رسم خرائط الجينوم المنظومة الكروماتين موجوداً في الخلايا الليمفاوية تي البشرية الأولية التي أتاك-Seq

Summary

المقايسة "الكروماتين" ترانسبوساسي موجوداً إلى جانب التسلسل الفائق (أتاك-seq) أسلوب المجين على نطاق المنظومة لكشف الكروماتين موجوداً. هذا بروتوكول أتاك-seq خطوة بخطوة، من الجزيئية للتحليل الحسابي النهائي، الأمثل للخلايا البشرية الليمفاوية (Th1/Th2). يمكن اعتماد هذا البروتوكول من الباحثين دون خبرة سابقة في أساليب تسلسل الجيل القادم.

Abstract

المقايسة "الكروماتين" ترانسبوساسي موجوداً مع التسلسل الفائق (أتاك-seq) أسلوب يستخدم لتحديد مناطق الكروماتين (موجوداً) مفتوحة. وتمثل هذه المناطق التنظيمية عناصر الحمض النووي (مثلاً، المروجين، معززات، موضع مراقبة المناطق، عوازل) للنسخ التي ربط العوامل. رسم الخرائط في الساحة الكروماتين موجوداً نهج قوية للكشف عن العناصر التنظيمية النشطة عبر الجينوم. هذه المعلومات بمثابة نهج غير متحيز لاكتشاف شبكة عوامل النسخ ذات الصلة، والآليات لهيكل الكروماتين التي تنظم برامج التعبير الجيني. أتاك-seq بديل قوية وحساسة الدناز أنا تحليل حساسية مقترنة بالجيل التالي التسلسل (الدناز-seq) وساعدت فورمالدهايد عزل العناصر التنظيمية (فير-seq) لتحليل المجين على نطاق المنظومة من الكروماتين إمكانية الوصول، وتسلسل المواقع الحساسة نوكلاس ميكروكوككال (seq منسى) لتحديد المواقع نوكليوسومي. نقدم بروتوكول أتاك-seq مفصلة الأمثل للخلايا البشرية المناعية الأولية أي خلايا CD4 + الخلايا الليمفاوية (مساعد تي 1 (Th1) وخلايا Th2). هذا البروتوكول شامل يبدأ مع الخلية الحصاد، ثم يصف الإجراء الجزيئية من الكروماتين تاجمينتيشن، إعداد نموذج لتسلسل الجيل المقبل، ويشمل أيضا طرق واعتبارات للتحليلات الحسابية المستخدمة في تفسير النتائج. وعلاوة على ذلك، لتوفير الوقت والمال، قدمنا تدابير مراقبة الجودة لتقييم المكتبة seq أتاك قبل التسلسل. الأهم من ذلك، المبادئ الواردة في هذا البروتوكول تسمح التكيف مع خطوط الخلايا والخلايا الأولية محصنة وغير المتمتعين بالمناعة البشرية الأخرى. كما ستكون هذه المبادئ التوجيهية مفيدة للمختبرات التي لا يتقن مع أساليب تسلسل الجيل القادم.

Introduction

أتاك-seq^1،2 هو أسلوب قوي يتيح تحديد مناطق الكروماتين فتح التنظيمية³ ونوكليوسومي لتحديد المواقع. يتم تطبيق هذه المعلومات لاستنتاج موقع وهوية، والنشاط من عوامل النسخ. حساسية للأسلوب لقياس التغيرات الكمية في هيكل الكروماتين يتيح دراسة نشاط العوامل الكروماتين، بما في ذلك remodelers الكروماتين والمعدلات، فضلا عن النشاط الترانسكربتي من الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني¹. وبالتالي يوفر أتاك-seq نهج قوية وغير منحازة لفك رموز الآليات التي تحكم تنظيم النسخي في أي نوع من الخلايا للفائدة. يصف لنا تكييف أتاك-seq لخلايا Th1 و Th2 البشرية الأساسية.

أتاك-seq، تحميل مفرط Tn5 ترانسبوساسي مع محولات لتفتيت الحمض النووي الأزواج الجيل التالي التسلسل (خ ع) مع وضع علامات الحمض النووي مع محولات (أي، في عملية "تاجمينتيشن")¹. وبعد التضخيم بكر، مكتبات الحمض النووي الناجم عن ذلك مستعدون للجيل التالي التسلسل (الشكل 1). تم الكشف عن تاجمينتاتيون تفضيلية من الكروماتين موجوداً بتحليل التخصيب المحلية أتاك-seq ترتيب القراءة.

الإجراءات التجريبية قصيرة ومتطلب لمواد انطلاق أقل، مقارنة بالأساليب الأخرى لقياس إمكانية الوصول الكروماتين ونوكليوسومال لتحديد المواقع مثل seq الدناز⁴و فير-seq⁵seq منسى⁶، قد تشجيع استخدام seq أتاك في النظم البيولوجية متعددة بما في ذلك الخلايا البشرية الابتدائية^1،7 والعينات السريرية⁸، فضلا عن الكائنات الحية أحادي الخلية⁹،¹⁰من النباتات، ذباب الفاكهة¹¹ ، ومختلف الثدييات¹².

هوية النسخ يمكن كشف العوامل التي من المحتم أن المكاني موجوداً بتحليل في إثراء زخارف تسلسل الملزمة أو الجمع بين أتاك-seq الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة) تليها (تسلسل الحمض النووي الفائق تشيبسيق). تمكين هذا النهج تحديد عوامل النسخ الخاصة بنسب هامة هيماتوبويسيس في¹³من الماوس. تتيح طبيعة أتاك-seq غير متحيزة والعالمية دراسة تنظيم الجينات في الكائنات الحية التي لا تتوفر الكواشف مثل الأجسام المضادة لتحليل الرقائق. على سبيل المثال، الاختلافات التطورية في رابطة الدول المستقلة-وحددت المناطق التنظيمية بدراسة الخلايا الجمجمة العصبي كريست من البشر والشمبانزي¹⁴، التغيرات الإنمائية في العناصر التنظيمية خلال أوائل الماوس embryogenesis¹⁵، والتغيرات في المناظر الطبيعية التنظيمية خلال دورة الحياة من أحادي الخلية أووزارزاكي جيم-⁹، والتطور من المروجين ومحسنات عبر أنواع الثدييات 20¹².

وكان أتاك-seq مفيداً لقياس إمكانية الوصول الكروماتين في الخلايا المفردة، وبالتالي الكشف عن التغير داخل الخلية السكان، التي عادة ما يتهرب من الدراسات على نطاق الجينوم^7،16أيضا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام seq أتاك لدراسة التغيرات التي تحدث في المناطق التنظيمية الحمض النووي في ظروف المرض، التي عينات نادرة. على سبيل المثال، يمكن استخدام seq أتاك لدراسة التغيرات في المناظر الطبيعية التنظيمية أثناء ظهور سرطان الدم النقوي الحاد (AML)¹⁷ أو رأس-مدفوعة أونكوجينيسيس¹¹.

Protocol

جميع الإجراءات التي أقرها مجلس المراجعة المؤسساتية في جامعة بار ايلان والبروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية التي وضعتها اللجنة الموافقة على هذه التجارب-

1-تنقية من السذاجة CD4 + الخلايا البشرية والاستقطاب لخلايا Th2 ومساعد تي 1 (Th1)

ملاحظة: هنا يمكننا وصف الإجراء بدءاً من خلايا الدم الطرفية البشرية المجمدة وحيدات النوى (ببمكس). الخطوة الأولى تتكون من عزل خلايا CD4 + الخلايا باستخدام ميكروبيدس والأعمدة عادة ما تعطي لنا أكثر من 95% من خلايا CD4 +. ومع ذلك، قد تختلف هذه الخطوة وفقا للبروتوكول المفضل في كل مختبر. تعديل البروتوكول لتنشيط خلية تي والاستقطاب من جينر et al. (2009) ¹⁸-عزل خلايا CD4 + الخلايا من 10 مليون ببمكس يعطي ترتفع إلى 4 مليون خلايا CD4 +. وهي تنقسم إلى اثنين من قوارير ونمت تحت Th1 واستقطاب Th2 شروط الغلة خلايا Th1 و Th2 3 مليون في غضون أسبوع واحد فقط-

ملاحظة: يبرد الطرد المركزي إلى 4 درجة مئوية قبل البدء.

1. ذوبان الجليد 1 مل من ببمكس البشرية (10 ⁷ الخلايا) في أنبوب 50 مل تحتوي على 10 مل متوسطة ربمي تستكمل مع 1% البنسلين والستربتوميسين، مم 2 لتر-الجلوتامين وإبطال الحرارة 10% الجنين المصل البقري. الطرد المركزي في 500 غرام x للحد الأدنى 5 إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا مع ماصة معقمة 25 مل في 15 مل من تستكمل ربمي المتوسطة. نقل الخلايا (مع ماصة معقمة 25 مل) إلى قارورة ثقافة T75.
2. ترك الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنة هوميديفيد (37 درجة مئوية، 5% CO ₂)-
3. نقل الخلايا العائمة مع ماصة معقمة 25 مل أنبوب 50 مل. تحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء باستبعاد تريبان الأزرق-
4. + CD4 عزل الخلايا من 10 مليون يعيش غير-تمسكا ببمكس بالتحديد الإيجابي باستخدام خلايا CD4 + ميكروبيدس والأعمدة وفقا للشركة المصنعة ' s توصيات (انظر الجدول للمواد والمعدات) بما يلي التعديلات: 10 ⁷ ببمكس المسماة مع 30 ميليلتر من ميكروبيدس CD4 في 120 ميليلتر من جيش صرب البوسنة 0.5% في برنامج تلفزيوني.
5. تنشيط خلايا CD4 + T ح 72 برحيل-2 (10 نانوغرام/مل)، وربط لوحة مكافحة-CD3 (5 ميكروغرام/مل) وقابل للذوبان المضادة-CD28 (2 ميكروغرام/مل). للاستقطاب Th1، إضافة رهيل-12 (20 نانوغرام/مل) ومكافحة--إيل-4 (10 ميكروغرام/مل). إضافة لاستقطاب Th2، رهيل-4 (40 نانوغرام/مل) ومكافحة-IFN-γ (10 ميكروغرام/مل).
6. ثقافة الخلايا الإضافية 7 أيام حضور رحيل-2 (10 نانوغرام/مل) والسيتوكينات الاستقطاب نفسه (رحيل-12 ل Th1 ورحيل-4 ل Th2)-

2. عزل نواة

ملاحظة: أتاك-seq تتم مع نويات سليمة. (انظر الجدول للمواد والمعدات) معايرة تحلل العازلة التي تحتوي على 0.05% نونيلفينيل البولي إثيلين جليكول لعزل نواة من خلايا Th1 و Th2 البشرية الأساسية. ونحن نوصي معايرة هذه الخطوة مع والكواشف المختبرية والخلايا. وجود فائض خلايا سليمة من المنظفات الصناعية غير كافية يقلل من كفاءة نقل رد فعل. تتحدد كفاءة تحلل الخلية بعدد الأنوية (الخلايا إيجابية تريبان الأزرق) مقارنة بالعدد الإجمالي للخلايا.
ملاحظة: إعداد المخزن المؤقت تحلل (10 ملم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، 10 مم كلوريد الصوديوم، مجكل 3 مم ₂). يبرد الطرد مركزي مع دوار سوينغ-دلو إلى 4 درجة مئوية. التكوير خلايا الطرد مركزي سوينغ-دلو بدلاً من الطرد زاوية ثابتة يقلل من فقدان الخلية/نوى. لتجنب الأنوية أو فقدان الخلية، بيبيت بعناية عندما تجاهل المادة طافية.

1. إضافة جديدة نونيلفينيل البولي إيثيلين غليكول (إلى نهائي تركز 0.05%) و 100 × مثبطات البروتياز (إلى نهائي تركز 1 x) إلى المخزن المؤقت تحلل الباردة فورا قبل الاستخدام. الاحتفاظ المخزن المؤقت على مدت
2. T عدد الخلايا لتحديد كمية وصلاحية استخدام أسلوب تريبان الأزرق. صلاحية أقل من نتائج 90% في أعلى غير محدد الهضم.
3. نقل 0.5 × 10 ⁶ ر الخلايا (Th1 أو Th2) إلى 1.5 مل microtubes. تدور إلى أسفل في ز x 500 لمدة 5 دقائق في 4 ° C.
4. ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من البرد مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) حل. تدور إلى أسفل في ز x 500 لمدة 5 دقائق في 4 ° C.
5. ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من البرد تحلل المخزن المؤقت (الذي يحتوي على نونيلفينيل البولي إيثيلين غليكول ومثبطات البروتياز). الاحتفاظ بالانبوب على الجليد. ماصة برفق لتجنب عرقلة الأنوية.
6. بسرعة 10 ميليلتر وعد الخلايا مع عداد الآلي خلية حين microtube مع تفكيك الخلايا على الجليد. هذه الخطوة ينبغي أن لا تتجاوز خمس دقائق لتجنب إتلاف الأنوية. وينبغي أن يكون تفكيك 80 في المائة على الأقل من الخلايا.
7. متابعة مباشرة مع رد فعل النقل. تبقى الأنوية مستعدة على مدت

3. نقل رد فعل

ملاحظة: في هذه الخطوة، يتم المحتضنة نواة معزولة مع بدائية Tn5 ترانسبوساسي (TDE1) محملة بمحولات لتسلسل خ ع. وشظايا من الحمض النووي Tn5 مفرط في الوقت نفسه ليجاتيس محولات إلى مناطق موجوداً للجينوم (عملية تاجمينتيشن). النسبة بين نوى وترانسبوساسي Tn5 أمر حاسم للانقسام تفضيلية في الكروماتين موجوداً. معايرة هذا البروتوكول لنوى 100,000 في حجم رد فعل 100 ميكروليتر. بيد أن رد فعل يمكن تقليصها.

1. تعيين درجة الحرارة في شاكر حرارية إلى 37 درجة مئوية.
2. نوى 100,000 نقل إلى microtube 1.5 مل.
3. الطرد المركزي في ز 500 x لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية ولطف إزالة المادة طافية.
4. إضافة مكونات رد فعل التحول إلى النواة ك محدد في الجدول 1-
5. ريسوسبيند من بيبيتينج لطيف.
6. احتضان رد فعل التحول في شاكر حرارية في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع لطيف تهز (500 لفة في الدقيقة)-
   ملاحظة: تنظيف الحمض النووي هو يؤديها التثبيت عكسها المرحلة الصلبة الخرز ¹⁹ (انظر الجدول للمواد والمعدات) أو PCR تنقية الأعمدة. في نهاية عملية التنظيف، الوت الشظايا من الحمض النووي في 20 ميليلتر من 10 ملم تريس-HCl، درجة الحموضة 8. تجنب يدتا في المخزن المؤقت شطف.

4. بكر إثراء المكتبات أتاك-seq

ملاحظة: تهدف هذه الخطوة إلى تضخيم أتاك-seq مكتبة أي الشظايا من الحمض النووي مع محولات المدرج. للسماح بخلط عدة مكتبات أتاك-seq في حارة تسلسل الجيل نفسه (" الإرسال المتعدد ") غير مفهرسة استخدام التمهيدي 1 (Ad1_noMx) ¹ لجميع العينات، وفهرسة مختلفة (المراقب) التمهيدي 2 (Ad 2.1-2.24) ¹ لكل عينة. وترد في تسلسل التمهيدي في الجدول للمواد والمعدات المكملة.

1. الأولى [بكر] تضخيم
   ملاحظة: تركيز العمل التمهيدي 1 (Ad1_noMx) و 2 التمهيدي هو 25 ميكرومتر. هي تضعف الإشعال كل من الأسهم الأصلية من 100 ميكرومتر إلى 25 ميكرون. في كل ردود الفعل بكر، استخدم التمهيدي 1 (Ad1_noMx) وواحد فقط من 2 التمهيدي المفهرسة.
   1. إضافة المكونات لتفاعل PCR ك محدد في الجدول 2 إلى أنبوب PCR عقيمة.
   2. بكر مكان الأنبوبة إلى cycler حرارية وأداء [بكر] تضخيم استخدام الدراجات الشروط المفصلة في الجدول 3-
2. تقييما لعدد من دورات إضافية التضخيم
   ملاحظة: عدد دورات PCR إضافية ينبغي أن تسفر عن كمية كافية من مكتبة أجزاء وأو نجاح من جيل التالي تسلسل التشغيل، أثناء تصغير لتجنب GC وحجم التحيز ²⁰. يتم تحديد عدد PCR دورات (ن) المطلوبة للتضخيم جزء المكتبة المثلى PCR الكمي (qPCR).
   1. تمييع 1 كبسولة تفجير (Ad1_noMx) و 2 (يستخدم للتضخيم المكتبة الأولى) من 25 ميكرومتر إلى 6.25 ميكرومتر.
   2. إضافة المكونات إلى أنابيب PCR الضوئية أو لوحة كما ورد في الجدول 4-
   3. مكان في الصك قبكر ودورة المحدد في الجدول 5-
   4. الأرض لتقدير العدد المطلوب من دورات إضافية التضخيم (N)، عدد دورة على المحور السيني والأسفار النسبي (رفو) على المحور الصادي.
   دورات
   5. عدد التضخيم إضافية (N) هو 1/3 عدد من الدورات الذي يبلغ فيه رد فعل qPCR الهضبة. الشكل 2 يوفر أمثلة لثلاث مكتبات أتاك-seq التوصل إلى الهضبة في وحدات fluorescence النسبية ~ 2,350، رفو (خط أخضر سميك). عدد دورات PCR الذي يتم تضخيمه ثلث المبلغ الأقصى (783 رفو، علامة على المحور ص) يناظر 8 دورات لمدة سنتين للمكتبات (منحنيات التضخيم أحمر وأزرق) و 9 دورات PCR للمكتبة الثالث (الوردي)-
3. النهائية [بكر] تضخيم
   1. تضخيم ميليلتر 45 المتبقية لتفاعل PCR. ضع أنبوب PCR الذي يتضمن رد فعل التضخيم من الخطوة 4.1.2 في cycler حرارية. قم بتشغيل برنامج PCR المبينة في الجدول 6. استخدام عدد سبق تحديدها (الخطوة 4.2.5) دورات التضخيم (N)-

5. حجم "التحديد لمكتبات" أتاك-Seq

ملاحظة: في تجربتنا، يحسن اختيار حجم من تضخيم أتاك-seq مكتبات الجيل التالي تسلسل النتائج لأنه يقضي على ارتفاع الوزن الجزيئي مكتبة شظايا من النهائي seq أتاك المكتبة-
ملاحظة: تسمح الخرز المغناطيسي الحارة إلى درجة حرارة الغرفة 30 دقيقة قبل الاستخدام.
إعداد جديدة من الإيثانول 70% في المياه خالية من نوكلاس.

1. ريسوسبيند الخرز المغناطيسي بخلط.
2. إضافة المياه خالية من نوكلياسي إلى مكتبات أتاك-seq (التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.3.1.) وجلب يصل إلى 100 ميليلتر.
3. إضافة 50 ميليلتر (0.5 x) من حراكه الخرز المغناطيسي الحمض النووي ملزم إلى 100 ميليلتر من تضخيم المكتبات. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً على الأقل 10 مرات. احتضان عينات لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إذا لزم الأمر، تدور بسرعة إلى أسفل microtubes-
4. وضع الأنبوب على موقفا مغناطيسي مناسب لمدة 2 دقيقة لفصل الخرز المغناطيسي من المادة طافية. بعد 2 دقيقة، نقل المادة طافية microtube جديدة-
قياس حجم المادة طافية بيبيتينج
5. وإضافة x 0.7 من حبات مغناطيسية. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً على الأقل 10 مرات.
6. احتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. مكان على الوقوف مغناطيسي للحد الأدنى 2
7. بعد 2 دقيقة الحضانة، تجاهل المادة طافية. إضافة ميليلتر طازجة 200 70% إيثانول لغسل الخرز في حين الأنابيب على الوقوف المغناطيسي.
8. تبقى microtube على المغناطيس لمدة 30 ثانية وتجاهل ثم الإيثانول. كرر الخطوة 5.7.for هما الإيثانول النهائي يغسل.
9. إزالة الإيثانول واسمحوا الخرز أيردري لمدة 5 دقائق بينما الأنبوب على المغناطيس المتبقية. إذا لزم الأمر، باختصار تدور في microtube. إزالة آثار الإيثانول مع تلميح ماصة p10.
10. إزالة microtube من المغناطيس وإضافة ميليلتر 22 10 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 8. لا الوت المكتبات أتاك-seq في المخزن المؤقت الذي يحتوي على يدتا.
11. احتضان الأنبوب لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ومن ثم ضع على الوقوف المغناطيسي.
12. عندما يكون الحل واضح، نقل 20 ميليلتر من مكتبات التيد microtube عقيمة جديدة-
13. تحديد مخزن الحجم المكتبات أتاك-seq في-20 درجة مئوية.

6. تحليل نوعية المكتبات Seq أتاك

1. التحقق نوعية المكتبات seq أتاك من PCR الوقت الحقيقي
   ملاحظة: من المهم تقييم إشارة إلى نسبة الضوضاء من مكتبات seq أتاك قبل الجيل القادم التسلسل. يتم ذلك عن طريق تحديد مبلغ نسبي من شظايا من الحمض النووي من المكاني موجوداً ولا يمكن الوصول إليها باستخدام PCR الكمي (قبكر). المكاني غير قابلة للوصول (المراقبة السلبية، chr1:48، 137، 860-48,137,934 و chr1:193، 093، 748-193,093,827) تتضخم بأزواج التمهيدي 1 و 2. المكاني موجوداً (مراقبة إيجابية، chr19:30، 336، 166-30,336,253 و chr19:11546154-11546237) تتضخم بأزواج التمهيدي 3 و 4. تم تعريف المكاني الإيجابية والسلبية من الكروماتين إمكانية الوصول (درهم-seq) لمحات من خلايا CD4 + الإنسان (ترميز الانضمام ENCSR000EQE و ENCSR000EQG). التمهيدي سلبية 1 يقع في منطقة إينتيرجينيك هيتيروتشروماتيك كبيرة (230 كيلو بايت من TRADB2 و 88 كيلو بايت من FOXD2). منطقة المراقبة السلبية 2 في داخل إنترون الأولى من الجينات CDC73. الإيجابي زوج التمهيدي 3 داخل منطقة الكروماتين فتح المصب من الجينات Cyclin E (CCNE1) بينما التمهيدي إيجابية زوج 4 يتركز داخل المروج للبروتين كيناز ج الركيزة 80 كح (برككش). الأهم من ذلك، إظهار المكاني التحكم هذه نمطاً مماثلاً للوصول في أنواع الخلايا البشرية الأخرى من مشروع ترميز ³، مما يوحي بأنه يمكن تطبيقها على رصد المكتبات seq أتاك من طائفة واسعة من أنواع الخلايا البشرية. تم التحقق من التمهيدي الكفاءة والنوعية لجميع أزواج التمهيدي قبل قبكر على إضعاف مسلسل من الحمض النووي (من الخلايا البشرية Th) وتحليل منحنى ذوبان للمنتجات المتحصل عليها مكبرة.
   1. عزل الحمض النووي باستخدام المتاحة تجارياً كيت (انظر الجدول للمواد والمعدات)-
   2. تمييع تضخيم أتاك-seq مكتبة 01:10 (1 ميليلتر مكتبة + 9 ميليلتر من المياه خالية من nuclease) والحمض النووي ل ~ 5 نانوغرام/ميليلتر.
   3. إعداد رد فعل خليط (الجدول 7) لكل زوج التمهيدي التحكم الإيجابي والسلبي، آخذا في الاعتبار أن ردود الفعل التي يتم تنفيذها في ثلاث نسخ.
   4. إينكوباتي في qPCR cycler الحرارية وفقا للبروتوكول الذي أوصت به المورد الرئيسي ميكس qPCR.
   5. تحليل النتائج في الصك قبكر ' ق البرمجيات (انظر الجدول للمواد والمعدات). اختر الحمض النووي كعينة مراقبة. وتمثل القيم التي تم الحصول عليها إغناء المناطق موجوداً (تضخيمه بمراقبة إيجابية كبسولة تفجير). يتم عرض مثال في الجدول 8-
      ملاحظة: تقدير حجم متوسط مكتبة وتركيز: توزيع حجم شظايا من الحمض النووي من مكتبات أتاك-seq يتحدد بأنظمة عالية الحساسية التفريد الآلي وفقا للشركة المصنعة ' تعليمات s. فمن المستحسن أن قياس تركيز العينة على فلوروميتير استخدام طقم دسدنا حساسية عالية وعلى الأقل 2 ميليلتر لكل عينة من الحمض النووي-
      ملاحظة: الجيل التالي التسلسل--قبل الإرسال المتعدد في المكتبات، حساب مولاريتي لكل مكتبة seq أتاك باستخدام الصيغة: (نانوغرام/ميليلتر x 10 ⁶)/(تجزئة 660 × مكتبة متوسط الطول). وتهدف ل > ما يلي: 30 مليون لكل مكتبة أتاك-seq لتقييم الكروماتين مفتوحة مناطق عينات البشرية. إذا كنت ترغب في تحديد ما إذا كانت المكتبة جيدة بما يكفي لتسلسل خ ع، تهدف في البداية ليقرأ 10 مليون (5% حارة التسلسل على أداة تسلسل الحمض النووي في وضع التشغيل السريع). نأخذ في الاعتبار أن الاستدلال نوكليوسومي لتحديد المواقع، من إقران نهاية تسلسل المطلوبة ¹-

7. تحليل "النتائج التي تم الحصول عليها التسلسل" الجيل القادم

1. استنتاج نوعية ما يلي التسلسل بفحص الملفات فاستقك، لكل مكتبة على حدة-
2. محاذاة على ما يلي للجينوم البشرية مرجع (الجمعية hg19) باستخدام البرمجيات ²¹ Bowtie في بيئة يونيكس/لينكس. أن الأمر ' bowtie-م 1-س-S الجينوم الدليل reads.fastq output_aligned.sam '. دليل الجينوم تقف للمجلد حيث يتم تخزين فهارس Bowtie الجينوم. المعلمة-م 1 عدم السماح بالمحاذاة ليقرأ على محور واحد أو أكثر في الجينوم،-q ملف الإدخال التي ينبغي أن تكون في شكل فاستق،-S للإخراج في تنسيق سام-
3. إزالة مكررة ما يلي: استخدام الخيار رمدوب ²² سامتولس في بيئة يونيكس/لينكس. الأوامر ' سامتولس عرض output_aligned.sam-ب-S | فرز سامتولس-س-output_aligned > output_aligned.bam '،
   سامتولس رمدوب-ق output_aligned.bam output_aligned _rmdup.bam '. الأمر الأول، عرض، تغيير تنسيق سام في شكل سوق بكارا للأسلحة التي يتم فرزها بعد ذلك. ثم يتم تطبيق خيار رمدوب في الملف أم تم فرزها. بشكل اختياري واحد ضبط على ما يلي في موقع الإدراج ينقول، كما هو موضح في ورقة أتاك-seq الأصلي ¹. ويتم ذلك باستخدام بيدتولس الأوامر ²³ في بيئة يونيكس/لينكس. الأوامر ' بامتوبيد-i output_aligned _rmdup.bam > output_aligned _rmdup.bed '، ' شيفتبيد-i الجينوم 4-م-5-ز-ف _rmdup.bed output_aligned > output_aligned _rmdup_adjusted.bed '. الأمر الأول، بامتوبيد، تغيير تنسيق أم في شكل السرير الذي يمكن ثم استخدام الأمر شيفتبيد. الملف الجينوم هو ملف محدد في علامة تبويب التي تحتوي على طول كل كروموسوم في الجينوم. وعادة ما يتم إضافة الملف في الدليل بيدتولس.
4. إجراء استدعاء ذروة استخدام التحليل القائم على نموذج للبرنامج ²⁴ شريحة-seq (MACS2) في بيئة يونيكس/لينكس على الملف سرير تحول مع المعلمات التالية:-نوموديل-اكستسيزي 75-التحول-30. يتم استخدام هذه المعلمات لضبط ما يلي حيث يكون الموقع الإدراج ينقول في منتصف كل قراءة التسلسل.

النتائج

النتيجة النهائية لهذا البروتوكول مكتبة seq أتاك من عادة 3-20 نانوغرام/ميليلتر. عند تشغيل في وضع نظام لتحليل سلامة الحمض النووي (انظر الجدول للمواد والمعدات)، أنها تظهر مظهر يشبه سلم² (الشكل 3A). عادة ما يكون متوسط حجم شظايا من الحمض النووي...

Discussion

البروتوكول أتاك-seq الموصوفة هنا قد استخدمت بنجاح لتحليل الكروماتين موجوداً في الخلايا الأولية (Th1 البشرية، Th2 الخلايا، وخلايا ب) فضلا عن خطوط الخلايا المستزرعة (MCF10A خلايا سرطان الثدي البشرية والخلايا جليوبلاستوما U261). تطبيق أتاك-seq لأنواع خلايا أخرى قد تتطلب بعض التحسين البروتوكول، ولا سيم...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL tubes	Lumitron	LUM-CFT011500-P	Can be from other vendors.
Microtubes	Axygen Inc	MCT-175-C	Can be from other vendors.
25 mL serological pipettes	Corning Costar	4489	Can be from other vendors.
Tissue culture flask	Lumitron	LUM-TCF-012-250-P	Can be from other vendors.
Countes Automated Cell Counter	Invitrogen	C10227
NucleoSpin Tissue	MACHEREY-NAGEL	740952.5
Peripheral blood mononuclear cells (PBMC)	ATCC	PCS­800­011	Can be from other vendors.
RPMI 1640 Medium	Biological Industries	01-103-1A	Can be from other vendors.
L-Glutamine Solution (200 mM)	Biological Industries	03-020-1B	Can be from other vendors.
Penicillin-Streptomycin	Biological Industries	03-031-1B	Can be from other vendors.
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated, European Grade	Biological Industries	04-127-1	Can be from other vendors.
MACS CD4 microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-101
MACS MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Anti-Human CD4 FITC	Biogems	06121-50
Mouse IgG1 Isotype Control FITC	Biogems	44212-50
Anti-Human CD3 (OKT3)	Tonbo biosciences	40-0037
Anti-Human CD28 SAFIRE Purified	Biogems	10311-25
Recombinant Human IL2	Peprotech	200-02
Recombinant Human IL4	Peprotech	200-04
Recombinant Human IL12 p70	Peprotech	200-12
In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2)	Tonbo	40-7048
LEAF Purified anti-human IFN-γ	BioLegend	506513
NaCl, analytical grade	Carlo Erba	479687	Can be from other vendors.
Magnesium chloride, Hexahydrate, molecular biology grade	Calbiochem	442611	Can be from other vendors.
EDTA	MP Biomedicals	800682	Can be from other vendors.
Tris, ultra pure, 99.9% pure	MP Biomedicals	819620	Can be from other vendors.
NP-40 alternative (Nonylphenyl Polyethylene Glycol)	Calbiochem	492016	Can be from other vendors.
Protease Inhibitors	Sigma	P2714	this protease inhibitor coctail is a powder. To make 100 x solution dilute in 1 mL of molecular-biology grade water.
Magnetic solid phase reverse immobilization beads: AMPure XP beads	Beckman	63881
PCR purification kit	HyLabs	EX-GP200	Can be from other vendors.
Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase and TD buffer)	Illumina	FC-121-1030
NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix	New England BioLabs	M0541
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix	New England BioLabs	M0543
SYBR Green I	Invitrogen	S7585
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	Bio-rad	185-5200	Can be from other vendors.
CFX Manager Software	Bio-rad	1845000
master mix for qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-rad	172-5124	Can be from other vendors.
Qubit fluorometer 2.0	Invitrogen	Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32854
Magnet for eppendorf tubes	Invitrogen	12321D	Can be from other vendors.
Swing bucket cooling centrifuge with the buckets for 15 mL falcon tubes and eppendorf tubes	Thermo Scientific	75004527	Could be from other vendors. It is important that it has buckets for eppendorf tubes.
Thermo-shaker	MRC		Can be from other vendors.
High Sensitivity D1000 ScreenTape	Agilent Technologies	5067-5584
High Sensitivity D1000 Reagents	Agilent Technologies	5067-5585
4200 TapeStation system	Agilent Technologies	G2991AA	Tape-based platform for  electrophoresis
High Sensitivity DNA kit	Agilent Technologies	5067-4626	Reagent for high-sensitivity TapeStation analysis
Primer name and sequence	Company
Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3'	IDT		Ad1-noMx: 5'-P5 sequence-transposase sequence-3'
Ad2.1_TAAGGCGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.1_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.2_CGTACTAG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.2_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.3_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.4_TCCTGAGC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.4_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.5_GGACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.5_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.6_TAGGCATG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.6_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.7_CTCTCTAC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.7_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.8_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.9_GCTACGCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.9_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.10_CGAGGCTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG GCTCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.10_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.11_AAGAGGCA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.11_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.12_GTAGAGGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.12_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.13_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.14_ACCACTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.14_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.15_TGGATCTG: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.15_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.16_CCGTTTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.16_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.17_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.18_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.19_AGGTTGGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.19_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.20_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.21_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.22_TGGTCACA: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.22_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.23_TTGACCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.23_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.24_CCACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.24_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
F1: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3'	IDT
R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3'	IDT
F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3'	IDT
R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3'	IDT
F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3'	IDT
R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3'	IDT
F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3'	IDT
R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3'	IDT