מיפוי הגנום כולו נגיש כרומטין של לימפוציטים מסוג T אנושי ראשוני על ידי האטא ק-Seq

Summary

וזמינותו של כרומטין נגיש Transposase בשילוב עם תפוקה גבוהה רצף (האטא ק-seq) היא שיטה הגנום כולו לחשוף כרומטין נגיש. זהו פרוטוקול האטא ק-seq צעד אחר צעד, ממולקולרית לניתוח הסופי חישובית, אופטימיזציה עבור האדם לימפוציטים (Th1/Th2). פרוטוקול זה יכול להיות מאומץ על ידי חוקרים ללא ניסיון קודם בשיטות הדור הבא רצפי.

Abstract

וזמינותו של כרומטין Transposase נגיש עם תפוקה גבוהה רצף (האטא ק-seq) היא שיטה לצורך זיהוי פתוח מחוזות כרומטין (נגיש). אזורים אלה מייצגים רגולטוריות DNA אלמנטים (למשל, היזמים, מוצרי טיפוח טבעיים, לוקוס שליטה אזורים, insulators) שעתוק אילו גורמים איגוד. מיפוי הנוף כרומטין נגיש היא גישה רב-עוצמה לרכיבים שיגורי רגולציה פעילה ברחבי הגנום. מידע זה משמש גישה לא משוחדת על גילוי הרשת של גורמי שעתוק הרלוונטיים ומנגנונים של הכרומטין המפקחים על תוכניות ביטוי גנים. האטא ק-seq היא חלופה חזקה ורגיש DNase אני ניתוח רגישות יתר בשילוב עם הדור הבא רצפי (DNase-seq) ובידוד פורמלדהיד בסיוע של אלמנטים רגולטוריות (שלהם-seq) לניתוח ברמת הגנום של כרומטין נגישות וכדי הרצף של נוקלאז רגיש micrococcal אתרים (MNase-seq) כדי לקבוע את מיקום נוקלאוזום. אנו מציגים פרוטוקול האטא ק-seq מפורט ממוטב עבור החיסון האנושית ראשי תאי CD4 + כלומר לימפוציטים (T helper 1 (Th1) ותאים Th2). פרוטוקול מקיף זה מתחיל עם תא הקציר, מתאר את ההליך מולקולרית של כרומטין tagmentation, הכנת הדוגמא עבור הדור הבא רצפי, ואז כולל גם שיקולים הבדיקות חישובית נהגה ושיטות לפרש את התוצאות. יתר על כן, כדי לחסוך זמן וכסף, הצגנו את אמצעי בקרה כדי להעריך את ספריית האטא ק-seq לפני רצף. חשוב, העקרונות שהוצגו פרוטוקול זה מאפשר שלה ההסתגלות אחרים תאים ראשי אנושיים של המערכת החיסונית, הלא-החיסון, שורות תאים. קווים מנחים אלה גם יהיה שימושי עבור מעבדות אשר אינם בקיאים בשיטות הדור הבא רצפי.

Introduction

האטא ק-seq^1,2 היא שיטה חזקה המאפשרת זיהוי של אזורים פתוחים כרומטין רגולטוריות³ והמיקום נוקלאוזום. מידע זה מוחל על אומדן משוער, זהות, והמיקום פעילותם של גורמי שעתוק. רגישות השיטה למדידת כמותיים בווריאציות הכרומטין מאפשר חקר הפעילות של כרומטין גורמים, כולל כרומטין remodelers מגבילים, כמו גם את הפעילות תעתיק של RNA פולימראז II¹. ובכך האטא ק-seq מספק גישה רציונלית ובלתי עוצמה בפענוח מנגנוני המפקחים על תעתיק רגולציה בכל סוג התא של ריבית. אנו מתארים את העיבוד של האטא ק-seq תאי Th1 ו Th2 אדם ראשי.

ב האטא ק-seq, transposase Tn5 היפראקטיבי עמוסה מתאמים עבור הדור הבא רצפי (הגדרות) זוגות DNA פיצול עם תיוג של ה-DNA עם מתאמים (כלומר, תהליך "tagmentation")¹. בעקבות ה-PCR-הגברה, ספריות DNA שנוצר מוכנים עבור הדור הבא רצפי (איור 1). Tagmentation מועדף של כרומטין נגיש הוא זוהה על ידי הניתוח של העשרה המקומיים הקריאות רצף האטא ק-seq.

ניתוח ניסיוני קצר ואת הדרישה פחות חומר המוצא, ביחס שיטות אחרות למדידת כרומטין נגישות ומיקום nucleosomal כגון DNase-seq⁴, שלהם-seq⁵MNase-seq⁶, יש קידם את השימוש האטא ק-seq במערכות ביולוגיות מרובות, כולל תאים אנושיים ראשי^1,7 דוגמאות קליניות⁸, וכן אורגניזמים חד־תאיות⁹, צמחים¹⁰, זבובי פירות¹¹ , יונקים שונים¹².

זהותו של שעתוק ניתן חשפו גורמים שמאוגדים לוקוסים נגיש על ידי ניתוח את העשרת של מוטיבים רצף שלהם מחייב או שילוב האטא ק-seq עם כרומטין immunoprecipitation (ChIP) ואחריו (רצפי DNA תפוקה גבוהה ChIP-seq). גישה זו איפשרה זיהוי גורמי שעתוק ספציפיים שושלת היוחסין חשוב hematopoiesis העכבר¹³. הטבע לא משוחד ואשר הכללית של האטא ק-seq מאפשר ללמוד הכונה אורגניזמים אשר ריאגנטים כגון נוגדנים לניתוח שבב אינם זמינים. לדוגמה, אבולוציונית וריאציות ב- cis-אזורים רגולטוריות זוהו על ידי לימוד הרכס העצבי הגולגולת תאים מן השימפנזים ובני¹⁴, וריאציות התפתחותית ברכיבי תקינה במהלך העכבר בתחילת מופרה¹⁵, שינויים בנוף תקינה במהלך מחזור החיים של חד־תאיות owzarzaki ג⁹, והתפתחות של היזמים, משפרי מעבר יונקים 20 מינים¹².

האטא ק-seq היה גם אינסטרומנטלי למדידת כרומטין נגישות בתאים בודדים, ובכך לחשוף השתנות בתוך אוכלוסיות תאים, אשר בדרך כלל מתחמק מחקרים ברמת הגנום^7,16. בנוסף, ניתן להשתמש האטא ק-seq ללמוד שינויים המתרחשים באזורים רגולטוריות DNA בתנאים מחלה, שבה מדגמים נדירים. לדוגמה, ניתן להשתמש האטא ק-seq ללמוד שינויים בנוף תקינה במהלך תחילת לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML)¹⁷ או ראס-מונע oncogenesis¹¹.

Protocol

כל ההליכים אושרו על-ידי הועד המוסדי של אוניברסיטת בר אילן, הפרוטוקול מנחים שסופקו על-ידי הוועדה לאישור הניסויים.

1. טיהור של תמים CD4 + תאים אנושיים, קיטוב T Helper 1 (Th1) ותאים Th2

הערה: כאן אנו מתארים את ההליך מתחיל מתאי תאי דם היקפיים האנושי קפוא (PBMCs). הצעד הראשון מורכב בידוד תאי CD4 + באמצעות גרגרי, עמודות שבדרך כלל לתת לנו יותר מ 95% תאי CD4 +. עם זאת, שלב זה עשוי להשתנות לפי הפרוטוקול המועדף במעבדה כל. הפרוטוקול עבור הפעלת תא T, קיטוב שונה מן ג'נר. et al. (2009) ¹⁸. תאי בידוד של CD4 + מ- 10 מיליון PBMCs נותן לעלות 4-6 מיליון תאי CD4 +. הם לפצל שתי מבחנות, גדל תחת Th1 ו Th2 מקטב תנאים מניב תאי Th1 ו Th2 3-5 מיליון בתוך שבוע.

הערה: להתקרר לצנטריפוגה עד 4 ° C לפני שמתחילים.

1. להפשיר 1 מ ל PBMCs האנושית (10 ⁷ תאים) צינור 50 מ ל המכיל 10 מ"ל של מדיום RPMI בתוספת 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 2 מ מגלוטמין ו- 10% לא פעיל חום העובר שור סרום. צנטריפוגה ב 500 g x עבור 5 דק. הסר תגובת שיקוע, resuspend התאים עם פיפטה סטרילי 25 מ ב-15 מיליליטר שהושלם RPMI בינונית. להעביר את התאים (עם פיפטה סטרילי 25 מ ל) בקבוקון תרבות T75-
2. להשאיר למשך הלילה בתאים חממה humidified (37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂).
3. להעביר את התאים צפים עם פיפטה סטרילי 25 מ ל שפופרת 50 מ. לקבוע את המספר ואת הכדאיות מאת הדרה trypan blue.
4. תאים לבודד CD4 + 10 מיליון חיים שאינם-מחסידי PBMCs לפי בחירה חיובי באמצעות CD4 + גרגרי ועמודות על פי היצרן ' s המלצות (ראה טבלה של חומרים/ציוד) עם הבאה שינויים: 10 ⁷ PBMCs מסומנות עם 30 µL של גרגרי CD4 ב 120 µL של 0.5% BSA ב- PBS.
5. להפעיל את התאים CD4 + T עבור 72 h על-ידי rhIL-2 (10 ng/mL), צלחת מכורך אנטי CD3 (5 µg/mL) ו- anti-CD28 מסיסים (2 µg/mL). קיטוב Th1, הוסיפו rhIL-12 (20 ng/mL), אנטי-IL-4 (10 µg/mL). קיטוב Th2, להוסיף rhIL-4 (40 ng/mL) ו- anti-IFN-γ (10 µg/mL).
6. התרבות התאים נוספים 7 ימים בנוכחות rhIL-2 (10 ng/mL), ציטוקינים מהפכנית אותו (rhIL-12 ל- Th1 ו- rhIL-4 עבור Th2).

2. בידוד גרעינים

הערה: האטא ק-seq מבוצע עם גרעינים שלמים. פירוק מאגר המכילה 0.05% nonylphenyl פוליאתילן גליקול (ראה טבלה של חומרים/ציוד) היה מכויל לבידוד גרעינים של ראשי האנושי תאי Th1 ו- Th2. מומלץ לכייל את שלב זה עם ריאגנטים המעבדה, תאים. עודף של תאים שלמים דטרגנט לא מספיקות מקטין את יעילות התגובה טרנספוזיציה. יעילות פירוק התא נקבע לפי מספר גרעינים (תאים חיוביים trypan blue) ביחס למספר התאים.
הערה: הכנת המאגר פירוק (10 מ מ טריס-HCl, pH 7.5, 10 מ מ NaCl, 3 מ מ MgCl ₂). להתקרר צנטריפוגה עם רוטור סווינג-דלי ל- 4 מעלות צלזיוס Pelleting התאים צנטריפוגה סווינג-דלי במקום צנטריפוגה זווית קבועה מפחית אובדן התא/גרעינים. כדי להימנע גרעינים או איבוד תאים, pipet בזהירות בעת השלכת את תגובת שיקוע.

1. הוסף nonylphenyl טריים פוליאתילן גליקול (כדי ריכוז סופי של 0.05%) ו- 100 x מעכבי פרוטאז (כדי ריכוז סופי של 1 x) אל המאגר הקר פירוק מיד לפני השימוש. לשמור על המאגר על קרח
2. תאי Count T כדי לקבוע את הסכום שלהם ואת הכדאיות בשיטת trypan blue. הכדאיות נמוכים יותר 90% תוצאות לעיכול שאינם ספציפיים גבוה יותר.
3. העברת 0.5 x 10 ⁶ T תאים (Th1 או Th2) 1.5 mL microtubes. ספין למטה ב 500 g x עבור 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
4. Resuspend בגדר תא ב- 1 מ ל תמיסת מלח קרות באגירה פוספט (PBS). ספין למטה ב 500 g x עבור 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
5. Resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל של מאגר פירוק קר (המכילה nonylphenyl פוליאתילן גליקול, מעכבי פרוטאז). שמור את הצינורית על קרח. פיפטה בעדינות כדי להימנע מהפרעה הגרעינים.
6. לקחת את 10 µL ובמהירות לספור את התאים עם מונה הניתן תא אוטומטית אמנם microtube עם תאים lysed על הקרח. שלב זה לא יעלה על 5 דקות כדי למנוע נזק הגרעינים. לפחות 80% של התאים צריך להיות lysed.
7. המשך מיד עם התגובה טרנספוזיציה. גרעינים מוכנים להמשיך קרח

3. טרנספוזיציה התגובה

הערה: בשלב זה, גרעינים בודדים מודגרת עם prokaryotic transposase Tn5 (TDE1) נטען עם מתאמי עבור רצף המיתרים. Tn5 אקטיבי בו זמנית קטעים דנ א, ligates מתאמי למחוזות נגיש של הגנום (תהליך tagmentation). היחס בין הגרעינים Tn5 transposase הוא קריטי עבור ביקוע חלבונים מועדף-כרומטין נגיש. פרוטוקול זה מכויל עבור גרעינים 100,000 באמצעי אחסון התגובה μL 100. עם זאת, ניתן לשנות את התגובה.

1. להגדיר טמפרטורה ב שייקר תרמית כדי 37 מעלות צלזיוס.
2. 100,000 העברת גרעין כדי microtube 1.5 מ ל.
3. צנטריפוגה ב 500 x g למשך 10 דקות ב 4 ° C ובעדינות להסיר את תגובת שיקוע.
4. להוסיף את רכיבי התגובה טרנספוזיציה הגרעינים כמו שצוין ב טבלה 1-
5. Resuspend על ידי עדינה pipetting.
6. דגירה התגובה טרנספוזיציה ב שייקר תרמי ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם עדין רועדות (500 סל ד).
   הערה: ה-DNA ניקוי מתבצע על ידי מחרוזת הנייח הפיך מוצק-שלב ¹⁹ (ראה טבלה של חומרים/ציוד) או עמודות טיהור PCR. בסוף הניקוי, elute שברי DNA ב 20 µL 10 מ מ טריס-HCl, pH 8. להימנע EDTA במאגר • תנאי.

4. PCR העשרה של ספריות האטא ק-seq

הערה: שלב זה נועד להגביר את האטא ק-seq ספריית קרי, דנ א שברי עם מתאמי שנוספו. כדי לאפשר ערבוב של מספר ספריות האטא ק-seq באותו הדור הבא רצפי הנתיב (" ריבוב ") שימוש מדד פריימר 1 (Ad1_noMx) ¹ עבור כל הדגימות, ובעלות שונה אינדקס (לבר-קוד) 2 פריימר (Ad 2.1-2.24) ¹ עבור כל דגימה. רצפי פריימר ניתנים שהושלם טבלה של חומרים/ציוד.

1. הגברה PCR הראשונית
   הערה: הריכוז בעבודה של פריימר 1 (Ad1_noMx) ו- 2 פריימר הוא 25 מיקרומטר. כל תחל מדולל מן המניות המקוריים של מיקרומטר 100 מיקרומטר 25. בכל התגובות PCR, השתמש פריימר 1 (Ad1_noMx), רק אחד של 2 פריימר באינדקס.
   1. להוסיף את רכיבי התגובה PCR כמפורט בטבלה 2 צינור PCR סטרילי.
   2. המקום PCR צינור לתוך הצנטרפוגה תרמי ולבצע PCR הגברה באמצעות התנאים אופניים מפורט בטבלה 3.
2. הערכה של מספר מחזורי הגברה נוספת
   הערה: מספר מחזורי PCR נוספים אמור להניב כמות מספקת של ספריית מקטעי f. או מוצלח הדור הבא רצפי לרוץ, כל עוד ממוזער כדי להימנע GC, גודל הסטייה ²⁰... קביעת המספר של ה-PCR מחזורים (N) הדרושים עבור ספריית אופטימלית פרגמנט הגברה נעשית על ידי ה-PCR כמותי (qPCR).
   1. לדלל צבעי יסוד 1 (Ad1_noMx) ו-2 (משמש עבור ספריית הראשונית הגברה) מ מיקרומטר 25 מיקרומטר 6.25.
   2. להוסיף את רכיבי המבחנות אופטי או צלחת כאמור בטבלה 4.
   3. המקום כלי qPCR, מחזור כמו כמפורט בטבלה 5.
   4. כדי להעריך את המספר הנדרש של מחזורים נוספים הגברה (N), מגרש מחזור מספר על ציר ה-x ואת יחסי קרינה פלואורסצנטית (RFU) בציר ה-y.
   5. המספר של הגברה נוספת מחזורים (N) הוא 1/3 של מספר מחזורים שבהם התגובה qPCR להגיע אל הרמה. איור 2 מספק דוגמאות עבור שלוש ספריות האטא ק-seq שהגיעו plateau ב ~ 2,350 פלורסצנטיות היחסי של יחידות, RFU (בעובי הקו הירוק). מספר מחזורים PCR שבו מוגבר שליש מהסכום המקסימלי (783 RFU, המסומן על ציר ה-y) מקביל 8 מחזורים של הספריות (אדום וכחול הגברה עקומות) שני ומחזורי PCR 9 עבור הספריה השלישי (ורוד)-
3. הגברה PCR הסופי
   1. להגביר את µL 45 הנותרים של תגובת ה-PCR. הצב צינור PCR המכיל הגברה תגובה של צעד 4.1.2 הצנטרפוגה תרמי. הפעל את התוכנית PCR שמתואר טבלה 6. השתמש במספר שנקבע בעבר (שלב 4.2.5) מחזורים הגברה (N).

5. גודל הבחירה של ספריות האטא ק-Seq

הערה: מניסיוננו, בחירת גודל של ספריות האטא ק-seq מוגבר משפר תוצאות הדור הבא רצפי מכיוון שהוא מבטל את שברי ספריית משקל מולקולרי גבוה ספריית האטא ק-seq הסופי.
הערה: לאפשר את החרוזים מגנטי לחמם לטמפרטורת החדר 30 דקות לפני השימוש.
להכין טרי אתנול 70% במים נטולי נוקלאז.

1. Resuspend את החרוזים מגנטי על ידי ערבוב.
2. להוסיף מים נטולי נוקלאז לספריות האטא ק-seq (מתקבל בשלב 4.3.1.) ולהביא עד 100 µL.
3. µL להוסיף 50 (0.5 x) של resuspended DNA-איגוד beads מגנטי כדי 100 µL של ספריות מוגבר. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה לפחות 10 פעמים. דגירה בדגימות למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. במידת הצורך, במהירות ספין למטה microtubes.
4. במקום הצינור על דוכן העדים מגנטי המתאים למשך 2 דקות להפריד את החרוזים מגנטי תגובת שיקוע. לאחר 2 דקות, להעביר את תגובת שיקוע microtube חדש-
5. למדוד הנפח של תגובת שיקוע על ידי pipetting ולהוסיף 0.7 x של beads מגנטי. מיקס על ידי pipetting למעלה ולמטה לפחות 10 פעמים.
6. דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר. המקום על דוכן מגנטי עבור 2 דק
7. לאחר 2 דקות דגירה, למחוק את תגובת שיקוע. להוסיף 200 אתנול 70% µL טריות לשטוף את החרוזים אמנם הצינורות על הדוכן מגנטי.
8. לשמור microtube על המגנט ב-30 s וביטול ואז האתנול. חזור על שלב 5.7.for מנקי אתנול הסופי שני.
9. להסיר לחלוטין את הנותרים אתנול ולתת שהחרוזים מילה נהדרת עבור 5 דקות ברכבת התחתית נמצאת על המגנט. במידת הצורך, בקצרה לסובב את microtube. להסיר את עקבות אתנול עם טיפ פיפטה p10.
10. להסיר את microtube של המגנט ולהוסיף µL 22 10 מ מ טריס-HCl, pH 8. לא elute את ספריות האטא ק-seq במאגר המכילה EDTA.
11. דגירה הצינור למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן מקם לדוכן מגנטי.
12. כאשר הפתרון ברור, להעביר 20 µL של ספריות eluted microtube עקר חדש.
13. חנות בגודל שנבחר האטא ק-seq ספריות ב-20 מעלות צלזיוס

6. ניתוח איכותי של ספריות האטא ק-Seq

1. אימות של איכות האטא ק-seq ספריות באמצעות PCR בזמן אמת
   הערה: חשוב להעריך את האות לרעש יחס של ספריות האטא ק-seq לפני הדור הבא . רצף. פעולה זו מתבצעת על-ידי קביעת הכמות היחסית של שברי DNA לוקוסים נגיש בלתי נגיש באמצעות PCR כמותי (qPCR). רוח המקום לא נגיש (שליטה שלילי, chr1:48, 137, 860-48,137,934 ו- chr1:193, 093, 748-193,093,827) הם מוגבר על ידי זוגות פריימר 1 ו- 2. רוח המקום נגיש (שליטה חיובית, chr19:30, 336, 166-30,336,253 ו- chr19:11546154-11546237) הם מוגבר על ידי זוגות פריימר 3 ו- 4. לוקוסים חיוביים ושליליים הוגדרו מפרופילים נגישות (DHS-seq) כרומטין CD4 + תאים אנושיים (קידוד accessions ENCSR000EQE ו- ENCSR000EQG). פריימר שלילי 1 ממוקם אזור intergenic heterochromatic גדולים (kb 230 מ TRADB2, 88 kb של FOXD2). אזור בקרה שלילית 2 נמצא בתוך אינטרון הראשון של ג'ין CDC73. חיובי פריימר זוג 3 נמצא אזור פתוח כרומטין במורד הזרם של הגן Cyclin E (CCNE1) תוך פריימר חיובי זוג 4 ממורכזת בתוך האמרגן של חלבון קינאז C המצע 80K-H (PRKCSH). חשוב, לוקוסים שליטה אלה מראים דפוס דומה של נגישות בסוגי תאים אנושיים פרוייקט ' קידוד ' ³, רומז כי ניתן להחילם לפקח האטא ק-seq ספריות של קשת רחבה של סוגי תאים אנושיים. פריימר יעילות וספציפיות של כל זוגות פריימר אומתה על ידי qPCR לדילול טורי של דנ א גנומי (מתוך תאי Th אדם) וניתוח עקומת ההיתוך של מוצרים מוגבר שהושג.
   1. לבודד דנ א גנומי באמצעות זמינים מסחרית קיט (ראה טבלה של חומרים/ציוד).
   2. לדלל את האטא ק-seq מוגבר הספרייה 1:10 (ספריית µL 1 + 9 µL של מים נטולי נוקלאז) ו- DNA גנומי ל ~ 5 ng/µL.
   3. להכין תערובת התגובה (טבלה מס ' 7) עבור כל זוג פריימר בקרה חיובית ושלילית, לקחת בחשבון התגובות מבוצעות שהפקידים.
   4. Incubate ב qPCR הצנטרפוגה תרמי לפי הפרוטוקול המומלץ על ידי הספק מיקס מאסטר qPCR.
   5. לנתח את התוצאות ב- qPCR כלי ' s תוכנה (ראה טבלה של חומרים/ציוד). בחרו ' DNA גנומי דגימת הבקרה. הערכים שהושג מייצגים של העשרה של אזורים נגיש (מוגבר על ידי בקרה חיובית תחל). לדוגמה מוצג בטבלה 8.
      הערה: הערכה של גודל הספרייה הממוצע, ריכוז: התפלגות גודל שברי DNA האטא ק-seq מספריות של נקבעת על-ידי מערכות אלקטרופורזה אוטומטיות רגישות גבוהה על פי היצרן ' s הוראות. מומלץ למדוד את הדגימה התרכזות fluorometer באמצעות ערכת רגישות גבוהה dsDNA ו- µL לפחות 2 של כל דגימה של הדנ א.
      הערה: הדור הבא רצפי - לפני ריבוב של הספריות, לחשב את molarity של כל ספריה האטא ק-seq באמצעות הנוסחה: (ng/µL x 10 ⁶) / (660 x ממוצע ספריית קטע אורך). . כווני > 30 מיליון קריאות של כל ספריה האטא ק-seq להעריך כרומטין פתוח אזורים של דגימות אנושי. אם ברצונך לקבוע אם הספרייה הוא מספיק טוב בשביל המיתרים רצף, בתחילה המטרה עבור קריאות ~ 10 מיליון (5% הסמטה רצפי DNA רצף כלי במצב ריצה מהירה). זכור כי להסיק נוקלאוזום מיצוב, לזווג-קצה הרצף הוא נדרש ¹-

7. ניתוח של התוצאות שהושגו רצף הדור הבא

1. יסיק האיכות של פעולות רצף הקריאה על-ידי בדיקה הקבצים FastQC, בנפרד עבור כל ספריית.
2. יישר את הקריאות על הגנום האנושי הפניה (hg19 הרכבה) באמצעות עניבת הפרפר ²¹ תוכנה בסביבת Unix/Linux. הפקודה היא ' עניבת הפרפר -m 1 - q -S הגנום מדריך reads.fastq output_aligned.sam '. מדריך הגנום מייצג את התיקיה שבה מאוחסנות האינדקסים הגנום של עניבת הפרפר. פרמטר -m 1 היא עבור אינו מאפשר יישור הקריאות אל אחד או יותר לוקוס הגנום - q עבור קובץ הקלט צריך להיות בתבנית fastq, -S הוא לפלט בתבנית סאם.
3. להסיר כפילויות קריאות באמצעות SAMtools ²² rmdup אפשרות בסביבת Unix/Linux. הפקודות הן ' samtools להציג output_aligned.sam -S -b | samtools למיין -o-output_aligned > output_aligned.bam ',
   samtools rmdup -s output_aligned.bam output_aligned _rmdup.bam '. הפקודה הראשונה, תצוגה, שינוי התבנית סאם בפורמט באם אשר לאחר מכן ממוינים. האפשרות של rmdup ואז חלה על הקובץ באם הממוין. באופן אופציונלי אחד ניתן להתאים את הקריאות עבור האתר הכניסה transposon, כפי שמתואר את הנייר המקורי האטא ק-seq ¹. פעולה זו מתבצעת באמצעות BEDtools מצווה ²³ בסביבת Unix/Linux. הפקודות הן ' bamToBed -i output_aligned _rmdup.bam > output_aligned _rmdup.bed ', ' shiftBed -i הגנום 4 - מ-5 - g -p _rmdup.bed output_aligned > output_aligned _rmdup_adjusted.bed '. הפקודה הראשונה, bamTobed, שינוי התבנית באם בפורמט מיטה אשר יכול לשמש עבור הפקודה shiftBed. הקובץ הגנום הוא קובץ מופרד כרטיסיה המכילה את האורך של כל כרומוזום הגנום. בדרך כלל להוסיף את הקובץ בספריה BEDtools.
שיא
4. לבצע חיוג באמצעות ניתוח המבוסס על מודל של שבב-seq (MACS2) ²⁴ תוכנה בסביבת Unix/Linux על הקובץ מיטה שהוסטו עם הפרמטרים הבאים: - nomodel - extsize 75--משמרת-30. פרמטרים אלה משמשים כדי להתאים את הקריאות כך האתר ההכנסה transposon הוא באמצע כל קריאה רצף.

תוצאות

התוצאה הסופית של פרוטוקול זה הוא ספריה האטא ק-seq של בדרך כלל 3-20 ng/µL. מתי לרוץ על מערכת עבור ניתוח שלמות הדנ א (ראה טבלה של חומרים/ציוד), הם מציגים מראה כמו סולם² (איור 3 א). הגודל הממוצע של קטעי DNA היא בדרך כלל bp ~ 450-530.

Discussion

פרוטוקול האטא ק-seq המתוארים כאן כבר בהצלחה מועסקים לניתוח של כרומטין נגיש בתאים הראשי (Th1 אנושי, Th2 תאים, ותאי B) כמו גם שורות תאים בתרבית (תאי סרטן השד אנושי MCF10A ו- U261 גליובלסטומה תאים). החלת האטא ק-seq סוגי תאים אחרים עשויים לדרוש קצת אופטימיזציה פרוטוקול, במיוחד בשלב פירוק. אם הריכוז של דטרגנט ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL tubes	Lumitron	LUM-CFT011500-P	Can be from other vendors.
Microtubes	Axygen Inc	MCT-175-C	Can be from other vendors.
25 mL serological pipettes	Corning Costar	4489	Can be from other vendors.
Tissue culture flask	Lumitron	LUM-TCF-012-250-P	Can be from other vendors.
Countes Automated Cell Counter	Invitrogen	C10227
NucleoSpin Tissue	MACHEREY-NAGEL	740952.5
Peripheral blood mononuclear cells (PBMC)	ATCC	PCS­800­011	Can be from other vendors.
RPMI 1640 Medium	Biological Industries	01-103-1A	Can be from other vendors.
L-Glutamine Solution (200 mM)	Biological Industries	03-020-1B	Can be from other vendors.
Penicillin-Streptomycin	Biological Industries	03-031-1B	Can be from other vendors.
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated, European Grade	Biological Industries	04-127-1	Can be from other vendors.
MACS CD4 microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-101
MACS MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Anti-Human CD4 FITC	Biogems	06121-50
Mouse IgG1 Isotype Control FITC	Biogems	44212-50
Anti-Human CD3 (OKT3)	Tonbo biosciences	40-0037
Anti-Human CD28 SAFIRE Purified	Biogems	10311-25
Recombinant Human IL2	Peprotech	200-02
Recombinant Human IL4	Peprotech	200-04
Recombinant Human IL12 p70	Peprotech	200-12
In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2)	Tonbo	40-7048
LEAF Purified anti-human IFN-γ	BioLegend	506513
NaCl, analytical grade	Carlo Erba	479687	Can be from other vendors.
Magnesium chloride, Hexahydrate, molecular biology grade	Calbiochem	442611	Can be from other vendors.
EDTA	MP Biomedicals	800682	Can be from other vendors.
Tris, ultra pure, 99.9% pure	MP Biomedicals	819620	Can be from other vendors.
NP-40 alternative (Nonylphenyl Polyethylene Glycol)	Calbiochem	492016	Can be from other vendors.
Protease Inhibitors	Sigma	P2714	this protease inhibitor coctail is a powder. To make 100 x solution dilute in 1 mL of molecular-biology grade water.
Magnetic solid phase reverse immobilization beads: AMPure XP beads	Beckman	63881
PCR purification kit	HyLabs	EX-GP200	Can be from other vendors.
Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase and TD buffer)	Illumina	FC-121-1030
NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix	New England BioLabs	M0541
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix	New England BioLabs	M0543
SYBR Green I	Invitrogen	S7585
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	Bio-rad	185-5200	Can be from other vendors.
CFX Manager Software	Bio-rad	1845000
master mix for qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-rad	172-5124	Can be from other vendors.
Qubit fluorometer 2.0	Invitrogen	Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32854
Magnet for eppendorf tubes	Invitrogen	12321D	Can be from other vendors.
Swing bucket cooling centrifuge with the buckets for 15 mL falcon tubes and eppendorf tubes	Thermo Scientific	75004527	Could be from other vendors. It is important that it has buckets for eppendorf tubes.
Thermo-shaker	MRC		Can be from other vendors.
High Sensitivity D1000 ScreenTape	Agilent Technologies	5067-5584
High Sensitivity D1000 Reagents	Agilent Technologies	5067-5585
4200 TapeStation system	Agilent Technologies	G2991AA	Tape-based platform for  electrophoresis
High Sensitivity DNA kit	Agilent Technologies	5067-4626	Reagent for high-sensitivity TapeStation analysis
Primer name and sequence	Company
Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3'	IDT		Ad1-noMx: 5'-P5 sequence-transposase sequence-3'
Ad2.1_TAAGGCGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.1_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.2_CGTACTAG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.2_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.3_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.4_TCCTGAGC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.4_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.5_GGACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.5_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.6_TAGGCATG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.6_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.7_CTCTCTAC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.7_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.8_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.9_GCTACGCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.9_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.10_CGAGGCTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG GCTCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.10_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.11_AAGAGGCA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.11_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.12_GTAGAGGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.12_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.13_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.14_ACCACTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.14_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.15_TGGATCTG: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.15_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.16_CCGTTTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.16_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.17_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.18_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.19_AGGTTGGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.19_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.20_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.21_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.22_TGGTCACA: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.22_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.23_TTGACCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.23_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.24_CCACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.24_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
F1: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3'	IDT
R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3'	IDT
F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3'	IDT
R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3'	IDT
F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3'	IDT
R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3'	IDT
F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3'	IDT
R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3'	IDT