Mappatura del genoma della cromatina accessibile in linfociti T umani primari da ATAC-Seq

Riepilogo

Analisi per Transposase-accessibile della cromatina accoppiato con sequenziamento ad alta produttività (ATAC-seq) è un metodo di genoma per scoprire accessibile della cromatina. Questo è un protocollo di ATAC-seq passo dopo passo, da molecolari all'analisi computazionale del finale, ottimizzato per i linfociti umani (Th1/Th2). Questo protocollo può essere adottato da ricercatori senza precedente esperienza nei metodi di sequenziamento di nuova generazione.

Abstract

Dosaggio per cromatina Transposase-accessibile con sequenziamento ad alta produttività (ATAC-seq) è un metodo utilizzato per l'identificazione di regioni aperte (accessibile) della cromatina. Queste regioni rappresentano elementi di DNA regolatori (ad es., promotori, enhancers, locus control regioni, Isolatori) a cui trascrizione si legano fattori. Il paesaggio di cromatina accessibile la mappatura è un approccio potente per scoprire elementi regolatori attivi in tutto il genoma. Questa informazione serve come un approccio imparziale per scoprire la rete di fattori di trascrizione pertinenti e meccanismi della struttura della cromatina che governano programmi di espressione genica. ATAC-seq è un'alternativa robusta e sensibile alla dnasi analisi di ipersensibilità accoppiato con formaldeide-assistita isolamento di elementi regolatori (FAIRE-seq) per l'analisi del genoma della cromatina e sequenziamento di nuova generazione (DNasi-seq) accessibilità e per il sequenziamento di micrococcal siti sensibili nucleasi (MNase-seq) per determinare il posizionamento nucleosoma. Vi presentiamo un dettagliato protocollo di ATAC-seq ottimizzato per cellule umane primarie immuni cioè CD4 + linfociti (T helper 1 (Th1) e cellule Th2). Questo protocollo completo inizia con la raccolta delle cellule, quindi descrive la procedura molecolare di cromatina tagmentation, preparazione del campione per il sequenziamento di nuova generazione e include anche metodi e considerazioni per l'analisi computazionali utilizzati per interpretare i risultati. Inoltre, per risparmiare tempo e denaro, abbiamo introdotto misure di controllo di qualità per valutare la libreria ATAC-seq prima del sequenziamento. Importante, i principi esposti nel presente protocollo consentono il suo adattamento ad altre cellule primarie umane immuni e non immuni e linee cellulari. Queste linee guida sarà anche utile per i laboratori che non sono abili con metodi di sequenziamento di nuova generazione.

Introduzione

ATAC-seq^1,2 è un metodo affidabile che consente l'identificazione di regioni di cromatina aperta regolamentare³ e posizionamento nucleosoma. Questa informazione viene applicata per dedurre la posizione, identità e attività di fattori di trascrizione. Sensibilità del metodo di misurazione quantitativa delle variazioni nella struttura cromatinica permette lo studio dell'attività dei fattori della cromatina, compreso remodelers della cromatina e modificatori, come pure l'attività trascrizionale di RNA polimerasi II¹. Così ATAC-seq fornisce un approccio potente e imparziale per decifrare i meccanismi che governano la regolazione trascrizionale in qualsiasi tipo di cellula di interesse. Descriviamo l'adattamento di ATAC-seq per cellule umane primarie di Th1 e Th2.

ATAC-seq, iperattivo Tn5 transposase caricato con adattatori per frammentazione del DNA di sequenziamento di nuova generazione (NGS) coppie con la codifica del DNA con adattatori (cioè, il processo di "tagmentation")¹. In seguito l'amplificazione di PCR, le librerie di DNA risultante sono pronte per il sequenziamento di nuova generazione (Figura 1). Il tagmentation preferenziale della cromatina accessibile viene rilevato dall'analisi dell'arricchimento locale di letture di sequenziamento ATAC-seq.

La breve procedura sperimentale e requisito per meno materiale di partenza, rispetto al altri metodi per misurare l'accessibilità della cromatina e posizionamento nucleosomal dnasi-seq⁴, FAIRE-seq⁵e MNase-seq⁶, ha promosso l'uso di ATAC-seq in più sistemi biologici tra cui cellule primarie umane^1,7 e campioni clinici⁸, così come organismi unicellulari⁹, piante¹⁰, mosche della frutta¹¹ e vari mammiferi¹².

L'identità della trascrizione, fattori che sono associati ai loci accessibile possono essere scoperta dalla analizzando l'arricchimento dei loro motivi di sequenza di associazione o combinando ATAC-seq con immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) seguita da (sequenziamento del DNA di alto-rendimento ChIP-seq). Questo approccio ha permesso l'identificazione di fattori di trascrizione lineage-specifici importanti per l'ematopoiesi in mouse¹³. La natura imparziale e globale di ATAC-seq permette di studiare la regolazione genica negli organismi per i quali i reagenti come gli anticorpi per l'analisi di ChIP non sono disponibili. Ad esempio, variazioni di evolutive in cis-regioni regolarici sono state identificate attraverso lo studio di cellule neurali craniche della cresta da esseri umani e scimpanzé¹⁴, variazioni inerenti allo sviluppo di elementi regolatori durante primo mouse l'embriogenesi¹⁵, cambia nel panorama normativo durante un ciclo di vita di unicellulari owzarzaki c.⁹e l'evoluzione dei promotori e rinforzatori attraverso 20 mammifero specie¹².

ATAC-seq è stato strumentale per misurare l'accessibilità della cromatina in singole cellule, così rivelando variabilità all'interno di popolazioni di cellule, che solitamente sfugge genoma studi^7,16. Inoltre, ATAC-seq può essere utilizzato per studiare i cambiamenti che si verificano in condizioni di malattia, in cui i campioni sono rari nelle regioni regolatrici del DNA. Ad esempio, ATAC-seq può essere utilizzato per studiare i cambiamenti nel panorama normativo durante l'insorgenza della leucemia mieloide acuta (AML)¹⁷ o Ras-driven oncogenesi¹¹.

Protocollo

tutte le procedure sono state approvate dal comitato di revisione istituzionale dell'Università di Bar Ilan e il protocollo segue linee guida fornite dal comitato che approva gli esperimenti.

1. purificazione di ingenuo CD4 + cellule umane e polarizzazione di cellule Th2 e T Helper 1 (Th1)

Nota: Qui descriviamo la procedura a partire da cellule mononucleari del sangue periferico umano congelato (PBMCs). Il primo passo consiste nell'isolare le cellule CD4 + utilizzando microsfere e colonne che di solito dare noi più del 95% delle cellule di CD4 +. Tuttavia, questo passaggio può variare secondo il protocollo preferito in ogni laboratorio. Il protocollo per l'attivazione delle cellule T e la polarizzazione è stato modificato da Jenner et al. (2009) ¹⁸. isolamento di CD4 + cellule da 10 milioni PBMCs dà luogo a 4 milioni di cellule CD4 +. Sono diviso in due boccette e cresciuti sotto Th1 e di polarizzazione Th2 condizioni ottenendo 3 milioni cellule Th1 e Th2 in appena una settimana.

Nota: raffreddare la centrifuga a 4 ° C prima di iniziare.

1. Scongelare 1 mL di PBMCs umano (10 ⁷ cellule) in una provetta da 50 mL contenente 10 mL di medium RPMI supplementato con 1% di penicillina-streptomicina, 2 mM L-Glutammina e siero bovino fetale inattivati 10%. Centrifugare a 500 g per 5 min, rimuovere il supernatante e risospendere le cellule con una pipetta sterile 25 mL in 15 mL di medium RPMI completato. Trasferire le cellule (con una pipetta sterile 25 mL) in un pallone di cultura T75.
2. Lasciare le celle durante la notte in un incubatore (37 ° C, 5% CO ₂).
3. Trasferire le cellule galleggiante con una pipetta sterile da 25 mL per tubo da 50 mL. Determinare il numero di cell e attuabilità di esclusione del blu di trypan.
4. Isolare CD4 + cellule da 10 milioni vivono antiaderente PBMCs di selezione positiva utilizzando microsfere di CD4 + e colonne secondo il produttore ' consigli s (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature) con i seguenti modifiche: 10 ⁷ PBMCs sono etichettati con 30 µ l di microsfere di CD4 in 120 µ l di 0,5% BSA in PBS.
5. Per attivare le cellule T CD4 + per 72 h rhIL-2 (10 ng/mL), associato a piastra anti-CD3 (5 µ g/mL) e solubile anti-CD28 (2 µ g/mL). Per polarizzazione Th1, aggiungere rhIL-12 (20 ng/mL) e anti-IL-4 (10 µ g/mL). Per polarizzazione Th2, aggiungere rhIL-4 (40 ng/mL) e anti-IFN-γ (10 µ g/mL).
6. Le cellule della coltura per ulteriori 7 giorni in presenza di rhIL-2 (10 ng/mL) e le stesse citochine polarizzante (rhIL-12 per Th1 e rhIL-4 per Th2).

2. Isolamento di nuclei

Nota: ATAC-seq viene eseguita con i nuclei intatti. Lysis buffer contenente 0,05% nonylphenyl polietilenglicole (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature) è stato calibrato per isolare nuclei da cellule umane primarie di Th1 e Th2. Si consiglia di calibrare questo passaggio con i reagenti di laboratorio e le cellule. Un eccesso di cellule intatte da detersivo insufficiente diminuisce l'efficienza della reazione di trasposizione. Efficienza di lisi delle cellule è determinata dal numero dei nuclei (cellule positive del blu di trypan) rispetto al numero totale delle cellule.
Nota: Preparare il tampone di lisi (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 millimetri di NaCl, 3 mM MgCl ₂). Raffreddare una centrifuga con rotore a battente-benna a 4 ° C. cubettatura le cellule in una centrifuga di swing-secchio invece di una centrifuga ad angolo fisso riduce la perdita di nuclei e delle cellule. Per evitare i nuclei o perdita delle cellule, Pipettare attentamente quando scartare il surnatante.

1. Aggiungi fresco nonylphenyl polietilenglicole (a una concentrazione finale di 0.05%) e inibitori della proteasi (a una concentrazione finale di 1 x) per il buffer di lisi freddo immediatamente prima dell'uso: 100x. Mantenere il buffer su Ice.
2. Cellule di T totali per determinarne la quantità e la redditività mediante metodo del blu di trypan. Vitalità che è inferiore al 90% di risultati superiore non specifico digestione.
3. Trasferimento 0,5 x 10 ⁶ T cellule (Th1 o Th2) per microprovette da 1,5 mL. Rotazione verso il basso a 500 x g per 5 min a 4 ° C.
4. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di freddo tampone fosfato salino (PBS) soluzione. Rotazione verso il basso a 500 x g per 5 min a 4 ° C.
5. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone di lisi freddo (contenente nonylphenyl polietilene glicole e inibitori della proteasi). Tenere il tubo sul ghiaccio. Pipetta delicatamente per evitare di interrompere i nuclei.
6. Rapidamente prendere 10 µ l e contare le celle con un contatore di cellule automatizzato mentre nella microprovetta con le cellule lisate è il ghiaccio. Questo passaggio non deve superare i cinque minuti per evitare di danneggiare i nuclei. Almeno l'80% delle cellule dovrebbe essere lisati.
7. Continua immediatamente con la reazione di trasposizione. Mantenere i nuclei preparati sul ghiaccio.

3. Reazione di trasposizione

Nota: In questo passaggio, nuclei isolati sono incubati con procariotiche Tn5 transposase (TDE1) caricato con adattatori per il sequenziamento NGS. Tn5 iperattivo, contemporaneamente, frammenti di DNA e lega adattatori in regioni accessibili del genoma (processo tagmentation). Il rapporto tra nuclei e Tn5 transposase è critico per la scissione preferenziale alla cromatina accessibile. Questo protocollo è calibrato per 100.000 nuclei in un volume di reazione 100 μL. Tuttavia, la reazione può essere ridimensionata.

1. Set temperatura in uno shaker termale a 37 ° C.
2. Trasferire 100.000 nuclei ad una microprovetta 1,5 mL.
3. Centrifuga a 500 x g per 10 min a 4 ° C e delicatamente rimuovere il supernatante.
4. Aggiungere i componenti di reazione di trasposizione dei nuclei come specificato nella tabella 1.
5. Risospendere pipettando delicato.
6. Incubare la reazione di trasposizione in uno shaker termale a 37 ° C per 30 min con lieve agitazione (500 giri/min).
   Nota: Pulizia del DNA viene eseguita da fase solida reversibile immobilizzazione perline ¹⁹ (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature) o colonne di purificazione di PCR. Al termine della pulizia, eluire i frammenti di DNA in 20 µ l di 10 mM Tris-HCl, pH 8. Evitare di EDTA in tampone di eluizione.

4. Arricchimento di PCR delle librerie ATAC-seq

Nota: questo passaggio si rivolge per amplificare i frammenti di ATAC-seq libreria cioè DNA con adattatori inseriti. Per consentire la miscelazione di diverse librerie di ATAC-seq nella stessa corsia di sequenziamento di nuova generazione (" multiplexing ") uso meno Primer 1 (Ad1_noMx) ¹ per tutti i campioni, e una diversa indicizzati (codice a barre) 2 Primer (Ad 2.1-2.24) ¹ per ogni campione. Le sequenze dell'iniettore sono fornite nell' completati Tabella di materiali/attrezzature.

1. L'amplificazione di PCR iniziale
   Nota: la concentrazione di lavoro di Primer 1 (Ad1_noMx) e 2 Primer è 25 µM. Tutti i primer sono diluiti da originale stock di 100 µM a 25 µM. In tutte le reazioni di PCR, utilizzare Primer 1 (Ad1_noMx) e solo uno dei 2 Primer indicizzata.
   1. Aggiungere i componenti della reazione PCR come specificato nella tabella 2 in una provetta sterile da PCR.
   2. Posto PCR tubo in un termociclatore ed eseguire l'amplificazione di PCR utilizzando i ciclismo condizioni dettagliate nella tabella 3.
2. Valutazione del numero di cicli di amplificazione aggiuntiva
   Nota: il numero di ulteriori cicli di PCR dovrebbe produrre sufficienti quantità di libreria frammenti fo un successo sequenziamento di nuova generazione esegue, mentre ridotti al minimo per evitare GC e taglia bias ²⁰. La determinazione del numero di cicli PCR (N) richiesti per l'amplificazione del frammento biblioteca ottimale avviene mediante PCR quantitativa (qPCR).
   1. Diluire 1 Primer (Ad1_noMx) e 2 (usato per l'amplificazione iniziale Biblioteca) da 25 µM a 6.25 µM.
   2. Aggiungere i componenti a tubi ottici di PCR o un piatto, come indicato nella tabella 4.
   3. Posto in un ciclo come specificato nella tabella 5 e strumento di qPCR.
   4. Per stimare il numero di cicli di amplificazione aggiuntiva (N), tracciare il numero di cicli sull'asse x e relativa fluorescenza (RFU) sull'asse y.
   5. Il numero di amplificazione ulteriore cicli (N) è 1/3 del numero di cicli in cui la reazione di qPCR raggiunto il plateau. Figura 2 fornisce esempi per tre librerie di ATAC-seq che raggiungessero plateau a ~ 2.350 unità relativa fluorescenza, RFU (linea verde spessa). Il numero di cicli PCR in cui un terzo dell'importo massimo (783 RFU, segnato sull'asse y) è amplificato corrisponde a 8 cicli per due delle librerie (curve di amplificazione rosso e blu) e 9 cicli PCR per la libreria terza (rosa).
3. L'amplificazione di PCR finale
   1. amplificare il restante 45 µ l della reazione PCR. Inserire un tubo PCR contenente la reazione di amplificazione dal punto 4.1.2 in un termociclatore. Eseguire il programma PCR descritto nella tabella 6. Utilizzare il numero di determinati in precedenza (punto 4.2.5) di cicli di amplificazione (N).

5. Taglia selezione delle biblioteche di ATAC-Seq

Nota: nella nostra esperienza, selezione della dimensione di amplificato ATAC-seq librerie migliora risultati di sequenziamento di nuova generazione perché Elimina frammenti di libreria ad alto peso molecolare dalla finale ATAC-seq biblioteca.
Nota: Lasciare i branelli magnetici a temperatura ambiente 30 min prima dell'uso.
Preparare fresco etanolo al 70% in acqua priva di nucleasi.

1. Risospendere i branelli magnetici mescolando.
2. Aggiungere acqua priva di nucleasi per le librerie di ATAC-seq (ottenute al punto 4.3.1.) e portare fino a 100 µ l.
3. Aggiungere 50 µ l (0.5 x) di sedimento biglie magnetiche di legame al DNA a 100 µ l di amplificato librerie. Mescolare pipettando su e giù almeno 10 volte. Incubare i campioni per 5 min a temperatura ambiente. Se necessario, ruota velocemente giù le microprovette.
4. Inserire il tubo su un appropriato supporto magnetico per 2 min separare i branelli magnetici dal surnatante. Dopo 2 minuti, trasferire il surnatante ad una nuova microprovetta.
5. Misurare il volume del surnatante pipettando e aggiungere 0,7 x di biglie magnetiche. Mix pipettando su e giù almeno 10 volte.
6. Incubare 5 min a temperatura ambiente. Posto su un supporto magnetico per 2 min.
7. Dopo il 2 min di incubazione, scartare il surnatante. Aggiungere 200 µ l preparata etanolo al 70% per lavare le perle mentre i tubi sono su supporto magnetico.
8. Tenere il conetti sul magnete per 30 s e poi scartare l'etanolo. Ripetere il passaggio 5.7.for due lavaggi di etanolo finale.
9. Rimuovere completamente le rimanenti etanolo e lasciare che asciugare all'aria le perline per 5 min mentre il tubo è sul magnete. Se necessario, girare brevemente nella microprovetta. Rimuovere le tracce di etanolo con una punta di pipetta p10.
10. Rimuovere la provetta dal magnete e 22 µ l di 10 mM Tris-HCl, pH 8. Non eluire le librerie di ATAC-seq in tampone contenente EDTA.
11. Incubare la provetta per 2 min a temperatura ambiente e poi mettete sul supporto magnetico.
12. Quando la soluzione è limpida, trasferire una nuova microprovette sterili 20 µ l di librerie eluite.
13. Store la dimensione selezionata ATAC-seq librerie a -20 ° C.

6. Analisi della qualità delle librerie ATAC-Seq

1. convalida della qualità dell'ATAC-seq librerie di Real-Time PCR
   Nota: è importante valutare il rapporto segnale-rumore delle librerie ATAC-seq prima della prossima generazione sequenziamento. Questo viene fatto determinando la relativa quantità di frammenti di DNA da loci accessibile e inaccessibili mediante PCR quantitativa (qPCR). I loci inaccessibili (controllo negativo, chr1:48, 137, 860-48,137,934 e chr1:193, 093, 748-193,093,827) sono amplificati da coppie di primer 1 e 2. I loci accessibili (controllo positivo, chr19:30, 336, 166-30,336,253 e chr19:11546154-11546237) sono amplificati da coppie di primer 3 e 4. Loci positivi e negativi sono stati definiti dai profili di accessibilità (DHS-seq) cromatina delle cellule CD4 + umane (ENCODE adesioni ENCSR000EQE ed ENCSR000EQG). Negativo iniettore 1 si trova in una grande regione intergenica heterochromatic (230 kb da TRADB2 e 88 kb da FOXD2). Regione di controllo negativo 2 è all'interno del primo introne del gene CDC73. A valle del gene di Cyclin E (CCNE1) mentre la coppia di primer positivo 4 positivo coppia di primer 3 è all'interno di una regione aperta della cromatina è centrato all'interno il promotore della proteina chinasi C substrato 80K-H (PRKCSH). D'importanza, questi loci di controllo mostrano un modello simile di accessibilità in altri tipi di cellule umane del progetto ENCODE ³, suggerendo che possono essere applicate per monitorare ATAC-seq librerie da un ampio spettro di tipi della cellula umana. Primer efficienza e specificità di tutte le coppie di primer è stata verificata da qPCR su una diluizione seriale di DNA genomic (da cellule umane Th) e un'analisi della curva di fusione dei prodotti amplificati ottenuti.
   1. Isolare DNA genomico utilizzando un disponibili in commercio kit (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature).
   2. Diluire l'ATAC-seq amplificato libreria 01:10 (1 µ l libreria + 9 µ l di acqua priva di nucleasi) e DNA genomico a ~ 5 ng / µ l.
   3. Preparare la miscela di reazione (tabella 7) per ogni coppia di primer di controllo positivi e negativi, tenendo conto che le reazioni vengono eseguite in triplice copia.
   4. Incubare in termociclatore qPCR secondo il protocollo consigliato dal fornitore di mix master qPCR.
   5. Analizzare i risultati in qPCR strumento ' software s (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature). Scegliere il DNA genomico come un campione di controllo. I valori ottenuti rappresentano un arricchimento delle regioni accessibili (amplificati di primer di controllo positivo). Un esempio è illustrato nella tabella 8.
      Nota: Stima della libreria di media dimensione e concentrazione: la distribuzione delle dimensioni dei frammenti del DNA dalle librerie di ATAC-seq è determinata dai sistemi automatizzati elettroforesi ad alta sensibilità secondo il produttore ' s istruzioni. Si consiglia di misurare la concentrazione del campione su un fluorometro utilizzando kit di dsDNA ad alta sensibilità e almeno 2 µ l di ciascun campione di DNA.
      Nota: Sequenziamento di nuova generazione - prima del funzionamento in multiplex le librerie, calcolare la molarità di ciascuna libreria di ATAC-seq utilizzando la formula: (ng / µ l x 10 ⁶) / (660 x libreria media frammento lunghezza). Obiettivo per > 30 milioni letture di ciascuna libreria di ATAC-seq per valutare la cromatina aperta regioni di campioni umani. Se si desidera determinare se la libreria è abbastanza buona per il sequenziamento NGS, inizialmente obiettivo per letture 10 milioni (5% della corsia di sequenziamento a strumento di sequenziamento del DNA in modalità di esecuzione rapida). Tenete a mente che per dedurre nucleosoma posizionamento, accoppiato-fine sequenziamento è necessaria ¹.

7. Analisi dei risultati di sequenziamento Next-Generation ottenuti

1. dedurre la qualità del sequenziamento legge controllando i file FastQC, separatamente per ogni libreria.
2. Allineare le letture al genoma umano riferimento (Assemblea hg19) utilizzando Bowtie ²¹ software in ambiente Unix/Linux. Il comando è ' bowtie -m 1 - q -S genoma directory reads.fastq output_aligned.sam '. Directory di genoma sta per la cartella dove sono memorizzati gli indici di genoma di Bowtie. Il parametro -m 1 è per non permettere che l'allineamento di letture per più di un locus nel genoma, - q è per il file di input che deve essere nel formato fastq -S è per l'output in formato SAM.
3. Rimuovere duplicate letture utilizzando SAMtools ²² rmdup opzione in ambiente Unix/Linux. I comandi sono ' samtools Mostra output_aligned.sam -b -S | samtools ordinare -o-output_aligned > output_aligned.bam ',
   samtools rmdup -s output_aligned.bam output_aligned _rmdup.bam '. Il primo comando, Visualizza, cambia il formato di SAM in formato BAM che viene quindi ordinata. L'opzione di rmdup è quindi applicato il file ordinato di BAM. Opzionalmente si possono regolare le letture per il sito di inserzione del trasposone, come descritto nell'originale carta di ATAC-seq ¹. Questa operazione viene eseguita utilizzando BEDtools i comandi ²³ in ambiente Unix/Linux. I comandi sono ' bamToBed -i output_aligned _rmdup.bam > output_aligned _rmdup.bed ', ' shiftBed -i genoma di output_aligned _rmdup.bed -p 4 - m-5 - g > output_aligned _rmdup_adjusted.bed '. Il primo comando, bamTobed, cambia il formato BAM in formato letto, che può quindi essere utilizzato per il comando di shiftBed. Il file di genoma è un file delimitato da tabulazioni che contiene la lunghezza di ciascun cromosoma nel genoma. Di solito viene aggiunto il file nella directory BEDtools.
4. Eseguire chiamate di picco mediante analisi basata su modello di ChIP-seq (MACS2) ²⁴ software nell'ambiente di Unix/Linux sul file letto spostato con i seguenti parametri: - nomodel - extsize 75-- spostamento -30. Questi parametri vengono utilizzati per regolare le letture, in modo che il sito di inserzione del trasposone è al centro di ogni lettura di sequenziamento.

Risultati

Il risultato finale di questo protocollo è una libreria di ATAC-seq di in genere 3-20 ng / µ l. Quando eseguito su un sistema per l'analisi dell'integrità del DNA (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature), essi mostrano la scala-come l'apparenza² (Figura 3A). La dimensione media dei frammenti del DNA è in genere ~ 450-530 bp.

Controllo di qualità adeguat...

Discussione

Il protocollo di ATAC-seq descritto qui è stato impiegato con successo per l'analisi della cromatina accessibile in cellule primarie (umano Th1, Th2 cellule e cellule di B) così come le linee di cellule in coltura (cellule di cancro al seno umane MCF10A e U261 le cellule di glioblastoma). L'applicazione di ATAC-seq per altri tipi di cellule può richiedere alcune ottimizzazione dei protocolli, soprattutto nel passaggio lisi. Se la concentrazione del detergente non ionico è troppo alto, potrebbe trattarsi di una percen...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL tubes	Lumitron	LUM-CFT011500-P	Can be from other vendors.
Microtubes	Axygen Inc	MCT-175-C	Can be from other vendors.
25 mL serological pipettes	Corning Costar	4489	Can be from other vendors.
Tissue culture flask	Lumitron	LUM-TCF-012-250-P	Can be from other vendors.
Countes Automated Cell Counter	Invitrogen	C10227
NucleoSpin Tissue	MACHEREY-NAGEL	740952.5
Peripheral blood mononuclear cells (PBMC)	ATCC	PCS­800­011	Can be from other vendors.
RPMI 1640 Medium	Biological Industries	01-103-1A	Can be from other vendors.
L-Glutamine Solution (200 mM)	Biological Industries	03-020-1B	Can be from other vendors.
Penicillin-Streptomycin	Biological Industries	03-031-1B	Can be from other vendors.
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated, European Grade	Biological Industries	04-127-1	Can be from other vendors.
MACS CD4 microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-101
MACS MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Anti-Human CD4 FITC	Biogems	06121-50
Mouse IgG1 Isotype Control FITC	Biogems	44212-50
Anti-Human CD3 (OKT3)	Tonbo biosciences	40-0037
Anti-Human CD28 SAFIRE Purified	Biogems	10311-25
Recombinant Human IL2	Peprotech	200-02
Recombinant Human IL4	Peprotech	200-04
Recombinant Human IL12 p70	Peprotech	200-12
In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2)	Tonbo	40-7048
LEAF Purified anti-human IFN-γ	BioLegend	506513
NaCl, analytical grade	Carlo Erba	479687	Can be from other vendors.
Magnesium chloride, Hexahydrate, molecular biology grade	Calbiochem	442611	Can be from other vendors.
EDTA	MP Biomedicals	800682	Can be from other vendors.
Tris, ultra pure, 99.9% pure	MP Biomedicals	819620	Can be from other vendors.
NP-40 alternative (Nonylphenyl Polyethylene Glycol)	Calbiochem	492016	Can be from other vendors.
Protease Inhibitors	Sigma	P2714	this protease inhibitor coctail is a powder. To make 100 x solution dilute in 1 mL of molecular-biology grade water.
Magnetic solid phase reverse immobilization beads: AMPure XP beads	Beckman	63881
PCR purification kit	HyLabs	EX-GP200	Can be from other vendors.
Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase and TD buffer)	Illumina	FC-121-1030
NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix	New England BioLabs	M0541
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix	New England BioLabs	M0543
SYBR Green I	Invitrogen	S7585
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	Bio-rad	185-5200	Can be from other vendors.
CFX Manager Software	Bio-rad	1845000
master mix for qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-rad	172-5124	Can be from other vendors.
Qubit fluorometer 2.0	Invitrogen	Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32854
Magnet for eppendorf tubes	Invitrogen	12321D	Can be from other vendors.
Swing bucket cooling centrifuge with the buckets for 15 mL falcon tubes and eppendorf tubes	Thermo Scientific	75004527	Could be from other vendors. It is important that it has buckets for eppendorf tubes.
Thermo-shaker	MRC		Can be from other vendors.
High Sensitivity D1000 ScreenTape	Agilent Technologies	5067-5584
High Sensitivity D1000 Reagents	Agilent Technologies	5067-5585
4200 TapeStation system	Agilent Technologies	G2991AA	Tape-based platform for  electrophoresis
High Sensitivity DNA kit	Agilent Technologies	5067-4626	Reagent for high-sensitivity TapeStation analysis
Primer name and sequence	Company
Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3'	IDT		Ad1-noMx: 5'-P5 sequence-transposase sequence-3'
Ad2.1_TAAGGCGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.1_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.2_CGTACTAG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.2_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.3_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
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