Mapeamento de genoma-larga acessível cromatina em linfócitos T humana primária pela ATAC-Seq

Resumo

Ensaio de cromatina Transposase-acessível, juntamente com o sequenciamento de alto rendimento (ATAC-seq) é um método de todo o genoma para descobrir a cromatina acessível. Este é um protocolo de ATAC-seq passo a passo, de molecular para última análise computacional, otimizada para linfócitos humanos (Th1/Th2). Este protocolo pode ser adotado por pesquisadores sem experiência prévia em métodos de sequenciamento de próxima geração.

Resumo

Ensaio para cromatina Transposase-acessível com arranjar em sequência do elevado-throughput (ATAC-seq) é um método usado para a identificação das regiões (acessíveis) abertas da cromatina. Essas regiões representam DNA elementos reguladores (por exemplo,promotores, melhoradores, regiões de controle de locus, isoladores) ao qual transcrição fatores bind. Mapeamento da paisagem de cromatina acessível é uma poderosa abordagem para descobrir elementos reguladores ativos através do genoma. Esta informação serve como uma abordagem imparcial para descobrir a rede de fatores de transcrição relevantes e mecanismos da estrutura da cromatina que regem os programas de expressão do gene. ATAC-seq é uma alternativa robusta e sensível à DNase eu análise de hipersensibilidade juntamente com a próxima geração sequenciamento (DNase-seq) e formaldeído-assistida isolamento de elementos reguladores (FAIRE-seq) para análise de todo o genoma da cromatina acessibilidade e para o sequenciamento de micrococcal nuclease sensíveis sites (MNase-seq) para determinar o posicionamento do nucleossoma. Apresentamos um protocolo detalhado de ATAC-seq otimizado para humano imune primária células ou seja, CD4 + linfócitos (T helper 1 (Th1) e células Th2). Este protocolo abrangente começa com a colheita da pilha, em seguida, descreve o procedimento molecular da cromatina tagmentation, preparação de amostras para sequenciamento de nova geração e também inclui métodos e considerações para as análises computacionais utilizadas para interprete os resultados. Além disso, para economizar tempo e dinheiro, introduzimos as medidas de controlo de qualidade para avaliar a biblioteca ATAC-seq antes de sequenciamento. Importante, os princípios apresentados neste protocolo permitem sua adaptação ao outro humanas imunes e não imune primária as células e linhas celulares. Estas orientações também será útil para os laboratórios que não são proficientes com métodos de sequenciamento de próxima geração.

Introdução

ATAC-seq^1,2 é um método robusto que permite a identificação de regiões de cromatina aberta regulamentar³ e posicionamento nucleossoma. Esta informação é aplicada para inferir a localização, identidade e atividade de fatores de transcrição. Sensibilidade do método para a medição quantitativas variações na estrutura da cromatina permite o estudo da atividade dos fatores de cromatina, incluindo empresas de reestruturação da cromatina e modificadores, bem como a atividade transcricional do RNA polimerase II¹. Assim, ATAC-seq fornece uma abordagem poderosa e imparcial para decifrar os mecanismos que regem o Regulamento transcriptional em qualquer tipo de célula de interesse. Descrevemos a adaptação da ATAC-seq para as células Th1 e Th2 humanas primárias.

Na ATAC-seq, hiperativo Tn5 transposase carregado com adaptadores para sequenciamento de próxima geração (NGS) fragmentação de DNA de casais com marcação de DNA com adaptadores (ou seja, o processo de "tagmentation")¹. Após amplificação por PCR, as bibliotecas de DNA resultantes estão prontas para a próxima geração sequenciamento (Figura 1). O tagmentation preferencial da cromatina acessível é detectado pela análise de enriquecimento local de leituras de sequenciamento ATAC-seq.

O procedimento experimental curto e exigência de menos matérias-primas, em relação a outros métodos para medir a acessibilidade da cromatina e posicionamento de partícula como de DNase-seq⁴, FAIRE-seq⁵e MNase-seq⁶, tem promoveu o uso de ATAC-seq em vários sistemas biológicos, incluindo células humanas primárias^1,7 e amostras clínicas⁸, bem como organismos unicelulares⁹, plantas¹⁰, moscas de fruta¹¹ e vários mamíferos¹².

A identidade da transcrição de fatores que estão ligados a loci acessível podem ser descobertos por analisar o enriquecimento de seus motivos de sequência de ligação ou combinando ATAC-seq com imunoprecipitação da cromatina (ChIP) seguida de alta produtividade (de sequenciamento de DNA ChIP-seq). Essa abordagem permitiu a identificação de fatores de transcrição de linhagem-específicos importantes para hematopoiese em rato¹³. A natureza global e imparcial da ATAC-seq permite estudar a regulação gênica em organismos para os quais reagentes tais como anticorpos para análise de ChIP não estão disponíveis. Por exemplo, evolutivas variações no cis-regiões reguladoras foram identificadas pelo estudo craniana crista neural células de seres humanos e os chimpanzés¹⁴, variações do desenvolvimento em elementos reguladores durante o início do mouse embriogénese¹⁵, mudanças na paisagem regulamentar durante um ciclo de vida de unicelulares owzarzaki c.⁹e a evolução dos promotores e potenciadores em toda espécie de mamífero 20¹².

ATAC-seq também tem sido fundamental para medir a acessibilidade de cromatina em células individuais, assim revelando variabilidade dentro das populações de células, que normalmente evita todo o genoma estudos^7,16. Além disso, a ATAC-seq pode ser usado para estudar as mudanças que ocorrem em regiões reguladoras de DNA em condições de doença, em que as amostras são raras. Por exemplo, a ATAC-seq pode ser usado para estudar as mudanças na paisagem regulamentar durante o início da leucemia mieloide aguda (LMA)¹⁷ ou Ras-conduzido mixomas¹¹.

Protocolo

todos os procedimentos foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional da Universidade Bar Ilan e o protocolo segue as orientações fornecidas pelo Comitê aprova os experimentos.

1. purificação da ingenuidade humana células CD4 + e polarização para T Helper 1 (Th1) e células Th2

Nota: Aqui descrevemos o procedimento a partir de células mononucleares de sangue periférico humano congelado (PBMC). O primeiro passo consiste em isolar as células CD4 + usando microbeads e colunas que normalmente dão-nos mais do que 95% das células CD4 +. No entanto, esta etapa pode variar de acordo com o protocolo preferido em cada laboratório. O protocolo para a ativação de células T e polarização foi modificado de Jenner et al (2009) ¹⁸. isolamento de CD4 + células de 10 milhões PBMCs dá origem a 4 milhões de células CD4 +. Eles são divididos em dois balões e cultivados em células Th1 e Th2 polarizador condições rendendo as células Th1 e Th2 3 milhões em apenas uma semana.

Nota: arrefecer o centrifugador a 4 ° C antes de iniciar.

1. Descongelar 1 mL de PBMC humano (10 ⁷ células) em um tubo de 50 mL contendo 10 mL de meio RPMI suplementado com 1% penicilina-estreptomicina, 2 mM L-glutamina e 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino. Centrifugar a 500 x g, durante 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender as células com uma pipeta estéril 25 mL em 15 mL de meio RPMI completado. Transferir as células (com pipeta estéril 25 mL) para um frasco de cultura T75.
2. Deixar as células durante a noite em uma incubadora umidificada (37 ° C, 5% CO ₂).
3. Transferir as células flutuantes com uma pipeta estéril 25 mL para tubo de 50 mL. Determinar o número de telemóvel e viabilidade pela exclusão trypan azul.
4. Células isolar CD4 + de 10 milhões vive não-aderente PBMC por selecção positiva usando colunas de acordo com o fabricante e CD4 + microbeads ' recomendações de s (veja a Tabela de materiais e equipamentos) com o seguinte modificações: 10 ⁷ PBMCs são rotulados com 30 µ l de CD4 microbeads em 120 µ l de BSA de 0,5% em PBS.
5. Ativar as células T CD4 + para 72 h por rhIL-2 (10 ng/mL), ligados a placa anti-CD3 (5 µ g/mL) e anti-CD28 solúvel (2 µ g/mL). Para a polarização Th1, adicione rhIL-12 (20 ng/mL) e anti-IL-4 (10 µ g/mL). Para a polarização de Th2, adicionar rhIL-4 (40 ng/mL) e anti-IFN-γ (10 µ g/mL).
6. Cultura de células para adicionais 7 dias na presença de rhIL-2 (10 ng/mL) e as mesmas citocinas polarizadores (rhIL-12 para Th1 e rhIL-4 para Th2).

2. Isolamento de núcleos

Nota: ATAC-seq é executada com núcleos intactos. Lise tampão contendo 0.05% nonilfenil polietilenoglicol (ver Tabela de materiais e equipamentos) foi calibrado para isolar núcleos de células Th1 e Th2 de humano primários. É recomendável calibrar este passo com os reagentes de laboratório e células. Um excesso de células intactas de insuficiente detergente diminui a eficiência da reação de transposição. Eficiência de lise celular é determinada pelo número de núcleos (células positivas de trypan azul) em relação ao número total de células.
Nota: Prepare o tampão de lise (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM de NaCl, 3 mM MgCl ₂). Arrefecer uma centrífuga com um rotor de balanço-balde de 4 ° C. as células em uma centrífuga de balanço-balde em vez de uma centrífuga de ângulo fixo de granulação reduz a perda de células/núcleos. Para evitar núcleos ou perda de celular, pipeta com cuidado ao descartar o sobrenadante.

1. Adicionar nonilfenil fresco polietilenoglicol (para obter uma concentração final de 0.05%) e 100 x inibidores de protease (para obter uma concentração final de 1-x) para o frio do lysis imediatamente antes do uso. Mantenha o buffer no gelo
2. Células Count T para determinar sua quantidade e viabilidade usando trypan azul método. Viabilidade que seja inferior a 90% de resultados na maior digestão específico.
3. Transferência de 0,5 x 10 ⁶ T células (células Th1 ou Th2) para microtubos de 1,5 mL. Girar para baixo a 500 x g por 5 min a 4 ° C.
4. Ressuspender as células em 1 mL de tampão fosfato salino (PBS) solução fria. Girar para baixo a 500 x g por 5 min a 4 ° C.
5. Ressuspender as células em 1 mL de tampão de Lise fria (contendo nonilfenil polietileno glicol e inibidores da protease). Mantenha o tubo no gelo. Pipeta suavemente para não perturbar os núcleos.
6. , Rapidamente, Pegue 10 µ l e conte as células com um contador de célula automatizada enquanto o microtubo com lisados células está no gelo. Esta etapa não deve exceder cinco minutos para não danificar os núcleos. Pelo menos 80% das células deve ser lysed.
7. Continuar imediatamente com a reação de transposição. Manter os núcleos preparados sobre o gelo

3. Reação de transposição

Nota: nesta etapa, núcleos isolados são incubados com procarióticas Tn5 transposase (TDE1) carregado com adaptadores para sequenciamento NGS. Tn5 hiperativo, simultaneamente, fragmentos de DNA e ligates adaptadores em acessíveis regiões do genoma (processo tagmentation). A relação entre núcleos e Tn5 transposase é crítica para clivagem preferencial na cromatina acessível. Este protocolo é calibrado para 100.000 núcleos em um volume de reação de 100 μL. No entanto, a reação pode ser escalada para baixo.

1. Definir a temperatura em uma coqueteleira térmica a 37 ° C.
2. Núcleos de 100.000 transferir para um microtubo de 1,5 mL.
3. Centrifugar 500 x g por 10 min a 4 ° C e delicadamente Retire o sobrenadante.
4. Adicionar os componentes de reação de transposição para os núcleos especificados no quadro 1.
5. Resuspenda pipetando gentil.
6. Incubar a reação de transposição em uma coqueteleira térmica a 37 ° C por 30 min com leve agitação (500 rpm).
   Nota: A limpeza de DNA é executada por fase sólida reversível imobilização grânulos ¹⁹ (ver Tabela de materiais e equipamentos) ou colunas de purificação do PCR. No final da limpeza, eluir os fragmentos de DNA em 20 µ l de 10 mM Tris-HCl, pH 8. Evitar o EDTA no buffer de eluição.

4. Enriquecimento de PCR das bibliotecas ATAC-seq

Nota: esta etapa destina-se a amplificar os ATAC-seq biblioteca ou seja, fragmentos de DNA com adaptadores inseridos. Para permitir a mistura de várias bibliotecas de ATAC-seq na pista mesmo sequenciamento de nova geração (" multiplexação ") uso unindexed Primer 1 (Ad1_noMx) ¹ para todas as amostras, e uma diferente indexados (código de barras) 2 Primer (Ad 2.1-2,24) ¹ para cada amostra. As sequências de primeira demão são fornecidas no complementado Tabela de materiais e equipamentos.

1. Amplificação por PCR inicial
   Nota: A concentração de trabalho de Primer 1 (Ad1_noMx) e Primer 2 é de 25 µM. Todos os primers são diluídos do estoque original de 100 µM para 25 µM. Em todas as reações de PCR, use Primer 1 (Ad1_noMx) e apenas um do indexado 2 Primer.
   1. Adicionar os componentes da reação de PCR como especificado na tabela 2, a um tubo estéril de PCR.
   2. Lugar PCR do tubo em um termociclador e realizar a amplificação por PCR usando as ciclismo condições detalhadas na tabela 3.
2. Avaliação do número de ciclos de amplificação adicional
   Nota: O número de ciclos PCR adicionais deve produzir quantidade suficiente de biblioteca fragmentos fou um sequenciamento de próxima geração bem sucedido executado, enquanto minimizado para evitar GC e dimensionar o viés ²⁰. A determinação do número de ciclos PCR (N) necessário para amplificação de fragmento de biblioteca ideal é feita por PCR quantitativo (qPCR).
   1. Diluir 1 de Primers (Ad1_noMx) e 2 (usado para a amplificação da biblioteca inicial) de 25 µM a 6,25 µM.
   2. Adicionar os componentes ópticos da polimerase ou uma placa, como indicado na tabela 4.
   3. Lugar em um instrumento de qPCR e ciclo como especificado no quadro 5.
   4. Para estimar o número necessário de ciclos de amplificação adicional (N), lote número de ciclo sobre o eixo x e a fluorescência relativa (RFU) no eixo y.
   Ciclos de
   5. o número de amplificação adicional (N) é 1/3 do número de ciclos em que a reação de qPCR alcançado o planalto. a Figura 2 fornece exemplos para três bibliotecas ATAC-seq patamar no ~ 2.350 unidades de fluorescência relativo, RFU (linha grossa verde). O número de ciclos PCR, em que um terço da quantidade máxima (RFU 783, marcado no eixo y) é amplificado corresponde a 8 ciclos por duas das bibliotecas (curvas de amplificação de vermelho e azul) e 9 ciclos PCR para a biblioteca de terceiro (rosa).
3. Amplificação por PCR final
   1. amplificar o restante µ 45 l da reação de PCR. Coloque um tubo PCR contendo a reação de amplificação da etapa 4.1.2 em um termociclador. Execute o programa PCR descrito na tabela 6. Use o número de ciclos de amplificação (N) previamente determinado (etapa 4.2.5).

5. Seleção de ATAC-Seq bibliotecas do tamanho

Nota: na nossa experiência, seleção de tamanho de amplificado ATAC-seq bibliotecas melhora os resultados de sequenciamento de próxima geração porque elimina fragmentos de biblioteca de alto peso molecular da final biblioteca ATAC-seq.
Nota: Permitir que os grânulos magnéticos aquecer a temperatura ambiente 30 min antes do uso.
Prepare-se fresco 70% de etanol em água livre de nuclease.

1. Resuspenda os grânulos magnéticos misturando.
2. Adicionar água nuclease-livre para as bibliotecas de ATAC-seq (obtidas na etapa 4.3.1.) e levar até 100 µ l.
Adicionar 50 µ l de
3. (0.5 x) de ressuspensão grânulos magnéticos do DNA-ligando a 100 µ l de bibliotecas amplificadas. Misture pipetando para cima e para baixo pelo menos 10 vezes. Incube as amostras por 5 min à temperatura ambiente. Se necessário, girar rapidamente para baixo os microtubos.
4. Colocar o tubo em um carrinho magnético apropriado por 2 min separar as esferas magnéticas do sobrenadante. Depois de 2 min, transfira o sobrenadante para um microtubo novo.
5. Medir o volume do líquido sobrenadante pipetando e adicionar 0,7 x de grânulos magnéticos. Mix pipetando para cima e para baixo pelo menos 10 vezes.
6. Incubar 5 min à temperatura ambiente. Lugar num suporte magnético para 2 min.
7. Após o 2 min incubação, desprezar o sobrenadante. Adicionar 200 µ l acabadas etanol a 70% para lavar os grânulos quando os tubos forem depor magnético.
8. Manter o microtubo sobre o ímã por 30 s e depois descartar o etanol. Repita a etapa 5.7.for duas lavagens de etanol final.
9. Remover completamente o restante do etanol e deixe que os grânulos secar ao ar por 5 min enquanto o tubo é sobre o ímã. Se necessário, gire brevemente o microtubo. Remover os vestígios de álcool etílico com uma ponta de pipeta p10.
10. Remover o microtubo de ímã e adicione 22 µ l de 10 mM Tris-HCl, pH 8. Não eluir as ATAC-seq bibliotecas em tampão contendo EDTA.
11. Incubar o tubo para 2 min à temperatura ambiente e coloque sobre o suporte magnético.
12. Quando a solução é clara, 20 µ l de eluted bibliotecas de transferência para um novo microtubo estéril.
13. Loja do tamanho selecionado ATAC-seq bibliotecas em -20 ° C.

6. Análise da qualidade das bibliotecas ATAC-Seq

1. validação da qualidade da ATAC-seq bibliotecas por PCR em tempo real
   Nota: é importante avaliar a relação sinal / ruído das bibliotecas ATAC-seq antes da próxima geração sequenciamento. Isso é feito, determinando a quantidade relativa de fragmentos de DNA de loci acessível e inacessível usando PCR quantitativo (qPCR). Os loci inacessível (controlo negativo, chr1:48, 137, 860-48,137,934 e chr1:193, 093, 748-193,093,827) são amplificados por pares da primeira demão, 1 e 2. Os loci acessível (controle positivo, chr19:30, 336, 166-30,336,253 e chr19:11546154-11546237) são amplificados por pares da primeira demão, 3 e 4. Positivos e negativos de loci foram definidos a partir de perfis de acessibilidade (DHS-seq) cromatina das células humanas CD4 + (ENCODE adesões ENCSR000EQE e ENCSR000EQG). Primeira demão negativo 1 situa-se em uma grande região intergênica heterocromático (230 kb de TRADB2 e 88 kb de FOXD2). Região de controle negativo, 2 é dentro o primeiro intron do gene CDC73. Positivo par de primer 3 está dentro de uma região de cromatina aberta a jusante do gene E Cyclin (CCNE1) ao par de primer positivo 4 é centralizada dentro do promotor da proteína quinase C substrato 80K-H (PRKCSH). Importante, estes loci de controle mostra um padrão semelhante de acessibilidade em outros tipos de células humanas do ENCODE projeto ³, sugerindo que eles podem ser aplicados para monitorar ATAC-seq bibliotecas de um amplo espectro de tipos de células humanas. Cartilha eficiência e especificidade de todos os pares da primeira demão foi verificado por qPCR em uma diluição serial do DNA genômico (a partir de células humanas de Th) e uma análise de curva derretimento dos obtidos produtos amplificados.
   1. Isolar o DNA genômico, usando um comercialmente disponível kit (veja a Tabela de materiais e equipamentos).
   2. Diluir o ATAC-seq amplificado biblioteca 01:10 (1 µ l biblioteca + 9 µ l de água livre de nuclease) e o DNA genômico de ~ 5 ng / µ l.
   3. Preparar a mistura de reacção (tabela 7) para cada par de primer de controlo positivo e negativo, tendo em conta que as reações são realizadas em triplicata.
   4. Incubar em termociclador qPCR, de acordo com o protocolo recomendado pelo fornecedor de mestre mistura qPCR.
   5. Analisar os resultados em instrumento de qPCR ' software s (consulte a Tabela de materiais e equipamentos). Escolha o DNA genômico como uma amostra de controle. Os valores obtidos representam um enriquecimento das regiões acessíveis (amplificados pelos iniciadores de controle positivo). Um exemplo é mostrado na tabela 8.
      Nota: Estimativa do tamanho médio de biblioteca e concentração: a distribuição de tamanho de fragmentos de DNA de bibliotecas ATAC-seq é determinada por sistemas automatizados electroforese de alta sensibilidade, de acordo com o fabricante ' instruções s. É aconselhável medir a concentração da amostra em um dados usando o kit de alta sensibilidade de dsDNA e pelo menos 2 µ l de cada amostra de DNA.
      Nota: Sequenciamento de próxima geração - antes da multiplexação as bibliotecas, calcule a molaridade de cada biblioteca ATAC-seq usando a fórmula: (ng / µ l x 10 ⁶) / (comprimento do fragmento de 660 x biblioteca média). Mire > 30 milhões leituras de cada biblioteca ATAC-seq para avaliar aberta da cromatina regiões de amostras humanas. Se você quiser determinar se a biblioteca é bom o suficiente para o sequenciamento de NGS, inicialmente, Mire lê 10 milhões (5% da faixa de sequenciamento em instrumento de sequenciamento de DNA no modo de execução rápido). Tenha em mente que para inferir nucleossoma posicionamento, sequenciamento emparelhado-final é necessário ¹.

7. Análise dos resultados obtidos Next-Generation sequenciamento

1. inferir a qualidade do sequenciamento diz inspecionando os arquivos FastQC, separadamente para cada biblioteca.
2. Alinhar o lê a referência humana do genoma (conjunto hg19) usando Bowtie ²¹ software em ambiente Unix/Linux. O comando é ' bowtie -m 1 - q -S genoma diretório reads.fastq output_aligned.sam '. Diretório de genoma representa a pasta onde os índices de genoma de gravata são armazenados. O parâmetro -m 1 é para não permitir o alinhamento de leituras para mais de um locus no genoma, - q é para o arquivo de entrada deve estar no formato fastq, destina-se a saída que está no formato de SAM -S.
3. Remover duplicadas leituras usando SAMtools ²² rmdup opção no ambiente Unix/Linux. Os comandos são ' samtools Ver os output_aligned.sam -b -S | samtools classificar -o-output_aligned > output_aligned.bam ',
   samtools rmdup -s output_aligned.bam output_aligned _rmdup.bam '. O primeiro comando, vista, altera o formato de SAM em formato BAM, que é então classificado. A opção de rmdup é então aplicada sobre o arquivo BAM classificado. Opcionalmente, um pode ajustar as leituras para o local de inserção do transposon, conforme descrito na ATAC-seq original papel ¹. Isso é feito usar BEDtools comandos ²³ no ambiente Unix/Linux. Os comandos são ' bamToBed -i output_aligned _rmdup.bam > output_aligned _rmdup.bed ', ' shiftBed -i output_aligned genoma do _rmdup.bed -p - m-5 - 4G > output_aligned _rmdup_adjusted.bed '. O primeiro comando, bamTobed, altera o formato BAM em formato de cama, que pode ser usado para o comando shiftBed. O arquivo do genoma é um arquivo delimitado por tabulação que contém o comprimento de cada cromossomo no genoma. O arquivo é adicionado geralmente no diretório BEDtools.
Chamada de pico
4. Executar usando análise baseada em modelo de ChIP-seq (MACS2) ²⁴ software no ambiente Unix/Linux no arquivo deslocado de cama, com os seguintes parâmetros: - nomodel - extsize 75-- shift -30. Esses parâmetros são usados para ajustar as leituras para que o local de inserção do transposon é no meio de cada leitura do sequenciamento.

Resultados

O resultado final do presente protocolo é uma biblioteca de ATAC-seq de normalmente 3-20 ng / µ l. Quando executado em um sistema para análise de integridade de DNA (ver Tabela de materiais e equipamentos), eles mostram a escada-como a aparência² (Figura 3A). O tamanho médio dos fragmentos de DNA é tipicamente ~ 450-530 bp.

Controle de qualidade adequad...

Discussão

O protocolo de ATAC-seq descrito aqui tem sido empregado com sucesso para a análise da cromatina acessível em células primárias (humano Th1, Th2 pilhas e pilhas de B) bem como as linhas de células cultivadas (células de câncer de mama humano MCF10A e células de glioblastoma U261). Aplicação de ATAC-seq para outros tipos de células pode exigir alguma otimização de protocolo, especialmente na etapa de Lise. Se a concentração de detergente não-iônico é muito alta, pode haver um maior percentual de contamin...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL tubes	Lumitron	LUM-CFT011500-P	Can be from other vendors.
Microtubes	Axygen Inc	MCT-175-C	Can be from other vendors.
25 mL serological pipettes	Corning Costar	4489	Can be from other vendors.
Tissue culture flask	Lumitron	LUM-TCF-012-250-P	Can be from other vendors.
Countes Automated Cell Counter	Invitrogen	C10227
NucleoSpin Tissue	MACHEREY-NAGEL	740952.5
Peripheral blood mononuclear cells (PBMC)	ATCC	PCS­800­011	Can be from other vendors.
RPMI 1640 Medium	Biological Industries	01-103-1A	Can be from other vendors.
L-Glutamine Solution (200 mM)	Biological Industries	03-020-1B	Can be from other vendors.
Penicillin-Streptomycin	Biological Industries	03-031-1B	Can be from other vendors.
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated, European Grade	Biological Industries	04-127-1	Can be from other vendors.
MACS CD4 microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-101
MACS MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Anti-Human CD4 FITC	Biogems	06121-50
Mouse IgG1 Isotype Control FITC	Biogems	44212-50
Anti-Human CD3 (OKT3)	Tonbo biosciences	40-0037
Anti-Human CD28 SAFIRE Purified	Biogems	10311-25
Recombinant Human IL2	Peprotech	200-02
Recombinant Human IL4	Peprotech	200-04
Recombinant Human IL12 p70	Peprotech	200-12
In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2)	Tonbo	40-7048
LEAF Purified anti-human IFN-γ	BioLegend	506513
NaCl, analytical grade	Carlo Erba	479687	Can be from other vendors.
Magnesium chloride, Hexahydrate, molecular biology grade	Calbiochem	442611	Can be from other vendors.
EDTA	MP Biomedicals	800682	Can be from other vendors.
Tris, ultra pure, 99.9% pure	MP Biomedicals	819620	Can be from other vendors.
NP-40 alternative (Nonylphenyl Polyethylene Glycol)	Calbiochem	492016	Can be from other vendors.
Protease Inhibitors	Sigma	P2714	this protease inhibitor coctail is a powder. To make 100 x solution dilute in 1 mL of molecular-biology grade water.
Magnetic solid phase reverse immobilization beads: AMPure XP beads	Beckman	63881
PCR purification kit	HyLabs	EX-GP200	Can be from other vendors.
Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase and TD buffer)	Illumina	FC-121-1030
NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix	New England BioLabs	M0541
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix	New England BioLabs	M0543
SYBR Green I	Invitrogen	S7585
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	Bio-rad	185-5200	Can be from other vendors.
CFX Manager Software	Bio-rad	1845000
master mix for qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-rad	172-5124	Can be from other vendors.
Qubit fluorometer 2.0	Invitrogen	Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32854
Magnet for eppendorf tubes	Invitrogen	12321D	Can be from other vendors.
Swing bucket cooling centrifuge with the buckets for 15 mL falcon tubes and eppendorf tubes	Thermo Scientific	75004527	Could be from other vendors. It is important that it has buckets for eppendorf tubes.
Thermo-shaker	MRC		Can be from other vendors.
High Sensitivity D1000 ScreenTape	Agilent Technologies	5067-5584
High Sensitivity D1000 Reagents	Agilent Technologies	5067-5585
4200 TapeStation system	Agilent Technologies	G2991AA	Tape-based platform for  electrophoresis
High Sensitivity DNA kit	Agilent Technologies	5067-4626	Reagent for high-sensitivity TapeStation analysis
Primer name and sequence	Company
Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3'	IDT		Ad1-noMx: 5'-P5 sequence-transposase sequence-3'
Ad2.1_TAAGGCGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.1_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.2_CGTACTAG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.2_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.3_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.4_TCCTGAGC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.4_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.5_GGACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.5_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.6_TAGGCATG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.6_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
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