Mapping genomweite zugänglich Chromatin in primären menschlichen T-Lymphozyten durch ATAC-Seq

Zusammenfassung

Test für Transposase zugänglichen Chromatin gepaart mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (ATAC-Seq) ist eine genomweite Methode zugänglich Chromatin aufzudecken. Dies ist ein Schritt für Schritt ATAC-Seq-Protokoll von molekularen bis die abschließende computergestützte Analyse, optimiert für menschlichen Lymphozyten (Th1/Th2). Dieses Protokoll kann von Wissenschaftlern ohne Vorkenntnisse in Next Generation Sequencing Methoden übernommen werden.

Zusammenfassung

Test für Transposase zugänglichen Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (ATAC-Seq) ist eine Methode zur Identifizierung von offenen (zugänglich) Regionen des Chromatins. Diese Regionen sind regulatorische DNA-Elemente (z.B., Promotoren, Enhancer, Locus Kontrollregionen, Isolatoren), welche, die Transkription Faktoren binden. Mapping der zugänglichen Chromatin-Landschaft ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Aufdeckung aktive regulatorische Elemente über das Genom. Diese Informationen dienen als eine unvoreingenommene Ansatz für die Entdeckung, das Netz der relevanten Transkriptionsfaktoren und Mechanismen der Chromatinstruktur, die Genprogramme Ausdruck zu regieren. ATAC-Seq ist eine robuste und sensible Alternative zu DNase ich Überempfindlichkeit Analyse gepaart mit Next Generation Sequencing (DNase-Seq) und Formaldehyd-gestützte Isolation der regulatorischen Elemente (Jahrmarkt-Seq) für genomweite Analyse von Chromatin Zugänglichkeit und die Sequenzierung von micrococcal Nuklease-Sensitive Websites (MNase-Seq) Nukleosom Positionierung zu bestimmen. Wir präsentieren Ihnen ein detailliertes ATAC-Seq-Protokoll optimiert für menschliche primäre d.h. CD4 +-Lymphozyten Immunzellen (T-Helfer 1 (Th1) und Th2-Zellen). Dieses umfassende Protokoll beginnt mit Zellernte, dann beschreibt das molekulare Verfahren von Chromatin Tagmentation, Probenvorbereitung für die Sequenzierung der nächsten Generation, und auch Methoden und Überlegungen für die computergestützten Analysen verwendet, um interpretieren Sie die Ergebnisse. Um Zeit und Geld zu sparen, haben wir darüber hinaus eingeführt Qualitätskontrollmaßnahmen zur Bewertung der ATAC-Seq-Bibliothek vor der Sequenzierung. Wichtig ist, erlauben die Grundsätze, die in diesem Protokoll präsentiert seine Anpassung an anderen menschlichen immun- und nicht-immunen Primärzellen und Zell-Linien. Diese Richtlinien werden auch nützlich für Labore die nicht geübt im Umgang mit Next Generation Sequencing-Methoden sind.

Einleitung

ATAC-Seq^1,2 ist eine robuste Methode, die Ermittlung der regulatorischen³ offene Chromatin Regionen und Nukleosom Positionierung ermöglicht. Diese Information gilt für ableiten, die Lage, die Identität und die Aktivität von Transkriptionsfaktoren. Die Methode Empfindlichkeit zur Messung der quantitative Abweichungen in Chromatinstruktur ermöglicht die Untersuchung der Aktivität von Chromatin Faktoren, einschließlich Chromatin Remodelers und Modifikatoren sowie die transkriptionelle Aktivität der RNA-Polymerase II¹. ATAC-Seq bietet somit einen leistungsstarke und unvoreingenommenen Ansatz für die Entschlüsselung der Mechanismen, die transkriptionelle Regulierung in jeden Zelltyp des Interesses zu regieren. Wir beschreiben die Anpassung der ATAC-Seq an primären menschlichen Th1 und Th2-Zellen.

ATAC-Seq geladen hyperaktiven Tn5 Transposase mit Adaptern für Next Generation Sequencing (NGS) Paare DNA-Fragmentierung mit tagging von DNA mit Adaptern (d.h. der Prozess "Tagmentation")¹. Nach PCR-Amplifikation sind die daraus resultierenden DNA-Bibliotheken bereit für Next Generation Sequencing (Abbildung 1). Die bevorzugte Tagmentation von zugänglich Chromatin wird durch die Analyse der lokalen Bereicherung der ATAC-Seq Sequenzierung liest erkannt.

Die kurze Versuchsdurchführung und Voraussetzung für weniger Ausgangsmaterial, im Vergleich zu anderen Methoden zur Messung von Chromatin Zugänglichkeit und nucleosomal Positionierung z. B. DNase-Seq⁴und FAIRE Seq⁵MNase-Seq⁶, hat die Verwendung von ATAC-Seq in mehrere biologische Systeme, einschließlich menschliche Primärzellen^1,7 und klinischen Proben⁸, sowie Einzeller⁹, Pflanzen¹⁰, Fruchtfliegen^{11 gefördert} , und verschiedene Säugetiere¹².

Die Identität der Transkription, die Faktoren, die an zugänglich Loci gebunden sind durch Analyse der Anreicherung von ihrer Bindung Sequenzmotive oder Kombination von ATAC-Seq mit Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) gefolgt von Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung (aufgedeckt werden können ChIP-seq). Dieser Ansatz ermöglicht die Identifizierung von Geschlecht-spezifische Transkriptionsfaktoren wichtig für die Blutbildung Maus¹³. Die unvoreingenommene und globale Natur der ATAC-Seq ermöglicht Studium der Genregulation in Organismen für die Reagenzien wie Antikörper gegen ChIP-Analyse nicht verfügbar sind. Z. B. evolutionäre Variationen in Cis-regulatorische Regionen wurden durch das Studium der kranialen Neuralleiste Zellen von Menschen und Schimpansen¹⁴, Entwicklungsstörungen Variationen in regulatorischen Elemente während der frühen Maus Embryogenese¹⁵, ändert in der regulatorischen Landschaft während einer Lebensdauer von einzelligen C. Owzarzaki⁹und die Entwicklung der Promotoren und Enhancer über 20 Säugetier Arten¹².

ATAC-Seq war auch maßgeblich für die Messung von Chromatin Barrierefreiheit in Einzelzellen, so aufschlussreich Variabilität innerhalb Zell-Populationen, die in der Regel genomweite Studien^7,16entzieht. ATAC-Seq kann darüber hinaus verwendet werden, um Veränderungen zu studieren, die in regulatorischen Regionen der DNA in Erkrankungen, auftreten, in denen Proben selten sind. Z. B. ATAC-Seq kann verwendet werden, um Veränderungen im regulatorischen Umfeld zu studieren, während der Beginn der akuten myeloischen Leukämie (AML)¹⁷ oder Ras-Onkogenese¹¹angetrieben.

Protokoll

alle Verfahren wurden von institutionellen Review Board der Bar-Ilan-Universität angenommen und das Protokoll folgt den Richtlinien des Ausschusses zur Genehmigung der Experimente zur Verfügung gestellt.

1. Reinigung von naiven CD4 + Zellen und Polarisation zu T-Helfer-1 (Th1) und Th2-Zellen

Hinweis: hier beschreiben wir die Vorgehensweise, die gefrorenen menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) ab. Der erste Schritt besteht aus CD4 + Zellen mittels Microbeads zu isolieren und Spalten in der Regel geben uns mehr als 95 % der CD4 +-Zellen. Dieser Schritt kann jedoch nach dem bevorzugten Protokoll in jeder Übungseinheit variieren. Das Protokoll für T-Zell-Aktivierung und Polarisation wurde von Jenner Et Al. modifiziert. (2009) ¹⁸. Isolation der CD4 +-Zellen von 10 Millionen PBMCs gibt Anlass zu 4 Millionen der CD4 +-Zellen. Sie sind aufgeteilt in zwei Fläschchen und angebaut unter Th1 und Th2 polarisierenden Bedingungen nachgiebige 3 Millionen Th1 und Th2-Zellen innerhalb nur einer Woche.

Hinweis: Abkühlen der Zentrifuge auf 4 ° C vor.

1. Tauen 1 mL der menschlichen PBMCs (10 ⁷ Zellen) in ein 50 mL-Tube mit 10 mL RPMI Medium mit 1 % Penicillin-Streptomycin, 2 mM L-Glutamin und 10 % Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum ergänzt. Zentrifugieren bei 500 X g für 5 min. Überstands entfernen und die Zellen mit einer sterilen 25 mL-Pipette in 15 mL ergänzt RPMI Medium aufzuwirbeln. Die Zellen (mit sterilen 25-mL-Pipette) auf einem T75 Kultur Kolben übertragen.
2. Lassen die Zellen über Nacht in einem befeuchteten Inkubator (37 ° C, 5 % CO ₂).
3. Übertragen die schwimmenden Zellen mit einer sterilen 25 mL-Pipette auf 50 mL-Tube. Zellzahl und Lebensfähigkeit durch Trypan blau Ausgrenzung bestimmen.
4. Isolieren CD4 +-Zellen von 10 Millionen Leben nicht-anhaftende PBMCs durch positive Selektion mit CD4 + Microbeads und Spalten nach Angaben des Herstellers ' s Empfehlungen (siehe Tabelle der Materialien/Geräte) mit den folgenden Modifikationen: 10 ⁷ PBMCs sind beschriftet mit 30 µL CD4 Microbeads in 120 µL 0,5 % BSA in PBS.
5. Aktivieren der CD4 + T-Zellen für 72 h RhIL-2 (10 ng/mL), Platte gebundene Anti-CD3 (5 µg/mL) und lösliche Anti-CD28 (2 µg/mL). Fügen Sie für Th1 Polarisation RhIL-12 (20 ng/mL) und Anti-IL-4 (10 µg/mL). Für Th2 Polarisation, fügen RhIL-4 (40 ng/mL) und Anti-IFN-γ (10 µg/mL).
6. Kultur der Zellen für weitere 7 Tage im Beisein von RhIL-2 (10 ng/mL) und die gleichen polarisierende Zytokine (RhIL-12 für Th1 und Th2 RhIL-4).

2. Kerne Isolation

Hinweis: ATAC-Seq erfolgt mit intakten Zellkernen. Lyse Puffer mit 0,05 % Nonylphenyl Polyethylenglykol wurde (siehe Tabelle der Materialien/Geräte) für die Isolierung von Kernen aus primären menschlichen Th1 und Th2-Zellen kalibriert. Es wird empfohlen, diesen Schritt mit den Laborreagenzien und Zellen zu kalibrieren. Ein Übermaß an intakten Zellen von nicht genügend Reinigungsmittel verringert die Effizienz der Umsetzung Reaktion. Lyse Zelleffizienz richtet sich nach der Anzahl der Kerne (Trypan blau positive Zellen) bezogen auf die Gesamtzahl der Zellen.
Hinweis: Bereiten Sie die Lyse-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl ₂). Abkühlen, eine Zentrifuge mit einem Swing-Eimer-Rotor bis 4 ° c die Zellen in einer Swing-Eimer-Zentrifuge anstelle einer festen Winkel Zentrifuge Pelletierung Zellkerne/Verlust reduziert. Zellkerne oder Zellverlust, Pipettieren sorgfältig, wenn den Überstand verwerfen zu vermeiden.

1. Add frischen Nonylphenyl Polyethylenglykol (um eine Endkonzentration von 0,05 %) und 100 x Protease-Inhibitoren (um eine Endkonzentration von 1 X) auf den kalten Lyse Puffer unmittelbar vor der Anwendung. Halten Sie den Puffer auf Ice
2. Graf T-Zellen, und ihre Lebensfähigkeit Trypan blau-Methode bestimmen. Rentabilität, die niedriger ist als 90 % ergibt höhere unspezifische Verdauung.
3. Übertragung 0,5 x 10 ⁶ T Zellen (Th1 oder Th2) 1,5 mL Mikroröhrchen. Spin-down bei 500 X g für 5 min bei 4 ° c
4. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL kalte Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Lösung. Spin-down bei 500 X g für 5 min bei 4 ° c
5. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL kalte Lyse Puffer (mit Nonylphenyl Polyethylenglykol und Protease-Inhibitoren). Halten Sie das Rohr auf dem Eis. Pipette vorsichtig, um nicht zu stören die Kerne.
6. Schnell 10 µL und die Zellen mit einem automatisierten Zelle Zähler zählen, während die Reaktionscup mit lysierten Zellen auf dem Eis ist. Dieser Schritt sollte fünf Minuten zur Vermeidung von Schäden die Kerne nicht überschreiten. Sollte mindestens 80 % der Zellen lysiert werden.
7. Weiter sofort mit der Umsetzung-Reaktion. Halten Sie die vorbereitete Kerne auf der Ice

3. Umsetzung Reaktion

Hinweis: In diesem Schritt sind isolierte Kerne mit prokaryotischen Tn5 Transposase (TDE1) beladen mit Adapter für die Sequenzierung von NGS inkubiert. Hyperaktiv Tn5 gleichzeitig DNA-Fragmente und ligates Adapter in zugänglichen Bereichen des Genoms (Tagmentation Verfahren). Das Verhältnis zwischen Kernen und Tn5 Transposase ist entscheidend für bevorzugte Spaltung an zugänglich Chromatin. Dieses Protokoll ist für 100.000 Kerne in einer 100 μl Reaktionsvolumen kalibriert. Jedoch kann die Reaktion nach unten skaliert werden.

1. Stellen Sie Temperatur in einem thermischen Shaker auf 37 ° c
2. Transfer 100.000 Kerne auf einem 1,5 mL Reaktionscup.
3. Zentrifuge bei 500 X g für 10 min bei 4 ° C und sanft entfernen des Überstands.
4. Den Kernen als gemäß Tabelle 1 die Umsetzung Reaktionskomponenten hinzufügen.
5. Durch sanfte Pipettieren Aufschwemmen.
6. Brüten die Umsetzung Reaktion in einem thermischen Shaker bei 37 ° C für 30 min mit sanften Zittern (500 u/min).
   Hinweis: DNA-Bereinigung erfolgt durch reversible Immobilisierung Festphasen-Perlen ¹⁹ (siehe Tabelle der Materialien/Geräte) oder PCR-Reinigung-Spalten. Am Ende der Reinigung eluieren Sie die DNA-Fragmente in 20 µL 10 mM Tris-HCl, pH 8. Vermeiden Sie EDTA in der Elution Buffer.

4. PCR-Bereicherung der ATAC-Seq Bibliotheken

Hinweis: Diese Schritt zielt darauf ab, die ATAC-Seq Bibliothek z. B. DNA-Fragmente mit eingefügten Adapter zu verstärken. Ermöglichen, Mischen mehrerer ATAC-Seq-Bibliotheken in der gleichen Spur Next Generation Sequencing (" multiplexing ") Nutzung nichtindizierte Primer 1 (Ad1_noMx) ¹ für alle Proben und ein anderes indiziert (Barcode) Primer 2 (Ad 2.1-2.24) ¹ für jede Probe. Die Primer-Sequenzen werden in der ergänzten Tabelle von Material/Ausrüstung zur Verfügung gestellt.

1. Erste PCR Verstärkung
   Hinweis: die Arbeit Konzentration der Primer 1 (Ad1_noMx) und Primer 2 ist 25 µM. Die Primer werden vom ursprünglichen Bestand von 100 µM bis 25 µM verdünnt. Verwenden Sie in allen PCR-Reaktionen Primer 1 (Ad1_noMx) und nur einer der indizierten Primer 2.
   1. Gemäß Tabelle 2 in ein steriles Röhrchen PCR die Komponenten der PCR-Reaktion Agrega.
   2. Ort-PCR Tubus in einem Thermocycler und PCR-Amplifikation mit dem Radsport in Tabelle 3 aufgeführten Bedingungen erfüllen.
2. Beurteilung der Anzahl der zusätzlichen Verstärkung Zyklen
   Hinweis: die Anzahl der zusätzliche PCR-Zyklen sollten ausreichenden Menge an Bibliothek Fragmente f Ausbeuteoder eine erfolgreiche Sequenzierung der nächsten Generation ausgeführt, während zur Vermeidung von GC und Größe Bias ²⁰ minimiert. Die Bestimmung der Anzahl der PCR-Zyklen (N) erforderlich für optimale Bibliothek Fragment Verstärkung erfolgt durch quantitative PCR (qPCR).
   1. Verdünnen Primer 1 (Ad1_noMx) und 2 (verwendet für die erste Bibliothek Verstärkung) von 25 µM bis 6,25 µM.
   2. Komponenten zu optischen PCR-Röhrchen oder eine Platte hinzufügen, wie in Tabelle 4 angegeben.
   3. In eine qPCR Instrument und Zyklus gemäß Tabelle 5.
   4. Zur Ermittlung der erforderlichen Anzahl von zusätzlichen Verstärkung Zyklen (N) plot Zykluszahl auf der x-Achse und relative Fluoreszenz (RFU) auf der y-Achse.
   5. Die Anzahl der zusätzlichen Verstärkung Zyklen (N) ist 1/3 der Anzahl der Zyklen die qPCR-Reaktion die Hochebene erreichte. Abbildung 2 enthält Beispiele für die drei ATAC-Seq-Bibliotheken, die Plateau ~ 2.350 relative Fluoreszenz Einheiten, RFU (dicke grüne Linie) erreicht. Die Anzahl der PCR-Zyklen, in denen ein Drittel des maximalen Betrages (783 RFU, markiert auf y-Achse) verstärkt, entspricht 8 Zyklen für zwei Bibliotheken (rot und blau Verstärkung Kurven) und 9 PCR-Zyklen für die dritte Bibliothek (rosa).
3. Letzte PCR Verstärkung
   1. verstärken die restlichen 45 µL des PCR-Reaktion. Legen Sie ein PCR-Röhrchen mit Verstärkung Reaktion aus Schritt 4.1.2 in einem Thermocycler. Führen Sie das in Tabelle 6 beschriebenen PCR-Programm aus. Verwenden Sie die zuvor ermittelte (4.2.5) Schrittnummer Verstärkung Zyklen (N).

5. Größe Auswahl der Bibliotheken der ATAC-Seq

Hinweis: nach unserer Erfahrung verbessert die Größenauswahl des verstärkten ATAC-Seq-Bibliotheken Next Generation Sequencing Ergebnisse, da hochmolekularen Bibliothek Fragmente aus beseitigt die abschließende ATAC-Seq Bibliothek.
Hinweis: Lassen Sie die magnetische Beads auf Zimmertemperatur 30 min vor Gebrauch erwärmen.
Bereiten Sie frische 70 % Ethanol in Nuklease-freies Wasser.

1. Aufschwemmen der magnetischen Kügelchen durch das Mischen von.
2. Der ATAC-Seq-Bibliotheken (abgerufen im Schritt 4.3.1.) Nuklease-freies Wasser hinzu und bringen bis zu 100 µL.
3. Fügen Sie 50 µL (0,5 X) der resuspendierte DNA-Bindung magnetische Beads zu 100 µL der verstärkten Bibliotheken. Durch Pipettieren oben und unten mindestens 10 Mal mischen. Inkubieren Sie Beispiele für 5 min bei Raumtemperatur. Bei Bedarf schnell spin-down der Mikroröhrchen.
4. Legen Sie das Rohr auf eine entsprechende Magnetstativ für 2 min der Überstand der magnetischen Kügelchen trennen. Nach 2 min übertragen den Überstand auf eine neue Reaktionscup.
5. Messen Sie das Volumen des Überstands von pipettieren und 0,7 x magnetische Beads hinzufügen. Mix von Pipettieren oben und unten mindestens 10 Mal.
5 min bei Raumtemperatur inkubieren Sie
6. . Auf einem Magnetstativ für 2 min.
7. Nach 2 min Inkubation, verwerfen den überstand. Fügen Sie 200 µL frisch 70 % Ethanol um die Perlen zu waschen, während die Rohre auf die Magnetstativ.
8. Halten die Reaktionscup auf den Magneten für 30 s und dann verwerfen das Ethanol. Wiederholen Sie die Schritt 5.7.for zwei endgültige Ethanol Wäschen.
9. Vollständig entfernen, die restlichen Ethanol und lassen Sie die Perlen für 5 min an der Luft trocknen während der Schlauch auf den Magneten ist. Falls erforderlich, kurz drehen Sie die Reaktionscup. Entfernen Sie die Spuren von Ethanol mit einer Pipettenspitze p10.
10. Die Reaktionscup vom Magneten zu entfernen und fügen Sie 22 µL 10 mM Tris-HCl, pH 8. Nicht die ATAC-Seq-Bibliotheken in Puffer mit EDTA eluieren.
11. Schlauch für 2 min bei Raumtemperatur inkubieren und dann auf die Magnetstativ.
12. Wenn die Lösung klar ist, übertragen 20 µL der eluierten Bibliotheken auf eine neue sterile Reaktionscup.
13. Store die Größe ausgewählt ATAC-Seq Bibliotheken bei-20 ° c

6. Qualitätsanalyse der ATAC-Seq Bibliotheken

1. Überprüfung der Qualität der ATAC-Seq-Bibliotheken von Real-Time PCR
   Hinweis: Es ist wichtig zu beurteilen, das Signal Rauschabstand der ATAC-Seq-Bibliotheken vor der nächsten Generation Sequenzierung. Dies erfolgt durch die Bestimmung der relativen Höhe der DNA-Fragmente aus zugängliche und unzugängliche Loci mittels quantitativen PCR (qPCR). Die unzugänglichen Loci (negative Kontrolle, Chr1:48, 137, 860-48,137,934 und Chr1:193, 093, 748-193,093,827) werden verstärkt durch Grundierung Paare 1 und 2. Die zugänglichen Loci (Positivkontrolle, Chr19:30, 336, 166-30,336,253 und Chr19:11546154-11546237) werden verstärkt durch Primer-Paaren 3 und 4. Positive und negative Loci wurden von Chromatin Zugänglichkeit (DHS-Seq) Profile von menschlichen CD4 + Zellen (ENCODE Beitritte, ENCSR000EQE und ENCSR000EQG) definiert. Negativen Primer 1 befindet sich in einer großen heterochromatischen intergenetischer Region (230 kb, vom TRADB2 und vom FOXD2 88 kb). Negativkontrolle Region 2 befindet sich der ersten Intron des CDC73-Gens. Positiv Primerpaar 3 innerhalb einer offenen Chromatin-Region ist stromabwärts des Gens Cyclin E (CCNE1), während positive Primerpaar 4 innerhalb der Projektträger von Protein-Kinase C Substrat 80K-H (PRKCSH) zentriert. Wichtig ist, zeigen diese Kontrolle Loci ein ähnliches Muster der Barrierefreiheit in anderen menschlichen Zelltypen aus das ENCODE-Projekt ³, was darauf hindeutet, dass sie können, zur Überwachung der ATAC-Seq-Bibliotheken aus einem breiten Spektrum an menschlichen Zelltypen angewendet werden. Primer-Effizienz und Spezifität von alle Primer-Paaren wurde vom qPCR auf eine serielle Verdünnung von genomischer DNA (aus menschlichen Th-Zellen) und einer schmelzenden Kurvenanalyse der erhaltenen amplifizierten Produkte nachgeprüft.
   1. Isolierung genomischen DNA mit einem handelsüblichen kit (siehe Tabelle der Materialien/Geräte).
   2. Verdünnen der verstärkten ATAC-Seq Bibliothek 01:10 (1 µL Bibliothek + 9 µL Nuklease-freies Wasser) und genomischer DNA, ~ 5 ng/µL.
   3. Bereiten Reaktionsgemisch (Tabelle 7) für jede positive und negative Kontrolle Primerpaar, unter Berücksichtigung, dass die Reaktionen in dreifacher Ausführung durchgeführt werden.
   4. Inkubation in qPCR Thermocycler nach dem Protokoll von qPCR master-Mix Lieferanten empfohlen.
   5. Analyse der Ergebnisse in qPCR Instrument ' s Software (siehe Tabelle der Materialien/Geräte). Wählen Sie genomischen DNA als ein Beispiel für ein Steuerelement. Die erhaltenen Werte stellen eine Bereicherung der zugänglichen Regionen (verstärkt durch Positivkontrolle Primer). Ein Beispiel ist in Tabelle 8 dargestellt.
      Hinweis: Schätzung der durchschnittlichen Bibliotheksgröße und Konzentration: die Größenverteilung der DNA-Fragmente von ATAC-Seq Bibliotheken richtet sich nach hoher Empfindlichkeit automatisierte Elektrophorese Systeme laut Hersteller ' Anweisungen. Es ist ratsam, die Probenkonzentration auf einem Fluorometer mit DsDNA hochempfindlichen Kit und mindestens 2 µL jeder DNA-Probe zu messen.
      Hinweis: Next Generation Sequencing - vor multiplexing der Bibliotheken, das Molarity jeder ATAC-Seq-Bibliothek mit der Formel berechnen: (ng/µL X 10 ⁶) / (660 x durchschnittliche Bibliothek fragment Länge). Ziel ist es für > 30 Millionen liest jeder ATAC-Seq-Bibliothek geöffnet Chromatin bewerten Regionen des humanen Proben. Wenn Sie möchten ermitteln, ob die Bibliothek gut genug für die NGS Sequenzierung ist, streben Sie zunächst 10 Millionen Mal gelesen (5 % der Sequenzierung Fahrspur auf DNA-Sequenzierung Instrument im schnellen Modus). Denken Sie daran, dass um Nukleosom Positionierung ableiten, gepaart-End Sequenzierung benötigten ¹.

7. Analyse der erhaltenen Next-Generation Sequenzierung Ergebnisse

1. die Qualität der Sequenzierung lautet durch die Überprüfung der FastQC-Dateien separat für jede Bibliothek ableiten.
2. Ausrichten der Lesezugriffe auf menschlichen Bezug Genom (hg19 Montage) mit Bowtie ²¹ Software in der Unix/Linux-Umgebung. Der Befehl ist ' Fliege -m 1 - Q -S Genom Verzeichnis reads.fastq output_aligned.sam '. Genom-Verzeichnis steht für den Ordner wo die Genom-Indizes der Bowtie gespeichert sind. Die Parameter-m 1 ist für das erlauben nicht die Ausrichtung der Lesezugriffe auf mehr als einem Ort im Genom, - Q ist die Eingabedatei, die im Fastq Format sein sollte, -S ist für die Ausgabe, die im SAM-Format ist.
3. Entfernen Sie doppelte liest mit SAMtools ²² Rmdup-Option in der Unix/Linux-Umfeld. Die Befehle sind ' Samtools anzeigen -S output_aligned.sam -b | SamTools sortieren -o-Output_aligned > output_aligned.bam ',
   Samtools Rmdup -s output_aligned.bam Output_aligned _rmdup.bam '. Der erste Befehl Ansicht ändert das SAM-Format in BAM-Format, die dann sortiert ist. Die Möglichkeit der Rmdup wird dann auf die sortierten BAM-Datei angewendet. Optional kann man die lautet für die Insertionsstelle Transposon einstellen, wie in der ursprünglichen ATAC-Seq Papier ¹ beschrieben. Dies geschieht mittels BEDtools Befehle ²³ im Unix/Linux-Umfeld. Die Befehle sind ' BamToBed -i Output_aligned _rmdup.bam > Output_aligned _rmdup.bed ', ' ShiftBed -i Output_aligned _rmdup.bed -p-4 - m-5 - g-Genom > Output_aligned _rmdup_adjusted.bed '. Der erste Befehl, BamTobed, ändert das BAM-Format ins Bett-Format, welches dann für den ShiftBed-Befehl verwendet werden kann. Die Genom-Datei ist eine Registerkarte durch Trennzeichen getrennte Datei, die die Länge jedes Chromosom im Genom enthält. Die Datei wird in der Regel in das BEDtools Verzeichnis hinzugefügt.
4. Perform Peak Berufung mit modellbasierte Analyse der ChIP-Seq (MACS2) ²⁴-Software in der Unix/Linux-Umgebung auf die verschobene Bett-Datei mit den folgenden Parametern:--Nomodel--Extsize 75---30 zu verlagern. Diese Parameter werden verwendet, um die lautet so einstellen, dass die Einstichstelle Transposon in der Mitte jeder Sequenzierung lesen ist.

Ergebnisse

Das Endergebnis dieses Protokolls ist ein ATAC-Seq-Bibliothek von in der Regel 3-20 ng/µL. Bei der Ausführung auf ein System für die DNA-Integrität-Analyse (siehe Tabelle der Materialien/Geräte), sie zeigen Leiter aussehen² (Abb. 3A). Die durchschnittliche Größe der DNA-Fragmente ist in der Regel ~ 450-530 bp.

Richtige Qualitätskontrolle der ATAC-Seq-...

Diskussion

Das hier beschriebene ATAC-Seq-Protokoll erfolgreich eingesetzte für die Analyse von zugänglich Chromatin in primäre Zellen (menschliche Th1, Th2 Zellen und B-Zellen) sowie die kultivierten Zelllinien (MCF10A menschlichen Brustkrebszellen und U261-Glioblastom-Zellen). Andere Zelltypen ATAC-Seq zuweisen kann einige Protokoll-Optimierung, vor allem in der Lyse Schritt erfordern. Wenn die Konzentration von nichtionischen Waschmittel zu hoch ist, liegt möglicherweise ein höherer Prozentsatz der mitochondrialen DNA-Konta...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL tubes	Lumitron	LUM-CFT011500-P	Can be from other vendors.
Microtubes	Axygen Inc	MCT-175-C	Can be from other vendors.
25 mL serological pipettes	Corning Costar	4489	Can be from other vendors.
Tissue culture flask	Lumitron	LUM-TCF-012-250-P	Can be from other vendors.
Countes Automated Cell Counter	Invitrogen	C10227
NucleoSpin Tissue	MACHEREY-NAGEL	740952.5
Peripheral blood mononuclear cells (PBMC)	ATCC	PCS­800­011	Can be from other vendors.
RPMI 1640 Medium	Biological Industries	01-103-1A	Can be from other vendors.
L-Glutamine Solution (200 mM)	Biological Industries	03-020-1B	Can be from other vendors.
Penicillin-Streptomycin	Biological Industries	03-031-1B	Can be from other vendors.
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated, European Grade	Biological Industries	04-127-1	Can be from other vendors.
MACS CD4 microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-101
MACS MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Anti-Human CD4 FITC	Biogems	06121-50
Mouse IgG1 Isotype Control FITC	Biogems	44212-50
Anti-Human CD3 (OKT3)	Tonbo biosciences	40-0037
Anti-Human CD28 SAFIRE Purified	Biogems	10311-25
Recombinant Human IL2	Peprotech	200-02
Recombinant Human IL4	Peprotech	200-04
Recombinant Human IL12 p70	Peprotech	200-12
In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2)	Tonbo	40-7048
LEAF Purified anti-human IFN-γ	BioLegend	506513
NaCl, analytical grade	Carlo Erba	479687	Can be from other vendors.
Magnesium chloride, Hexahydrate, molecular biology grade	Calbiochem	442611	Can be from other vendors.
EDTA	MP Biomedicals	800682	Can be from other vendors.
Tris, ultra pure, 99.9% pure	MP Biomedicals	819620	Can be from other vendors.
NP-40 alternative (Nonylphenyl Polyethylene Glycol)	Calbiochem	492016	Can be from other vendors.
Protease Inhibitors	Sigma	P2714	this protease inhibitor coctail is a powder. To make 100 x solution dilute in 1 mL of molecular-biology grade water.
Magnetic solid phase reverse immobilization beads: AMPure XP beads	Beckman	63881
PCR purification kit	HyLabs	EX-GP200	Can be from other vendors.
Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase and TD buffer)	Illumina	FC-121-1030
NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix	New England BioLabs	M0541
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix	New England BioLabs	M0543
SYBR Green I	Invitrogen	S7585
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	Bio-rad	185-5200	Can be from other vendors.
CFX Manager Software	Bio-rad	1845000
master mix for qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-rad	172-5124	Can be from other vendors.
Qubit fluorometer 2.0	Invitrogen	Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32854
Magnet for eppendorf tubes	Invitrogen	12321D	Can be from other vendors.
Swing bucket cooling centrifuge with the buckets for 15 mL falcon tubes and eppendorf tubes	Thermo Scientific	75004527	Could be from other vendors. It is important that it has buckets for eppendorf tubes.
Thermo-shaker	MRC		Can be from other vendors.
High Sensitivity D1000 ScreenTape	Agilent Technologies	5067-5584
High Sensitivity D1000 Reagents	Agilent Technologies	5067-5585
4200 TapeStation system	Agilent Technologies	G2991AA	Tape-based platform for  electrophoresis
High Sensitivity DNA kit	Agilent Technologies	5067-4626	Reagent for high-sensitivity TapeStation analysis
Primer name and sequence	Company
Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3'	IDT		Ad1-noMx: 5'-P5 sequence-transposase sequence-3'
Ad2.1_TAAGGCGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.1_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.2_CGTACTAG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.2_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'	IDT		Ad2.3_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
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