 여 농도 측정 DNA의 총 10, 50 ng 사이 기대 합니다.
9. Sonicate (피크 사건 전력 450, 듀티 계수 30%, 버스트 200, 치료 시간 60 s, 물 레벨 6 초당 사이클) 250-350 bp 파편으로 DNA 헤어.
10. DNA 샘플 준비 키트를 사용 하 여 라이브러리를 준비 하 고 빠른 모드에서 DNA 시퀀싱 장비에서 그것은 (적어도 10 백만 50 bp 일자형 읽기)을 시퀀싱 (토론 참고 (5) 참조).

4. 분석 데이터와 복제의 세대 시퀀싱의 프로필

1. Saccharomyces cerevisiae sacCer3 게놈 Gsnap¹² 를 사용 하 여 시퀀스를 정렬 (토론 참고 (6) 참조).
2. 자료 당 쌍 읽기 Bedtools' "genomeCoverageBed" 소프트웨어¹³를 사용 하 여 깊이 결정 합니다.
3. 있는 경우 읽기 깊이에서 artefactual 스파이크를 제거 (토론 참고 (7) 참조).
4. 부드럽게 읽을 깊이 염색체 R에서 "runMean" 기능을 사용 하 여 창 슬라이딩 20 kb에서 중앙값을 사용 하 여 패키지 "caTools" (토론 참고 (8) 참조).
5. 플롯 (토론 참고 (9) 참조) 완전히 복제 된 읽기 깊이의 S 단계, 초기 g 2는, 늦은 g 2에 있는 깊이 읽기.

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결과

싹 트는 효 모에 늦게 복제 사이트 식별 위에서 설명한 절차를 사용 했습니다. 테스트는 인공 염색체에 알려진된 늦은 복제 영역을 사용 하 여이 이렇게 정확 하 고 신뢰할 수 있는 기술을 입증 했다. 우리의 결과 또한 시연 복제의 적시 완료의 생물학 중요성 우리가 우리의 G2-seq 결과 근거 하 여 늦은 복제로 식별, 염색체 7에 늦게 복제 영역 손실 되었음을 표시 하 여 약 thr...

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토론

이 기술은 강력 하 고 비교적 똑 바른 동안 앞으로, 특정 주의 다음에 전념 한다.

(1) 문화 차이 매니페스트 세포 주기 배포판에 문화는 접종 후 원하는 밀도 그냥 4 h를 도달 하는 데 후 수확 하는 경우 이후 로그 단계를 도달 하기 전에 적어도 12 h에 대 한 성장 좋습니다. 우리의 가정은 세포 주기 분포는 비교적 안정 된 평형에 도달 했습니다 더 나타내는 "진짜" 로그 단계 배포?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
YeaStar Genomic DNA kit	Genesee Scientific	11-323
1 µM SYTOX Green	ThermoFisher	57020	resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2
50 mM sodium citrate, pH 7.2
RNase solution (0.25 mg / mL)	Sigma	R6513	0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20°
proteinase K solution (20 mg / mL)	ThermoFisher / Invitrogen	25530-015	resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C
Model 50 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB50A220
BD Biosciences FACSAria II	BD Biosciences	644832
Zymo-spin III columns	Zymo Research	C1005
Qubit dsDNA HS Assay Kit	ThermoFisher	Q32851
Qubit 3.0 Fluorometer	ThermoFisher	Q33216
Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator	Covaris	500219
Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit	Illumina	15026486
Illumina HiSeq 2500 instrument	Illumina	SY–401–2501
gsnap alignment software	open source software / Genentech		http://research-pub.gene.com/gmap